Abstract
Fagocytiske celler spiller en viktig rolle i det medfødte immunsystemet ved å fjerne og eliminere invaderende mikroorganismer i sine phagosomes. Phagosome modning er komplekse og tett regulert prosess der en gryende phagosome gjennomgår drastisk forvandling gjennom godt orkestrert interaksjoner med ulike cellulære organeller og oppbevaringsrom i cytoplasma. Denne prosessen, som er avgjørende for den fysiologiske funksjon av fagocytiske celler ved endowing phagosomes med sine lytiske og bakteriedrepende egenskaper, kulminerer i fusjon av phagosomes med lysosomer og biogenesis av phagolysosomes som anses å være den siste og avgjørende fasen av modning for phagosomes. I denne rapporten beskriver vi en levende celle bildebehandling basert metode for kvalitativ og kvantitativ analyse av dynamisk prosess med lysosome å phagosome innhold levering, noe som er et kjennetegn på phagolysosome biogenesis. Denne fremgangsmåten anvender IgG-belagte mikroperler som en modell for phagocyTosis og fluoroforen-konjugert dekstran-molekyler som luminal lysosomal last probe, for å kunne følge den dynamiske levering av lysosmal innholdet til de phagosomes i sanntid i levende makrofager ved hjelp av time-lapse avbildning og konfokal laser-skanning mikroskopi. Her beskriver vi i detalj bakgrunnen, forberedelsestrinnene og trinn-for-trinn eksperimentelt oppsett som gir enkel og presis distribusjon av denne metoden i andre laboratorier. Vår beskrevet metoden er enkel, robust, og viktigst, kan enkelt tilpasses for å studere phagosomal interaksjoner og modning i ulike systemer og under ulike eksperimentelle innstillinger som bruk av ulike fagocytiske celler typer, tap-av-funksjon eksperimenter, ulike prober, og fagocyttiske partikler.
Introduction
Profesjonelle fagocytter, inkludert makrofager, spille en avgjørende i immunsystemet. I tillegg til å være den første linjen i forsvaret i det medfødte immunsystem, de spiller også en avgjørende rolle i aktivering av adaptiv immunitet gjennom deres signalering og antigenpresenterende rolle 1-3. Mens funksjon av profesjonelle fagocytter er mangefasettert, er phagosome modning den kritiske ryggraden i bakteriedrepende og antigen prosessering funksjon av de profesjonelle fagocytter 4,5. Ved å reseptor mediert engulfment og opptak av en fagocytisk mål, slik som bakterier, går den begynnende phagosome gjennom en kompleks og velorganisert sekvens av interaksjon og utvekslingen med avdelinger av endocytic nettverk og flere andre cellulære organeller 6. Naturen av forbindelsene utvekslet med disse cellulære enheter samt regulering og timingen av fusjonshendelser bestemmer luminal phagosomal miljøet og de phagosomal membran sammensetning og dermed 7, skjebnen til modning phagosome åtte.
Den fysiologiske betydningen av phagosome modning er eksemplifisert ved de ulike strategier ansatt av ulike intracellulære patogener å flykte fra, arrestere eller grave phagosome modning ni. De fleste av disse strategiene er direkte eller indirekte hindre at den siste og avgjørende trinn i phagosome modningsprosess: fusjon av phagosome med sen endosomal / lysosomale rom, hvilket endows dem med hoveddelen av hydrolytiske enzymer og anti-bakterielle faktorer for et modent phagosome 7 , 8,10. Analyse av denne endelige og avgjørende skritt kan derfor gi oss sterke indikatorer om tilstanden i modningen av phagosomes og hvis den naturlige fysiologiske tilstand er å være positivt eller negativt påvirket under spesielle eksperimentelle innstillinger som blir utnyttet.
