Abstract
Fagociti giocano un ruolo importante nel sistema immunitario innato rimuovendo ed eliminando microrganismi invasori nelle loro fagosomi. Phagosome maturazione è un processo complesso e strettamente regolata durante la quale un phagosome nascente subisce drastica trasformazione attraverso le interazioni ben orchestrate, con vari organuli cellulari e scomparti nel citoplasma. Questo processo, che è essenziale per la funzione fisiologica di fagociti dotando phagosomes con le loro proprietà litici e battericide, culmina nella fusione di phagosomes con i lisosomi e biogenesi dei phagolysosomes che è considerato come l'ultimo e fondamentale fase di maturazione per phagosomes. In questo rapporto, descriviamo un metodo basato imaging cellulare dal vivo per l'analisi qualitativa e quantitativa del processo dinamico di lisosomi per phagosome fornitura di contenuti, che è una caratteristica di fagolisosoma biogenesi. Questo approccio utilizza microsfere IgG rivestite come modello per phagocytosis e molecole di destrano fluoroforo coniugato come sonda carico lisosomiale luminale, per seguire la consegna di contenuto dinamico lysosmal ai fagosomi in tempo reale in macrofagi vivi usando time-lapse imaging e microscopia confocale. Qui si descrive nel dettaglio sullo sfondo, le fasi di preparazione e la configurazione step-by-step sperimentale per consentire la distribuzione facile e precisa di questo metodo in altri laboratori. Il nostro metodo descritto è semplice, robusta e, soprattutto, può essere facilmente adattato per studiare le interazioni phagosomal e maturazione in sistemi diversi e in varie impostazioni sperimentali, come l'uso di vari tipi di fagociti, la perdita di funzione esperimenti, diverse sonde, e particelle fagociti.
Introduction
Fagociti professionali, tra macrofagi, svolgono un fondamentale nel sistema immunitario. Oltre ad essere la prima linea di difesa del sistema immunitario innato, ma anche svolgere un ruolo critico nella attivazione della immunità adattativa attraverso la loro segnalazione e presentanti l'antigene ruolo 1-3. Mentre la funzione dei fagociti professionali è multiforme, phagosome maturazione è la spina dorsale critico della funzione di elaborazione battericida ed antigene dei fagociti professionali 4,5. Su engulfment recettore mediata e l'assorbimento di un bersaglio fagocitaria, come batteri, phagosome nascente passa attraverso una sequenza complessa ed armonico di interazione e scambi con compartimenti della rete endocitosi e diversi altri organelli cellulari 6. La natura dei composti scambiate con queste entità cellulari, nonché il regolamento e la tempistica degli eventi di fusione determina il phagosomal milieu luminale e le phagoscomposizione OMAL membrana e, quindi 7, il destino del phagosome maturazione 8.
La rilevanza fisiologica di phagosome maturazione è esemplificata dalle diverse strategie utilizzate dai vari agenti patogeni intracellulari di sfuggire, arresto o sovvertire phagosome maturazione 9. La maggior parte di queste strategie impediscono direttamente o indirettamente, la fase finale e critica del processo di maturazione phagosome: la fusione di phagosome con scomparti fine endosomal / lisosomiali, che conferisce loro la maggior parte degli enzimi idrolitici e fattori anti-batterici di un phagosome maturo 7 , 8,10. Analisi di questo passaggio finale e critico quindi ci può fornire con forti indicatori sullo stato di maturazione dei fagosomi e se lo stato fisiologico è essere positivamente o negativamente colpito sotto le impostazioni sperimentali particolari che vengono utilizzati.
Il vano tardi endosomal / lisosomiales sono generalmente considerati essere i compartimenti terminali della via endocitosi, definiti e distinti dai primi compartimenti endocitici dalla presenza di vari, determinata fase, molecole marcatori. Per esempio enzimi idrolitici o componenti di membrana quali le proteine di membrana lisosomiale associata (lampade) tra gli altri 11. Il terminale endocitica compartimenti-d'ora in poi indicato semplicemente come lisosomi-servono anche come location principale per le fasi finali della digestione, alla fine della fagocitosi / endocytic percorso 12. In questo modo, non digeribili sonde possono essere caricati tramite endocitosi e macropinocitosi dall'ambiente extracellulare e trasportati attraverso la via endocytic ai lisosomi, dove si accumula 13,14 dopo aver seguito un determinato ciclo di assorbimento e inseguimento. Sonde fluoroforo coniugato per la microscopia a fluorescenza come il destrano polimero organico nondigestible sono comunemente usati come endocyticprobes 15-17.
14,18.
Dopo la descrizione del nostro metodo, esperimenti analoghi possono essere progettati utilizzando le impostazioni modificate e fattori di indagare la loro influenza sulla phagosome maturazione; qualsiasi otil suo tipo di fagociti primarie o linee cellulari aderenti, la perdita genetica degli esperimenti funzionali, tra cui gene knock-out e knock-down, mutanti o espressione delle proteine di fusione, fagocitosi-obiettivi, composti di rivestimento microbead, sonde endosomal / lisosomiali e fattori quali una citochine, inibitori chimici o siRNA tra gli altri sono tutte variabili che possono essere applicate per l'approccio di base di questo metodo.
Definiamo l'obiettivo e requisiti di base di questo metodo come segue:
- Obiettivo del metodo: per consentire l'osservazione diretta, quantitativa e qualitativa e l'analisi di phagosome maturazione con alta risoluzione temporale nel vivere fagociti.
- Carico dei fagociti: Un microparticelle opportunamente rivestiti o bersaglio biologico. Qui usiamo IgG-rivestito 3 micron microparticelle sferiche di polistirolo che sono prontamente interiorizzati attraverso il recettore Fc-γ fagocitosi mediata. In alternativa, qualsiasi microrganismo o un microfono patinataroparticle per i quali è presente un recettore fagocitica delle cellule può essere utilizzato.
- Fagociti: fagociti aderenti esprimono gli appropriati recettori fagociti. Qui usiamo il mouse BMMs primari abbondantemente esprimono i recettori Fc-γ. In alternativa, potrebbero essere utilizzati cellule dendritiche (DC), monociti o cellule epiteliali fagocitarie o loro mutanti o varianti genetiche knock-out.
- Lisosomiali cargo: Una sonda lisosomiale fluorescente. Qui, Texas Red-coniugato 70.000 kDa destrano (Dex70kD) è usato come il carico luminale dei lisosomi. In alternativa, qualsiasi marcatore fluorescente rilevabile di un compartimento cellulare o organello, o una sonda appropriata per le proprietà phagosomal come acidità o degradativa capacità, potrebbe essere utilizzata per studiare la progressione della phagosome maturazione.
- Fattori che influenzano: Ad esempio, molecole di segnalazione, composti chimici, gene knock-down, o espressione transiente di proteine mutanti potrebbe. Qui, abbiamo Förguno l'uso di tale fattore per semplicità, ma per un esempio recente con l'espressione della proteina mutante e di knock-down fattori che influenzano Si prega di vedere Kasmapour et al. 18 Qualsiasi fattore che può influenzare la fagocitosi o le circostanze e la mobilità dei phagosomes e / o compartimenti che interagiscono con phagosomes scadenza potrebbero essere utilizzati.
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Protocol
Cura degli animali e di tutte le procedure in questo protocollo seguono le linee guida istituzionali e nazionali.
Preparare i preparativi che sono indicati da "Π-" in anticipo.
1. Preparazione di BMMs
- Eseguire l'abbattimento dei topi da dislocazione cervicale.
- Rimuovere femore e tibia ossa, ossa liberi dal tessuto e tagliare le due estremità per l'accessibilità del midollo osseo.
- Mantenere ossa in PBS freddo o medio DMEM ghiacciata (integrato con 100 U / ml di penicillina e 100 pg / ml streptomicina, su ghiaccio fino alla fase successiva.
Nota: Eseguire i seguenti passi sotto un armadio biosicurezza di classe II per ridurre al minimo il rischio di contaminazione. - Lavare la cavità midollare con PBS freddo + penicillina / streptomicina utilizzando un 26 g (0,45 mm) ago attaccato ad una siringa da 1 ml.
- Cellule pellet per gentile centrifugazione a 350 xg per 10 min, risospendere il pellet in med BMMIUM e piatto in microbiologia sterile noncoated piastre di Petri.
- Preparazione del mezzo BMM
- Modified Eagles medio DMEM Dulbecco
- 10% FCS inattivato
- 20% di fibroblasti di topo linea cellulare L929 cultura surnatante (fonte di macrofagi fattore stimolante le colonie, M-CSF)
- Siero di cavallo al 5%
- 2 mM glutammina
- Preparazione della linea cellulare L929 mezzo di coltura;
- RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640
- 10% FCS inattivato
- 2 mM glutammina
- Preparazione di fibroblasti di topo L929 linea cellulare supernatante di coltura;
- Cellule confluenti L929 sono stati suddivisi 1:4, colta nel 175 cm 2 palloni per 2 giorni utilizzando 20 ml L929 medio e il supernatante di coltura è stato raccolto dopo 48 ore, filtrati e aggiunti al BMM medio
- Preparazione del mezzo BMM
- Incubare le cellule arrossate dalfemore in un incubatore a 37 ° C in 5% CO 2 nell'atmosfera.
- Dopo ogni 48 ore (massimo 72 ore) di incubazione, aspirare il terreno e sostituirlo con fresco mezzo BMM, per un massimo di 10 giorni. Oltre il 95% delle cellule erano positive per CD14 come testato mediante citometria a flusso. CD14 è un recettore pattern recognition espressa principalmente dai macrofagi. Determinando la percentuale di cellule positive per questo recettore, è stata generata una coltura pura di BMMs aderenti.
Nota: preparare e coltivare le cellule di conseguenza se si utilizzano altri tipi di cellule.
2. Rivestimento di Microbeads come fagocitaria Cargo
- Per la preparazione di 1 ml di sospensione tallone, utilizzare 400 ml di 2,5% 3 micron microparticelle di polistirene carbossilati, o microparticelle alternativi.
- Trasferire la sospensione di sferette in una provetta da 1,5 ml, lavare 3x con PBS e aggiungere 100 ml di 500 mM 2 - (N-morpholino) etanisale sodico ulfonic, tampone MES a pH 6,7 al pellet tallone.
- Sciogliere 50 mg IgG di topo (anticorpo policlonale IgG) in 50 microlitri sterile DDH 2 O e aggiungere alla sospensione di sferette.
- Riempire la sospensione fino a 1 ml di DDH 2 O sterile (450 ml).
- Incubare la soluzione per 15 min su una ruota girevole a RT.
- Preparare EDAC cross-linker, N-(3-dimetilamminopropil) cloridrato-N'-etilcarbodiimmide in una concentrazione di 10 mg / ml e aggiungere 14 microlitri di sferette.
Nota: EDAC legami incrociati ammino gruppi della IgG con i gruppi carbossilici sulla superficie delle perle e facilita l'immobilizzazione della IgG sulla superficie delle sfere. Questo è fondamentale per tallone assorbimento e quindi la soluzione deve essere preparata al momento. - Incubare la sospensione su una ruota girevole per 1 ora a RT.
- Aggiungere 14 ml di EDAC cross-linker e incubare la sospensione su una ruota girevole per 1 ora a RT.
- Centrifugare la sospensione a 10.000 xg per 2 minuti in una microcentrifuga.
- Lavare le perline 3x in tampone di arresto (1% Triton X-100 in Tris 10 mM, pH 9,4) per fermare la reazione di reticolazione, per risospendere il pellet in tampone di arresto e la filatura della soluzione a 10,000 xg per 2 min.
- Lavare perle 3x in PBS e risospendere il pellet in 1 ml di PBS.
Optional: Preparare aliquote di lavoro di 30-50 ml. - Conservare la sospensione di sferette IgG-rivestito a 4 ° C per non più di 4 settimane e non lasciare la sospensione da congelare.
Nota: Un conservante quale azide di sodio ad una concentrazione finale di 0,02% (w / v) possono essere aggiunti alla sospensione per prevenire la crescita batterica e la contaminazione. In questo caso il lavaggio delle microsfere prima del suo utilizzo deve essere eseguito per evitare effetti citotossici del conservante. Centrifugare un'aliquota della sospensione a 10.000 xg per 2 minuti e lavare i beads di resospende il pellet in PBS. Ripetere il lavaggio 3x.
3. Preparazione del Dextran sonda Stock Solution
- Sciogliere il Texas Red 70.000 kilodalton Dextran (Dex70kD) in PBS a 20 mg / ml e conservare a -20 ° C, secondo le istruzioni del produttore.