Den avdøde endosomal / lysosomal rommets er generelt ansett for å være de terminal avdelinger av endocytoseveien, definert og aner fra tidlig endocytiske avdelinger ved tilstedeværelse av ulike, scene spesifikke, markør molekyler. For eksempel hydrolytic enzymer eller membrankomponenter som Lysosomal assosiert membran proteiner (lamper) blant andre 11. Terminalen endocytic avdelinger-heretter bare kalt lysosomer-også tjene som den viktigste plasseringen for sluttfasen av fordøyelsen ved utgangen av fagocyttisk / endocytoseveien 12. På denne måte kan ikke-fordøyelige prober bli lastet via endocytose og macropinocytosis fra det ekstracellulære miljø og transportert gjennom endocytoseveien til lysosomene hvor det akkumuleres 13,14 etter å ha fulgt en definert syklus av opptak og jakten. Fluoroforpar-konjugert prober for fluoriserende mikroskopi som den organiske fordøyelige polymer dekstran blir ofte brukt som endocyticprobes 15-17.
14,18.
Etter beskrivelsen av foreliggende fremgangsmåte kan analoge eksperimenter være utformet ved bruk av modifiserte innstillinger og forhold for å undersøke deres innflytelse på phagosome modning, praktisk talt en hvilken som helst othennes type heft primære eller celle linjer fagocytiske celler, genetisk tap av funksjons eksperimenter inkludert genet knock-out og knock-down, mutanter eller uttrykk for fusjonsproteiner, fagocyttiske-mål, microbead belegg forbindelser, endosomal / lysosomale prober og faktorer som en cytokiner, kjemiske hemmere, eller siRNA blant andre er alle variabler som kan brukes til grunnleggende tilnærming av denne metoden.
Vi definerer mål og de grunnleggende kravene i denne metoden som følger:
- Målet med metoden: å muliggjøre direkte, kvantitativ og kvalitativ observasjon og analyse av phagosome modning med høy tidsoppløsning i levende fagocytiske celler.
- Phagocytic last: En riktig belagt mikropartikkel eller biologiske mål. Her bruker vi IgG-belagt tre mikrometer sfæriske polystyren mikropartikler som er lett internalisert via Fc-γ reseptor mediert fagocytose. Alternativt, noen mikroorganisme eller belagt microparticle hvor en fagocytisk reseptoren er tilstede i cellene kan anvendes.
- Fagocytiske celler: Adhererende fagocytiske celler som uttrykker de riktige fagocyttiske reseptorer. Her bruker vi muse primære BMMs som klinkende uttrykker Fc-γ reseptorer. Alternativt kan dendrittiske celler (DC), monocytter eller fagocyttiske epitelceller eller deres genetiske mutanter eller knock-out-varianter benyttes.
- Lysosomal last: En fluorescensmerkede lysosomal probe. Her er Texas Red-konjugert 70000 kiloDaltons dekstran (Dex70kD) brukes som luminal last av lysosomene. Alternativt kan en hvilken som helst fluorescerende detekterbare markør for cellerommet eller organeller, eller en egnet probe for phagosomal egenskaper slik som syre-eller nedbrytende kapasitet, kunne brukes for å studere utviklingen av phagosome modning.
- Påvirkende faktorer: For eksempel signalmolekyler, kjemiske forbindelser, genet knock-down, eller forbigående uttrykk av muterte proteiner kunne. Her har vi Forgen bruk av en slik faktor for enkelhets skyld, men for et nylig eksempel med mutant protein uttrykk og knock-down påvirkende faktorer kan se Kasmapour et al. 18 Enhver faktor som kan påvirke fagocytose eller omstendighetene og mobilitet av phagosomes og / eller de avdelinger som samhandler med modning phagosomes kan potensielt brukes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyr omsorg og alle prosedyrer i denne protokollen følger de institusjonelle og nasjonale retningslinjer.
Forbered forberedelsene som er indikert med "Π-" på forhånd.
En. Utarbeidelse av BMMs
- Utfør destruksjon av musene ved halshugging.