Nota: Conservare le scorte a -20 ° C fino a diversi mesi, o a 4 ° C per alcune settimane, vedere la documentazione del produttore. - Preparare la soluzione di destrano per l'esperimento dallo stock diluendolo in mezzo completo di coltura cellulare DMEM (DMEM, 10% FCS, 2 mM L-glutammina) a circa 1 mg / ml (molteplice soluzione concentrata che verrà diluito alla concentrazione finale di lavoro di 20 mcg / ml prima dell'aggiunta alle cellule).
- Utilizzare una ecografia bagnomaria per sonicare parte aliquota destrano per 5 minuti per omogeneizzare la soluzione e sciogliere aggregati che potrebbero poi portare alla generazione di artefatti durante l'imaging.
- Centrifugare a massimo gper 5 min in una microcentrifuga per rimuovere eventuali grumi non disciolti o contaminanti dalla soluzione.
- Spostare con cautela il surnatante in una nuova provetta evitando il pellet sul fondo della provetta e diluire la soluzione alla concentrazione di lavoro finale di 20 pg / ml in mezzo completo di coltura cellulare DMEM.
- Filtro sterile la soluzione con un filtro montato 0,2 micron siringa.
4. Dextran precaricamento
- Cellule seme in un imaging cellulare piatto fondo di vetro dal vivo e incubare per almeno 12 ore (a 37 ° C in 5% di CO 2 nell'atmosfera) al fine di garantire l'attaccamento e acclimatazione.
Nota: Ci sono piatti fondo di vetro segmentato disponibili che consentono di eseguire più esperimenti (fino a quattro compartimenti) per ogni piatto. - Preparare la destrano in soluzione DMEM come descritto nel protocollo 3. Riscaldare il destrano preparato in soluzione DMEM, utilizzando un bagno di acqua a 37 ° C.
- Aspirare il terreno di unnd aggiungere la soluzione di destrano alle cellule attentamente e incubare a 37 ° C in 5% CO 2 ambiente per 2-8 ore per l'assorbimento.
Nota: Piano e ottimizzare il protocollo basato sul tipo di sonda e cella che viene utilizzato e rigorosamente rispettare tale durata quando ripetendo esperimenti. Ciò è essenziale per il profilo di accumulo destrano nella via endocitosi e quindi riproducibilità degli esperimenti. - Lavare le cellule 3x con preriscaldata mezzo completo DMEM, medie aspirare e lavare le cellule accuratamente con terreno fresco.
- Incubare le cellule con mezzo DMEM completo per 4-12 ore a 37 ° C in 5% CO 2 nell'atmosfera.
- Lavare le cellule una volta con mezzo completo DMEM privo di rosso fenolo filtrato preriscaldata.
- Per ottenere risultati ottimali di imaging, modifica preriscaldata completa fenolo filtrata DMEM senza rosso medium almeno 30 min prima dell'inizio della rappresentazione. Rosso fenolo può causare spegnimento dei segnali fluorescenti, aumentando il rumore di fondo equindi ridurre il contrasto e la nitidezza delle immagini.
Nota: Impostare il microscopio e le impostazioni di imaging di anticipo, secondo il protocollo preplanned e ottimizzata in base al tipo di sonda e le cellule che vengono utilizzati.
5. Aggiunta Beads IgG rivestite
- Equilibrare una aliquota di preprepared 1% sospensione di sferette di RT e sonicare in un bagno d'acqua ad ultrasuoni per 2-3 min.
- Aggiungere 1-6 ml di sferette 1% per il terreno completo filtrata fenolo-rosso DMEM privo sotto un armadio biosicurezza classe II per minimizzare il rischio di contaminazione (una buona concentrazione iniziale è di 1 ml / 2 cm 2 di superficie piatto).
Nota: Qui BMMs sono state seminate in 25.000 cellule / pozzetto e un 6 ml di 1% di sospensione di magazzino tallone è stato aggiunto al mezzo nel piatto. Ciò equivale a circa un rapporto perla / cella 15:01. Il rapporto deve essere adattata al tipo di cellule che viene utilizzato e al materiale tallone; i.e. perle di lattice hanno una bassa densità e non si depositano sul fondo rapidamente, mentre perle di polistirene affondano e vengono a contatto con le cellule aderenti molto più veloce e quindi in numero maggiore.
Nota: A seconda dell'esperimento, può essere vantaggioso per selezionare la regione che verrà osservato in anticipo. Sospensione tallone può essere aggiunto solo a quella regione specifica del piatto fondo di vetro, aumentando quindi la probabilità di osservare eventi assorbimento favorevoli. - La nube densa di perline può essere diffuso pipettando delicatamente la sospensione nel piatto fondo di vetro.
- Attendere fino perline depositano sul fondo del piatto fondo di vetro e sono approssimativamente nello stesso piano con i fagociti aderenti.
- Focus sulla regione di interesse (ROI) e avviare il time-lapse imaging.
Nota: Può essere necessario ottimizzare la messa a fuoco delle immagini è in corso, a seconda del sistema di imaging che viene utilizzato, la sua stazionebilità e la mobilità delle cellule osservate. Si noti tuttavia che ciò può rendere impossibile, la corretta analisi dei fagosomi che si discostano fortemente dal piano di messa a fuoco come risultato di rifocalizzazione.
6. Imaging
Seguire le istruzioni riportate di seguito per una qualità ottimale delle immagini;
- Utilizzare un sistema di imaging confocale come un sistema laser-scansione o rotazione del disco.
Nota: Una Leica TCS SP5 AOBS Laser microscopio confocale a scansione controllata dal software Leica LAS AF e dotato di una camera di controllo ambientale è stato utilizzato qui per immagini video time-lapse. - Ottimizzare le impostazioni di imaging come la velocità di scansione, ingrandimento, risoluzione, ecc. in modo da consentire una velocità di un frame in ogni 7-20 secondi, a seconda del sistema utilizzato.
Nota: Qui, una velocità di scansione di 200 Hz, con zoom 2x scanner e una media di linea 2-3x con una risoluzione di 512 x 512 pixel resulted in un tempo di registrazione tra 3-5 sec / rame. Una frequenza di un telaio in ogni 10 sec è stato usato per registrare i filmati time-lapse con una durata di almeno 120 min. - Utilizzare appropriate impostazioni di eccitazione / emissione basati sul sistema utilizzato per immagini e sonda (s).
- Ottimizzare le impostazioni per evitare un eccessivo fotometabolismo.
Nota: Qui, il Texas Red Dextran 70kD era eccitato utilizzando un DPSS (561 nm) del laser e l'emissione di luce è stato rilevato da un rilevatore ibrido Leica (HYD) a 600-650 nm con il picco di emissione a 610 nm. Intensità del laser deve essere adattato per l'intensità del segnale e mantenuto il più basso possibile per minimizzare fotometabolismo del fluoroforo (s) e foto effetto tossicità della luce laser sulle cellule. In generale, è importante bilanciare la velocità di scansione, linea media, risoluzione di scansione, intervallo fotogrammi e la durata della rappresentazione avere adeguata e stabile l'intensità del segnale e catturare tutta la durata del branello assorbimento e phagosome maturazione process.
- Ottimizzare le impostazioni per evitare un eccessivo fotometabolismo.
- Includere un campo chiaro (BF) canale di osservazione dei branelli se non sono coniugati con un fluorocromo.
Nota: Accanto canale Rosso Texas, canale BF è stato usato per la visualizzazione delle sfere, lo stesso laser DPSS è stato utilizzato come sorgente di luce e il segnale è stato rilevato con un fotomoltiplicatore (PMT) rivelatore.
Nota: Assicurarsi di applicare le impostazioni di registrazione identici quando l'acquisizione di dati che devono essere raccolti. Parametri più importanti sono: intensità del laser di eccitazione, l'impostazione del rivelatore, le impostazioni di acquisizione, l'ingrandimento e gli intervalli di frame. Non usando intervalli di frame identici richiederà una fase di curva-media, come i punti di dati di osservazione non si sovrappongono (ad esempio per raccogliere una osservazione con fotogrammi acquisiti ad ogni 7 secondi con un altro set con cornici ad ogni 12 sec). Ciò aumenterebbe i passi necessari per la valutazione dei dati e richiedono software aggiuntivo con funzione di curva-media, come OriginLab 's Origin software statistiche Pro ( http://www.originlab.com/ ). - Preferibilmente, salvare il time-lapse video in file formato nativo del sistema di imaging utilizzata e di evitare l'esportazione in formati compressi.
Nota: Qui, filmati time-lapse sono stati salvati nel formato Leica LAS AF nativo i file, che sono stati poi importati direttamente da aprire in Fiji (LIF.). Fiji è in grado di leggere i formati di file nativi dalla maggior parte dei produttori microscopio utilizzando la dotazione Bio formati importatore plug-in. Esportare il file del filmato time-lapse in una serie di immagini con JPG o TIFF o come file video in un formato contenitore AVI non è necessario o consigliato. Oltre a preservare la migliore qualità possibile dell'immagine dall'osservazione originale evitando algoritmi di compressione lossy (ad esempio JPEG), utilizzando il formato di file nativo microscopio assicura che i meta-dati del file (timestamp, ingrandimento, laser e acquisizione intensità, Impostazioni del rivelatore, ecc) vengono conservati e disponibili a Fiji. Tuttavia, se per qualsiasi motivo, i file video time-lapse devono essere esportati in un formato diverso per l'analisi, assicurarsi di utilizzare formati di file compressi come la serie di immagini TIFF e colore RGB separati (rosso, verde, blu) i canali già in questa step, come Fiji spesso non possono separare con successo il canale BF da altri canali di colore nei file esportati. Inoltre, assicurarsi di conservare i file originali microscopio come riferimento.
7. L'analisi dei filmati time-lapse
- Utilizzare ImageJ, Fiji o qualsiasi altro software che fornisce una capacità di analisi di associazione segnale analoghi.
Nota: Qui, Fiji è stato utilizzato per l'analisi di filmati time-lapse. Fiji è una distribuzione ImageJ contenente un pacchetto di elaborazione delle immagini con i menu degli strumenti riorganizzati e plug-in nativi, disponibile per il download gratuito a http://fiji.sc . Il processo descritto in questa settaione è illustrato nella Figura 2. - Aprire il file in Fiji facendo clic su "File", "Apri" e scegliendo il file, o trascinando il file Fiji.
- Scegliere le seguenti opzioni;
- Stack di visualizzazione: Visualizza pila con HyperStack,
- Opzioni di colore: Modo colore colorato,
- Canali suddivisi in finestre separate: canali Split (per ogni colore RGB-channel che è stata registrata saranno aperte una finestra separata).
- Nel caso in cui una serie di immagini deve essere usato, caricare la serie di Fiji andando su "File", "Importa", "Sequenza d'immagini" e scegliere un file immagine nella cartella che contiene la serie immagine di destinazione.
- Impostare i filtri e le condizioni per il caricamento immagini selezionate nella serie, ad esempio;
- Numero di immagini: quanti fotogrammi devono essere caricati.
- Partendo immagine: quale immagine è il fotogramma iniziale della serie.
- Incrementa: l'incremento trafotogrammi da caricare (ogni fotogramma, ogni secondo fotogramma, ecc.).
- Il nome del file contiene: filtraggio per il canale specifico utilizzando il nome del file (ad esempio impostando "c001", che è come normalmente le immagini da "Channel 1" sono etichettati dopo il colore separazione di un video time-lapse multicanale).
- Impostare i filtri e le condizioni per il caricamento immagini selezionate nella serie, ad esempio;
- Rimuovere scala andando su "Analizza", "Imposta scala ...", selezionando la casella "Global" e cliccando su "Clicca per rimuovere incrostazioni".
Nota: Questo passo permette l'analisi basata sui pixel delle immagini in caso di ingrandimenti diversi sono stati utilizzati per i vari set sperimentali che devono essere valutati. Se le impostazioni di ingrandimento sono stati sempre mantenuto costante e il file microscopio nativo è stato direttamente importato in Fiji, questo passaggio può essere saltato, come Fiji in grado di comprendere e utilizzare i dati di ingrandimento e di scala di metadati del file microscopio. - Impostare parametro di misuras andando su "Analizza", "Set Misure" e selezionando le seguenti caselle: "Area", "deviazione standard", "densità Integrata", "label Visualizzazione" e "Mean valore di grigio".
- Reindirizzare al canale colori che contiene il segnale dalla sonda che deve essere misurato e confermare con "OK".
- Va al frame in cui le misure sono da avviare e selezionare la finestra canale BF cliccando sul bordo superiore della finestra.
- Utilizzare lo "strumento di selezione ovale" per selezionare la regione di interesse (ROI), cioè un ROI circolare sul tallone interiorizzato. Assicurarsi che la selezione è montato saldamente al bordo esterno del tallone come visibile nel canale BF.