- Fjern femur og tibia bein, gratis bein fra vev og trim begge ender for tilgjengeligheten av benmarg.
- Hold bein i iskald PBS eller is-kald DMEM-medium (supplert med 100 U / ml penicillin og 100 pg / ml streptomycin, på is inntil det neste trinnet.
Merk: Gjennomføre følgende trinnene under en klasse II biosikkerhet kabinett for å minimere risikoen for forurensning. - Spyl marghulen med kald PBS + penicillin / streptomycin ved hjelp av en 26 g (0.45 mm) nål festet til en 1 ml sprøyte.
- Pellet celler ved forsiktig sentrifugering ved 350 xg i 10 min, resuspender pelleten i BMM Medium og plate i sterile mikrobiologi noncoated petriskåler.
- Utarbeidelse av BMM medium
- Dulbeccos Modified Eagles Medium DMEM
- 10% inaktivert FCS
- 20% mus fibroblast L929-cellelinje-supernatant (kilde til makrofag koloni-stimulerende faktor, M-CSF)
- 5% hesteserum
- 2 mM glutamin
- Fremstilling av L929-cellelinjen kulturmedium;
- RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 medium
- 10% inaktivert FCS
- 2 mM glutamin
- Utarbeidelse av mus fibroblast L929 cellelinje kultur supernatant;
- Confluent L929 celler ble splittet 1:4, kultivert i 175 cm 2 flasker for to dager ved hjelp av 20 ml L929 medium og kultursupernatanten ble samlet inn etter 48 timer, filtrert og lagt til BMM-medium
- Utarbeidelse av BMM medium
- Inkuber cellene spylt frafemur i en inkubator ved 37 ° C i 5% CO2 atmosfære.
- Etter hver 48 time (maksimalt 72 timer) av inkubasjon, aspirer medium og erstatte med frisk BMM medium, for opp til 10 dager. Mer enn 95% av cellene var positive for CD14 som testet ved strømningscytometri. CD14 er en mønstergjenkjenning reseptor uttrykt hovedsakelig av makrofager. Ved å bestemme hvor stor prosentandel av celler positive for denne reseptoren, har en ren kultur heft BMMs blitt generert.
Merk: forberede og kultur cellene tilsvarende hvis andre celletyper brukes.
2. Belegg av Microbeads som fagocytterende Cargo
- For utarbeidelse av en ml perle suspensjon, bruke 400 mL av 2,5% 3 mikrometer karboksylerte polystyren mikropartikler, eller alternative mikropartikler.
- Overfør perlesuspensjon til et 1,5 ml mikrosentrifugerør, vaskes 3 ganger med PBS og tilsett 100 ul av 500 mM 2 - (N-morfolino) ethanesulfonic syre-natriumsalt, MES-buffer ved pH 6,7 til vulsten pellet.
- Løs opp 50 mikrogram mus IgG (polyclonal IgG antistoff) i 50 mL sterilt DDH 2 O og legge til perle suspensjon.
- Fyll suspensjonen opp til 1 ml med sterilt DDH 2 O (450 mL).
- Inkuber løsningen i 15 minutter på et roterende hjul ved romtemperatur.
- Forbered EDAC tverrbinder, N-(3-dimetylaminopropyl)-N'-etylkarbodiimid-hydroklorid i en konsentrasjon på 10 mg / ml og tilsett 14 pl av perlesuspensjon.
Merk: EDAC kryssbindinger aminogrupper i IgG med karboksylgruppene på overflaten av perlene og letter immobilisering av IgG på perleoverflaten. Dette er kritisk for perle opptak og derfor løsningen bør være forberedt fersk. - Inkuber suspensjonen på et roterende hjul i 1 time ved RT.
- Legg 14 mL av EDAC tverrbinder og inkuberes suspensjonen på et roterende hjul i 1 time ved RT.
- Sentrifuger suspensjonen ved 10.000 x g i 2 minutter i en mikrosentrifuge.