Nota: Quando si utilizza un PC, tenere premuto il tasto Shift mentre si utilizza lo strumento di selezione per garantire un ROI circolare. - Avviare la misura ottimale di alcuni fotogrammi prima della piena fagocitazione del cordone viene completata e notare lacornice in cui si forma una nascente branello-phagosome completamente formato e la coppa fagocitica è chiusa. Questo dovrebbe essere relativamente chiaramente distinguibile nel canale BF.
- Vai su "Analizza" e cliccare su "Misura" per eseguire la misura, il risultato verrà visualizzato in una finestra separata dal titolo "Risultati".
- Va al frame successivo, regolare la posizione della ROI nel caso che il tallone è mosso, e ripetere la misurazione. Il risultato verrà aggiunto alla lista nella finestra dei risultati; ogni fotogramma analizzato può essere identificato in base al valore nella colonna "Label".
Nota: Utilizzo dei tasti di scelta rapida (ad esempio, "M" per la misura) può significativamente accelerare il processo di valutazione; vedere l'elenco di scorciatoie e assegnare quelli costume sotto il menu "Plugins". - Dopo aver completato la misurazione di tutti i fotogrammi rilevanti, i risultati possono essere copiati su un foglio di calcolo come MS Excel. La colonna "IntDen" raffigura la intensities della regione selezionata nel canale che la misurazione è stata reindirizzato.
8. Correzione Sbiancamento
A seconda della sonda utilizzata e impostazioni di imaging, può verificarsi fotometabolismo. A seconda della sua portata, questo potrebbe influenzare fortemente il risultato della valutazione. Tuttavia, questo effetto può essere parzialmente corretto applicando un tasso uguale ma opposta di modifica dei valori misurati. Se presente, il coefficiente fotometabolismo può essere calcolato misurando la diminuzione dipendente dal tempo dell'intensità di segnale in tutto il telaio, o area specificamente ritagliata del telaio, durante il lasso di tempo rilevante per l'analisi di ogni phagosome. Questo processo è illustrato nelle figure 3 e 4.
- Sotto il menu "Plugins" di Fiji, utilizzare la funzione "Time Series Analyzer" plug-in per determinare il calo generale in tutto il fotogramma, o ROI specifica intensità di segnale della sonda nel tempo (Figura 3).
Nota: Time Series Analyzer plug-in è disponibile per il download all'indirizzo http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html , nel caso non sia già presente nel menu Plugins. - Tracciare la misura contro il tempo (in secondi) in MS Excel, solo per i frame che corrispondono ai fotogrammi di un phagosome analizzato.
- Applicare una linea di tendenza lineare (Figura 4A) del terreno; una pendenza negativa per il segnale discendente indica la presenza di effetto fotoindotto.
- Applicare la pendenza invertita di valori da una phagosome analizzati (figure 4B e 4C): intensità del segnale rettificato (SI) = raw SI + (tempo in secondi * retromarcia pendenza)
Nota: ogni singolo phagosome analizzato avrà un determinato lasso di tempo (a partire da cornice assorbimento completo) durante un filmato time-lapse registrato, la foto-bleacHing deve essere ricalcolato per quel lasso specifico e sarà valida solo per correggere i valori misurati da quella specifica phagosome.
9. Valutazione dei dati
- Collazionare i dati e calcolare l'errore medio e statistica dei valori sbiancanti corretta nel software appropriato.
- Tracciare i dati valutati in forma adeguata.
Nota: Qui, le statistiche scientifiche e tramando software GraphPad Prism ( http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ) è stato utilizzato. Software Prism è in grado di generare e tracciare una curva media con gli indicatori di errore corrispondenti finché tutti i dati hanno la stessa frequenza di quadro (cioè tutti sono stati acquisiti con agli stessi intervalli, come un frame ogni 10 sec).
Nota: Ampie variazioni dei valori assoluti SI all'interno ripetizioni della stessa sperimset ent introdurrà molto grande errore statistico e rendere i dati inutilizzabili. Questo può essere il caso se il protocollo, ad esempio le impostazioni di imaging, non sono tenuti rigorosamente identici tra le diverse ripetizioni degli esperimenti che devono essere raccolti.
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Representative Results
La corretta preparazione delle cellule e le perline per l'imaging è critica. Figura 1 mostra il profilo della semina, sonda-loading e gradini di imaging iniziale, in questo metodo, basato sulla nostra protocollo ottimizzato per BMMs. È pertanto indispensabile che i parametri di protocollo testati e ottimizzati a seconda del tipo di cellule e sonde che devono essere utilizzati.
Dopo l'aggiunta delle perline rivestite con IgG verso le cellule precaricati, è importante che il campo visivo è scelto in modo da fornire il maggior numero di potenziali eventi assorbimento nel maggior numero di cellule possibili, pur mantenendo l'impostazione predefinita ingrandimento del protocollo. Come illustrato nella figura 2, questo approccio può prevedere un numero maggiore di fagosomi analizzabili in ogni time-lapse video. Oltre ad aumentare i punti di dati per il video rendimento di ogni set esperimento, ciò riduce la variazione apportata variando periphecondizioni ral e aumenta la solidità dei dati.
Si raccomanda che la procedura di misurazione segnale-associazione (Figura 2) effettuata dalla stessa persona e in cieco, se possibile. Questo potrebbe contribuire a ridurre l'errore eliminando fonti multiple personale di errori e ridurre il bias, come il ROI assegnato a ciascuna phagosome deve essere selezionato e spostato manualmente dopo ogni fotogramma.
Mentre naturalmente la regola di "maggiore è la dimensione del campione, la migliore" vale anche qui, si evita valutare più di 5 branello-phagosome per cella nel campo di vista per evitare che dà troppo peso a una singola cella come il comportamento di tutti cellule all'interno della stessa cultura non è necessariamente omogenea 19. Questi phagosomes dovrebbero essere selezionati in modo casuale, per quanto possibile. In questo contesto, parametri quali phagosomes essere completamente visibile nel piano focale per l'intera durata di imaging e pur non essendoaffetti da eccessiva foto sbiancamento sono essenziali. Inoltre, uptaking un gran numero di particelle di grandi dimensioni da una singola cellula può influenzare le dinamiche di fusione per le phagosomes in quella cella, quindi la priorità dovrebbe essere data alle phagosomes che sono uptaken in precedenza nel processo da una "cella vuota" relativamente. Come regola generale, le misurazioni, in media di almeno cinque celle da un massimo di cinque esperimenti indipendenti (quindi, fino a 25 phagosomes) dovrebbero fornire una buona significatività statistica.
L'applicazione di Time Series Analysis o un metodo analogo per rilevare un possibile effetto fotometabolismo (Figura 3) è molto importante, in quanto alcuni sonde soffrono di forte sbianca mentre alcuni sono molto fotostabili. La correzione fotometabolismo fase (figura 4) deve essere applicato solo se un forte effetto sbiancante si osserva in tutti gli esperimenti con la stessa sonda. Va notato che questo processo può solo parzialmente correttal'effetto di sbianca. Importante, eccessivo sbiancamento solo in alcuni casi può essere un segno di condizioni non ottimali, come ad esempio l'eccitazione errato o impostazioni di imaging, medio sbagliato pH, cellule malsane, o reagenti non fresca.
In Figura 5C, il tallone-phagosome indicato con una freccia nella Figura 5A e in Figura 5B, viene analizzato e l'intensità del segnale Dex70kD (SI) associazione di maturazione phagosome durante un arco di 90 min è tracciata. La fonte di rumore in curva è il frame a frame variazioni del segnale misurato a causa di fattori quali ostruzione del phagosome analizzato da altre fluttuazioni phagosome e piano focale. Tuttavia, l'andamento temporale del segnale associazione al phagosome è immediatamente chiaro. Dopo l'analisi media da 10 phagosomes dalle due celle visibili in Figura 5A, una curva media può essere tracciata (Figura 5D) per il quale l'indirizzo statisticorror possono essere rappresentate graficamente come l'errore standard della media (SEM) o la deviazione standard (SD) a seconda della dimensione del campione e condizioni sperimentali. Mentre i valori assoluti SI della curva media è generalmente diversa da quella di qualsiasi singolo phagosome analizzato, l'andamento temporale è normalmente molto simile. Dopo l'analisi, si può concludere che la consegna di Dex70kD come lisosomiale luminale carico da bordare-phagosomes Tipo di BMMs selvatici raggiunto un plateau entro 35-40 minuti dopo la fagocitosi.
Questo metodo può quindi essere utilizzato per studiare l'effetto qualitativa o quantitativa di vari fattori sul processo di maturazione phagosome.
Figura 1. Preparazione delle cellule per l'imaging. Preprepared BMMs vengono seminate in un fondo piatto di vetro di almeno 12 ore prima dell'aggiuntadi destrano, soluzione di destrano in mezzo viene aggiunto a una concentrazione di 20 ug / ml e incubate per 2-8 ore (carico), le cellule sono lavate, viene aggiunto mezzo fresco e cellule sono incubate per almeno 4 ore (chase), le cellule sono lavati di nuovo e sospensione di sferette viene aggiunto solo prima dell'inizio della rappresentazione. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 2. Passo per passo le istruzioni per l'analisi delle immagini. Dopo aver caricato il video time-lapse o sequenza di immagini in diversi canali in Fiji, la valutazione segue questi passaggi (Si noti che la figura rappresenta un collage di immagini e non tutte le finestre mostrati qui rimarrà aperto simultaneamente ). (A) In "Analizza" del menu, pixel perscala del percorso viene azzerato nel caso in cui i metadati delle immagini non sono disponibili per Fiji, diversi ingrandimenti sono stati utilizzati in precedenza Fiji o le registrazioni time-lapse sono a diversi ingrandimenti, andando a (b) "Set Scale", ( c) barrando la casella "globale" che si applica l'azzeramento di tutte le serie di immagini successivamente caricato e cliccando su "Clicca per rimuovere Scale". (D) Accertarsi che sia il campo chiaro (BF) Serie immagine del canale (dove tallone-phagosomes sono chiaramente visibili) e il canale contenente segnale della sonda vengono caricati e hanno le stesse identiche frame-conteggi e dimensioni in pixel, ad es. due serie di ogni 400 telai con 450 x 450 dimensioni in pixel. (E) Sotto il menu "Analizza", parametri di valutazione possono essere impostati in "Set Misure", dove "Area", "densità integrata" e parametri "etichetta di visualizzazione" devono essere selezionati. (F (G) Ciò assicura la misurazione dell'intensità rosso canali nella stessa regione di interesse (ROI) che è indicata dalla linea tratteggiata e la freccia bianca in rosso-canale. Il ROI circolare viene selezionato nel canale BF utilizzando lo strumento di selezione "Oval". (H) Avviare la misurazione in "Analizza", "Misura" o utilizzando il comando di scelta rapida, e ripetere per ogni fotogramma di tutta la serie per la durata desiderata della sperimentazione (ad esempio 90 min). In ogni fotogramma, spostare e regolare la posizione ROI al tallone-phagosome dell'interesse e notare che andare al fotogramma successivo nella serie BF e dando il comando "Misura" automaticamente misura il ROI nel quadro corrispondente del red-canale. (i) I risultati di misuraapparirà come un elenco nella finestra "Risultati". Sotto la colonna "Label", il fotogramma esatto per ogni linea è chiaramente identificato, utilizzare questo per verificare la ripetuta la misura di un singolo fotogramma o ignorati fotogrammi serie di immagini lungo. (J) Il "IntDen" abbreviazione di densità integrato è il parametro di uscita critico; copiare almeno l'etichetta ed i valori "IntDen" per un foglio MS Excel per continuare con la valutazione. L'unità di valore IntDen è definito e indicato come unità arbitrarie (AU), ciò non crea alcun problema finché i protocolli sono strettamente seguite. Barra della scala è di 10 micron. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 3. Analisi del fotometabolismo.60, (a) serie di immagini Aprire nel canale di interesse e assicurarsi che la scala è stato rimosso, se necessario, (b) In "Plugins" Menu click (c) "Time Series Analyzer". (D) Con lo strumento di selezione rettangolare, disegnare un ROI rettangolare che copre quasi l'intera struttura, o almeno l'intera cella di interesse per l'intera durata del film, (e) aggiungere il ROI selezionata, (f) cliccare su "Get Media "e (g) I risultati verranno visualizzati nel" Time Tracce "tavolo" Time Tracce media complotto ". Si noti, tuttavia, che solo un (media intensità) del valore "medio" è tracciata contro il numero di telaio e non il valore "IntDen". (H) In "Analizza" del menu, run "Misura", senza modificare altri parametri, per misurare la "IntDen" per lo stesso ROI nello stesso fotogramma. Ciò fornirà l'equivalente del Meun'intensità in "IntDen", usare questo valore per calcolare il fattore di conversione (pari al "Area") e tracciare la "IntDen" del ROI intero arco contro il tempo in secondi in MS Excel. (J) Fare clic su "List", copiare l'elenco dei valori da un foglio Excel e convertire tutti i valori "significare" valori "IntDen". Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 4. Correzione di fotometabolismo. Seconda della sonda utilizzata e le impostazioni delle immagini, si può verificare fotometabolismo. Questo potrebbe influenzare fortemente l'esito della valutazione. A) Valori Raw IntDen (in au) della sonda dalla intera struttura sono tracciati contro il tempo in secondi in MS Excel. Aggiungere un linearetrend-line;.. una pendenza chiaramente negativo indica la presenza di effetto foto-sbiancamento B) A titolo di esempio, applicando la slop invertito sul greggio IntDen utilizzando la formula di correzione rendimenti valori IntDen il IntDen corretta C) corretti sono parzialmente compensato la effetto di fotometabolismo. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 5. Presentazione di cellule rappresentative, cinetica e media del segnale corretto. A) BMMs caricato con sonda destrano al min 0 sulla captazione del branello IgG rivestite indicata dalla freccia. Barra della scala è di 10 micron. Corrisponde Movie 1 B) 2.5X ingrandita inserire da un filmato time-lapse, raffigurante il phagosome indicato in un arco di 85 min dopo l'assorbimento, falso-colore per una migliore visibilità con "Thal" Look-up-table (LUT) in ImageJ. Il phagosome ROI misurato è indicato con la linea tratteggiata bianca. Le istanze della consegna destrano e l'accumulo nel phagosome sono indicati con frecce bianche. C) Corretta segnale di fluorescenza del Texas Red 70kDa destrano consegnato dal lisosomi a phagosome indicato. D) In media i valori IntDen fluorescenza da 10 phagosomes all'interno delle due celle indicate ± SEM . Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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Discussion
Nella sezione seguente si discuterà fasi critiche del metodo presentato e le sue limitazioni. Inoltre, ci si collegherà alcuni dei problemi comuni con le loro soluzioni, introdurre eventuali modifiche e valutare i vantaggi del nostro metodo così come i metodi complementari adatti per questo approccio.
La preparazione delle perline, compreso l'accoppiamento di IgG di superficie delle sfere, è cruciale e l'uso di preparati unfresh dovrebbe essere evitata. In aggiunta a ciò, è anche fondamentale che il destrano è preparato dallo stock congelata (diluito e sterilizzati) appena prima di ogni esperimento. E 'importante che il caricamento del destrano segue un programma preciso di coerenza, nella captazione cellulare e distribuzione e accumulo vano. Inoltre, è importante utilizzare non solo la stessa configurazione microscopia e impostazioni del software, ma anche di mantenere le condizioni periferici più possibile costante (ad esempio TEmperature, CO 2, l'umidità, la tecnica bead-Inoltre, etc.). Un altro punto critico è la selezione di un campo visivo o la cella di interesse, il campione deve essere scoutato prima dell'inizio di imaging per scegliere cellule che sono rappresentativi.
Uno dei principali limiti del metodo è il numero di esperimenti necessari per produrre campioni significativi dimensioni. Il metodo descritto è relativamente lungo e intenso lavoro, poiché il numero di fagosomi osservabili in un campo di vista, a seconda della risoluzione scelta, è limitato. Mettere in comune i risultati di un numero molto basso di phagosomes scelti casualmente comporta il rischio che alcuni valori anomali estreme possono avere un effetto di rilievo sui valori medi. Campioni di dimensioni maggiori, dall'altro consentiranno mascheramento di phagosome-to-phagosome o cellula-cellula variazioni.
I problemi più comuni che possono verificarsi includono contaminazioni, la mancanza di fagocitosi e l'eccessiva candeggio e fotoeffetto di tossicità a causa della luce laser.
Sterilità, corretta conservazione e preparazione del destrano sono fondamentali per evitare contaminazioni. Nella nostra esperienza, il destrano acquistato non deve essere considerato come una soluzione sterile. Il rischio di contaminazione del campione può essere significativamente ridotto vasta centrifugazione del magazzino e la filtrazione sterile di soluzione di destrano diluita. D'altra parte, la preparazione regolare nella sospensione di sferette fresco, che contiene proteine ed è suscettibile di contaminazioni, può anche ridurre il rischio di contaminazioni.
Mancanza o bassi livelli di fagocitosi potrebbe essere dovuto a subottimale IgG rivestimento delle perline. Pertanto, è importante preparare i componenti per l'accoppiamento IgG del tallone (soluzione di IgG, EDAC) fresco e non usare perline che sono più di 4 settimane o non sono state mantenute esclusivamente a 4 ° C. Dal momento che le perle sono brevemente sonicati prima dell'utilizzo, si raccomanda di prepararealiquote di lavoro al fine di evitare sonicazione ripetuta di sospensione magazzino. Un altro motivo per minori che le prestazioni dei fagociti previsto potrebbe essere malsano, subottimale coltivate o cellule vecchie, la stretta aderenza alle condizioni di coltura consigliati per il tipo di cellulare utilizzato è quindi essenziale. Ad esempio, tripsinizzazione eccessivo durante la vendemmia potrebbe danneggiare i recettori di superficie fagociti e compromettere la capacità fagocitaria.
Eccessivo fotometabolismo può essere un grosso problema con alcuni fluorofori. Regolazione impostazioni del microscopio, ossia l'intensità della luce di eccitazione e la durata dell'esposizione campione, secondo la suscettibilità sbiancamento del fluoroforo aiuta a controllare la sbianca. Per quanto riguarda l'intervallo di tempo tra le acquisizioni di quadri successivi, un equilibrio tra il frame-rate, che ad una frequenza superiore prevede maggiore risoluzione temporale e migliore rivelazione di importanti dinamiche di interazione, e sbiancare la sonda ha to essere colpiti. L'equilibrio ottimale dipende in primo luogo le questioni che devono essere affrontate nell'esperimento data. Regolare la risoluzione di scansione, frequenza di scansione e la linea o il telaio media rappresentano le impostazioni che possono essere modificate per ottimizzare ulteriormente la durata dell'esposizione campione alla luce di eccitazione. Disponibilità di alcune di queste opzioni è però determinato dal tipo di sistema microscopio che viene utilizzato.