- Vask kulene 3x i stoppbuffer (1% Triton-X-100 i 10 mM Tris, pH 9,4) for å stanse kryssbindingsreaksjonen, ved å resuspendere pelleten i stoppbuffer og spinne løsningen ved 10.000 x g i 2 min.
- Vasking av perler 3 x i PBS og resuspender pelleten i 1 ml PBS.
Valgfritt: Forbered arbeids porsjoner på 30-50 mL. - Oppbevar IgG-belagte perlesuspensjon ved 4 ° C i ikke lenger enn 4 uker, og aldri tillate at suspensjonen som skal fryses.
Merk: Et konserveringsmiddel som for eksempel natriumazid ved en sluttkonsentrasjon på 0,02% (w / v) kan tilsettes til suspensjonen for å hindre bakterievekst og forurensning. I dette tilfelle vasking av perlene før bruken må gjøres for å unngå cytotoksiske effekter av konserveringsmiddel. Sentrifuger en alikvot av suspensjonen ved 10.000 xg i 2 min og vaske perlene med resuspendering av pelleten i PBS. Gjenta vasking 3x.
Tre. Utarbeidelse av Dextran Probe Stock Solution
- Oppløse Texas Red 70000 kiloDaltons Dextran (Dex70kD) i PBS ved 20 mg / ml og oppbevar ved -20 ° C, i henhold til produsentens instruksjoner.
Merk: Hold aksjer ved -20 ° C i opptil flere måneder, eller ved 4 ° C i noen uker, kan du se dokumentasjonen produsenter. - Klargjør dekstran-løsning for forsøket fra lager ved å fortynne den i fullstendig DMEM cellekulturmedium (DMEM, 10% FCS, 2 mM L-glutamin) ved omtrent 1 mg / ml (flere ganger konsentrert oppløsning som vil bli fortynnet til de endelige arbeidskonsentrasjon på 20 mikrogram / ml før tilsetning til cellene).
- Bruk en ultralyd vannbad til sonicate dekstran aliquot i 5 minutter for å homogenisere oppløsningen og oppløse aggregater som senere kan føre til gjenstand generering under avbildning.
- Sentrifuger ved maksimal gi 5 minutter i en mikrosentrifuge for å fjerne eventuelle uoppløste klumper eller forurensninger fra oppløsningen.
- Bevege forsiktig supernatanten til et nytt rør, og samtidig unngå pellet på bunnen av røret, og fortynne oppløsningen til den endelige arbeidskonsentrasjon på 20 mikrogram / ml i fullstendig DMEM cellekulturmedium.
- Filter-sterile løsningen ved hjelp av en 0,2 mikrometer sprøyte montert filter.
4. Dextran Filopplasting
- Seed celler i en levende celle bildebehandling glassbunn fatet og ruge i minst 12 timer (ved 37 ° C i 5% CO 2 atmosfæren) for å sikre feste og akklimatisering.
Merk: Det er segmentert glassbunn retter tilgjengelig som lar utføre flere eksperimenter (opp til fire avdelinger) per parabolen. - Forbered dekstran i DMEM løsning som beskrevet i protokoll 3. Varm opp fremstilt dekstran i DMEM-løsning, ved hjelp av et vannbad ved 37 ° C.
- Aspirer medium ennd legge dekstran-løsning til cellene forsiktig og inkuber ved 37 ° C i 5% CO2 atmosfære i 2-8 timer for opptak.
Merk: Plan og optimalisere protokoll basert på sonden og celletype som brukes og strengt å holde denne varighet ved gjentatte eksperimenter. Dette er viktig for profilen av dekstran akkumulering i endocytoseveien og dermed reproduserbarheten av eksperimenter. - Vask cellene 3x med forvarmet komplett DMEM medium; aspirer medium og skyll celler nøye med fersk medium.
- Inkuber cellene med fullstendig DMEM medium i 4-12 timer ved 37 ° C i 5% CO2-atmosfære.