Le stesse linee guida generali devono essere seguite per minimizzare l'effetto foto-tossico di luce laser di eccitazione delle cellule. Questo effetto può essere manifestata come la morte delle cellule esposte alla luce laser durante l'imaging o un marcato aumento morfologie innaturali 20.
Qui abbiamo presentato un metodo di base e generale, che consente di effettuare modifiche e adattamento a diverse condizioni sperimentali. Come detto, questo metodo può essere impiegato per gli studi perdita di funzione come nei modelli knockout,knockdown gene o espressione della proteina mutante. Essa consente anche di strategie diverse per opsonizzazione bersaglio i recettori fagocitarie specifici, l'uso di diverse sonde endosomal / lisosomiali nonché lo studio di inibitori chimici o citochine.
Negli studi di espressione con varie proteine di fusione fluorescenti e loro mutanti possono essere utilizzati per studiare gli effetti sulla fornitura di una sonda appropriata per i fagosomi. Inoltre cinetica e dinamica di interazione della proteina stessa con phagosomes possono essere analizzati. Ci sono diverse sonde disponibili che possono essere utilizzate a tali fini. Un esempio importante di classe comune di sonde comprende il gruppo LysoTracker di coloranti acidotropic, che sono ampiamente utilizzati per tenere traccia lume di protonazione dei compartimenti endosomiali così come il lume phagosomal. Il rivestimento delle perle offre un altro moltitudine di possibilità. Ligandi, tra cui gli acidi nucleici quali specifici siti CpG del DNA batterico 21, bactecomponenti di superficie Rial quali LPS, proteine come avidina, le proteine del siero, inclusi i fattori del complemento (es. C1q o iC3b) tutti possono attraversare collegati a perline 22-24. Questo consente di studiare il ruolo di questi ligandi nella fagocitosi e phagosome maturazione. Utilizzo di molecole di segnalazione e di mediatori immunitari (ad esempio le citochine) aprire un'altra gamma di possibilità.
Infine, questo metodo può anche essere ampliato e adattato per condurre studi diretti da microrganismi, per esempio confrontando l'assorbimento di vs vivo uccisi o patogeni contro batteri non patogeni, anche se la forma irregolare dei batteri pone nuove sfide durante l'analisi dell'immagine.
Le future applicazioni di questo metodo sono molteplici come le modifiche che possono essere applicate. Come passo successivo, i metodi di analisi rapporto-metrica possono essere adattati. Combinazione di pH coloranti fluorescenti sensibili e pH-sensibile per bead-coating, o facendo uso di singole sonde di misuraure phagosomal pH (ad es pHrodo, FluoProbes) e composti che consentono di seguire sperimentalmente la cinetica di degradazione proteine e lipidi all'interno phagosome (es OVA, HRP, albumina di siero bovino e substrati lipasi trigliceridi) sono disponibili 25-31. Questi insieme rendono possibile la creazione di un vasto numero di metodi di indagine basati sul metodo di base di imaging cellulare dal vivo di phagosomes qui presentati.
Il metodo descritto può ottenere molto più elevate risoluzioni temporali rispetto ad approcci basati sul fagosoma isolamento 32. ELISA o Western Blot analisi di fagosomi può rappresentare un numero molto elevato di eventi in particolari punti di tempo, ma i dati rappresentano una popolazione molto più eterogenea e potenzialmente non sincronizzato di eventi. Citofluorimetria approcci basati teoricamente permettono l'analisi fino al livello cella singola e in questo modo può essere meno inclini a heterogeneity di popolazioni cellulari ma il problema simile di incerta sincronicità e la necessità di conteggi molto elevati di eventi per una valutazione affidabile persistono ancora. Tuttavia, l'alta velocità, sensibilità e riproducibilità del flusso approcci citometria 33,34 loro un complemento ottimale per l'approccio imaging cellulare dal vivo fanno.
Nel loro insieme, il vantaggio del nostro metodo sta nella precisione e ad alta risoluzione temporale con cui singoli phagosomes possono essere seguiti nel loro processo di maturazione in cellule viventi. Rispetto a tutti gli altri approcci che limitano osservazioni meno punti temporali, in cellule non vitali e pretrattate, qui è possibile seguire eventi cellulari dinamico e continuo per lunghi periodi di tempo in condizioni fisiologiche facilmente modificabili. Si potrebbe definire eventi relativi alla captazione del carico fagocitica, che consente la discriminazione delle fasi della fagocitosi più precisamente. In tal modo, la sincronizzazione permette di non oolo visualizzare comportamento simile di fagosomi, ma permette anche l'identificazione dei singoli differenze dovute ad esempio cellula-cellula variazioni. Ancora più importante, le dinamiche di interazioni che possono contenere la chiave per comprendere le interazioni complesse possono essere efficacemente illuminati in alta risoluzione temporale utilizzando il nostro approccio live-cell imaging.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo i membri del Laboratorio di Biologia phagosome per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è supportato da una sovvenzione Helmholtz Young Investigator (Iniziativa e Networking fondi dell'Associazione Helmholtz) e un programma di priorità SPP1580 Concessione del Consiglio per la ricerca tedesca (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) | PAA, Austria | E15-009 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM) | PAA, Austria | E15-047 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA, Austria | A15-151 | |
| L-Glutamine | PAA, Austria | M11-004 | |
| PBS | PAA, Austria | H15-002 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA, Austria | P11-010 | |
| WillCo-dish® Glass bottom dish (35 mm ∅, #1.5) | WillCo Wells, Netherlands | GWSt-3522 | |
| CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm | Greiner Bio one, Germany | 627871 | Alternative: Available as segmented |
| Carboxylated latex microspheres | Polysciences, USA | #09850 | Available in different diameters, we used 3 μm |
| Polystyrene microparticles | Kisker Biotech, Germany | PPs-3.0COOH | |
| Triton-X 100 | ROTH, Germany | 305.1.3 | |
| mouse whole IgG | Rockland, USA | 010-0102 | |
| EDAC crosslinker | Sigma-Aldrich, USA | E6383-1g | |
| 10 mM Tris | Sigma-Aldrich,USA | T1503 | |
| 1-ml syringe Omnifix -F | B.Braun, Germany | 9161406V | |
| 26 G needle (0.45*25 mm) | B.Baun, Germany | 4657683 | |
| RPMI 1640 | PAA, Austria | E15-039 | |
| Horse Serum | Gibco, USA | 16050-122 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich, USA | M2933 | |
| 0.2 μM syringe mounted filter | Sartorius, Germany | 83.1826.001 |
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