- Vask cellene gang med forvarmet komplett filtrert fenol rød-fri DMEM medium.
- For optimale bilderesultater, bytt til forvarmet komplett filtrert fenol rød-fri DMEM medium minst 30 min før starten av bildebehandling. Fenolrødt kan forårsake leskende av fluorescerende signaler, øker bakgrunnsstøy ogdermed redusere bilde kontrast og klarhet.
Merk: Sett opp mikroskop og bildeinnstillingene på forhånd, ifølge preplanned og optimalisert protokoll basert på den type sonde og celler som er brukt.
5. Legge IgG-belagte perler
- Stabil en delmengde av preprepared 1% perlesuspensjon til RT og sonicate i et ultralyd vannbad i 2-3 min.
- Legg 1-6 pl av 1% perlesuspensjon til den komp filtrert fenol-rød fri DMEM medium under en klasse II biosikkerhet kabinettet for å minimalisere risikoen for forurensning (en god startkonsentrasjonen er 1 mL / 2 cm to skåloverflaten).
Merk: Her BMMs ble utsådd på 25 000 celler / brønn, og en 6 ul av 1% lagerperlesuspensjon ble tilsatt til mediet i fatet. Dette tilsvarer omtrent en perle / celle ratio på 15:01. Forholdet må tilpasses til den type av celler som brukes, og til vulsten materiale, i.e. latekskuler har lav tetthet og ikke synke til bunnen raskt, mens polystyren-perler synker og kommer i kontakt med de adherente celler mye raskere og dermed i større antall.
Merk: Det er forsøket, kan det være av fordel å velge området som vil bli observert på forhånd. Perle suspensjon kan da bli lagt kun for det enkelte område av glassbunn fatet, derfor øke sannsynligheten for å observere gunstige opptak hendelser. - Den tett sky av perler kan diffust ved forsiktig pipettering suspensjonen i glassbunn fatet.
- Vent til perler synke til bunnen av glasset bunnen fatet og er omtrent i samme plan med de adherente fagocyttiske celler.
- Fokus på regionen av interesse (ROI), og start time-lapse bildebehandling.
Merk: Det kan være nødvendig å finjustere fokus mens bildebehandling er i gang, avhengig av bildesystem som brukes, dens stahet og mobilitet av de observerte celler. Vær imidlertid oppmerksom på at dette kan umuliggjøre, riktig analyse av phagosomes som sterkt avviker fra fokusplanet som følge av omstilling.
6. Imaging
Følg de generelle retningslinjene nedenfor for optimal bildekvalitet;
- Bruk en confocal imaging system, for eksempel en laser-scanning eller en roterende disk system.
Merk: En Leica TCS SP5 AOBS Laserskanning konfokalmikroskop kontrollert av Leica LAS AF programvare og utstyrt med en miljøkontroll kammeret ble brukt her for time-lapse video bildebehandling. - Optimalisere bildeinnstillinger som for eksempel skannehastighet, forstørrelse, oppløsning, osv.. på en måte for å tillate en hastighet på en ramme i hver 7-20 sekunder, avhengig av hvilket system som brukes.
Merk: Her, en 200 Hz skannehastighet, 2x skanner zoom og en linje gjennomsnitt av 2-3x med en oppløsning på 512 x 512 piksler resuLted i en opptakstiden mellom 3-5 sek / rame. En sats på en ramme i hver 10 sek ble brukt til å spille inn filmer med tidsintervall med varighet på minst 120 min. - Bruk passende innstillinger eksitasjon / utslipps basert på den brukte avbildningssystem og probe (r).
- Optimalisere innstillinger for å hindre overdreven foto-bleking.
Merk: Her, Texas Red Dextran 70kD var spent ved hjelp av en DPSS (561 nm) laser og utslipp lys ble oppdaget av en Leica hybrid detektor (HYD) på 600-650 nm med utslipp topp på 610 nm. Laserintensitet må tilpasses til signalintensitet og holdes så lav som mulig for å minimalisere foto-bleking av fluorofor (er) og fototoksisitet virkningen av laserlyset inn i cellene. Generelt er det viktig å balansere skannehastighet, linje i snitt, oppløsning skanning, rammeintervall, og varigheten av avbildning for å oppnå riktig og stabil signalintensitet og fange den fullstendige varighet av vulsten opptak og phagosome modning prosessen.
- Optimalisere innstillinger for å hindre overdreven foto-bleking.
- Omfatter en lys-felt (BF) kanal for å observere perlene hvis de ikke er konjugert med en fluorofor.
Merk: Ved siden av Texas Red-kanalen, ble BF-kanal som brukes til å visualisere perlene, ble den samme DPSS laser brukes som lyskilden, og signalet ble detektert med en foto multiplikator (PMT)-detektor.
Merk: Sørg for å bruke identiske opptaksinnstillinger når anskaffe data som skal samles. De viktigste parametrene er: eksitasjon laser intensiteter, detektor innstilling, kjøp innstillinger, forstørrelse og ramme intervaller. Ikke ved hjelp av identiske ramme intervaller vil nødvendiggjøre en kurve-gjennomsnitt steg som observasjon datapunkter ikke vil overlappe (f.eks å samle en observasjon med rammer ervervet ved hver 7 sek med et annet sett med rammer på hvert 12 sek). Dette vil øke de skritt som kreves for dataanalyse og krever ekstra programvare med kurve-gjennomsnitt funksjon, for eksempel OriginLab 's Origin Pro statistikk programvare ( http://www.originlab.com/ ). - Helst lagre time-lapse video i den opprinnelige filen-format av den brukte bildebehandlingssystemet og unngå eksport i komprimerte formater.
Merk: Her ble time-lapse filmer lagret i den innfødte Leica LAS AF format filer, som ble deretter direkte importert å åpne i Fiji (LIF.). Fiji er i stand til å lese de innfødte filformater fra de fleste mikroskop produsenter som bruker den medfølgende Bio formater importør plug-in. Eksportere time-lapse film fil i en bildeserie med JPG eller TIFF eller som en videofil i en AVI container format er ikke nødvendig eller anbefalt. I tillegg til å bevare best mulig bildekvalitet fra den opprinnelige observasjon ved å unngå lossy komprimeringsalgoritmer (f.eks JPEG), ved hjelp av den innfødte mikroskop filformat forsikrer at filens meta-data (tidsstempler, forstørrelse, laser-og oppkjøps intensiteter, Detektorinnstillinger osv.) er bevart og tilgjengelig for Fiji. Men, hvis en eller annen grunn, time-lapse videofiler må eksporteres i et annet format for analyse, sørg for å bruke ukomprimerte filformater som TIFF bildeserie og separat RGB farge (rød, grønn, blå) kanalene allerede på dette trinn, som Fiji ofte ikke kan lykkes skille BF kanal fra andre fargekanaler i eksporterte filer. Sørg også for å bevare de opprinnelige mikroskop filer som referanse.
7. Analyse av Time-lapse filmer
- Bruk ImageJ, Fiji eller noen annen programvare som gir en analoger signal forening analyse evne.
Merk: Her ble Fiji brukt for analyse av time-lapse filmer. Fiji er en ImageJ distribusjon som inneholder et bildebehandlings pakke med omorganiserte verktøy menyer og flere innfødte plug-ins, som er tilgjengelig for gratis nedlasting på http://fiji.sc . Fremgangsmåten som beskrives i dette sektion er vist på figur 2. - Åpne filen i Fiji ved å klikke på "File", "Open" og velge filen, eller ved å dra og slippe filen til Fiji.
- Velg følgende alternativer;
- Stack visning: Vis stable med Hyperstack,
- Fargealternativer: Fargemodus fargelegges,
- Split kanaler i separate vinduer: Split kanaler (for hver RGB farge-kanal som ble tatt opp et eget vindu åpnes).
- I tilfelle en bildeserie som skal benyttes, legger serien til Fiji ved å gå til "File", "Import", "Image Sequence" og velg en bildefil i mappen som inneholder målet bildeserie.
- Angi filtre og betingelser for lasting valgte bildene i serien, for eksempel;
- Antall bilder: hvor mange rammer som skal lastes.
- Starter bilde: hvilket bilde er startrammen i serien.
- Trinnvis: trinnene mellomrammer som skal lastes (hver ramme, hvert sekund ramme, etc.).
- Filnavnet inneholder: filtrering for spesifikk kanal med navnet fil (for eksempel ved å sette "C001", som er hvordan normalt bildene fra "kanal 1" er merket etter farge-separasjon av en flerkanals time-lapse video).
- Angi filtre og betingelser for lasting valgte bildene i serien, for eksempel;
- Fjern skalering ved å gå til "Analyze", "Set skala ...", merke av i boksen "Global" og klikke på "Klikk for å fjerne scale".
Merk: Dette trinnet kan pixel basert analyse av bildene i tilfelle ulike forstørrelser har vært brukt i de ulike eksperimentelle settene som skal evalueres. Dersom forstørrelsesinnstillingene har alltid blitt holdt konstant og den innfødte mikroskop filen ble direkte importert til Fiji, kan dette trinnet bli hoppet, som Fiji kan forstå og bruke forstørrelse og skala data fra mikroskopet filens metadata. - Sett opp et måleparameters ved å gå til "Analyze", "Set Measurements" og sjekke følgende bokser: "Area", "Standard avvik", "Integrated density", "Display label" og "Mean grå verdi".
- Omdirigering av fargekanal som inneholder signal fra sonden som skal bli målt og bekreftet med "OK".
- Gå til rammen der målingene er å være i gang, og velge BF kanalvinduet ved å klikke på den øverste kanten av vinduet.
- Bruk "oval markeringsverktøy" for å velge et område av interesse (ROI), dvs. en sirkulær ROI på internalisert perle. Sikre at utvalget er montert fast til ytterkanten av perlen så synlig i BF-kanalen.
Merk: Når du bruker en PC, hold Shift-tasten mens du bruker valg verktøy for å sikre en sirkulær ROI. - Start målingen optimalt noen rammer før full engulfment av perlen er ferdig og legg merke tilramme der en fullt dannet begynnende perle-phagosome dannes og den fagocytisk koppen er lukket. Dette bør være forholdsvis tydelig merkbar i BF-kanalen.
- Gå til "Analyze" og klikk "Mål" for å utføre målingen, resultatet vil bli vist i et eget vindu med tittelen "Resultater".
- Gå til neste ramme, å justere posisjonen til ROI dersom vulsten har beveget seg, og gjenta målingen. Resultatet vil bli lagt til listen i resultatvinduet, hver analysert ramme kan identifiseres basert på verdien i "Label"-kolonnen.
Merk: Ved hjelp av hurtigtaster (for eksempel "M" for tiltak) i betydelig grad kan øke hastigheten på evalueringsprosessen, se listen over snarveier og tilordne kostyme seg under menyen "Plugins". - Etter endt måling av alle relevante rammer, kan resultatet bli kopiert til et regnearkprogram som MS Excel. Kolonnen "IntDen" skildrer intensities av det valgte området i kanalen at målingen ble omdirigert til.
8. Bleking Correction
Avhengig av det brukte probe og bildeinnstillingene, kan foto-bleking oppstå. Avhengig av omfanget, kan dette sterkt påvirke utfallet av evalueringen. Imidlertid kan denne effekten bli delvis korrigert ved å anvende en lik, men motsatt endringshastigheten til de målte verdier. Hvis tilstede, kan den foto-bleking koeffisienten beregnes ved å måle den tidsavhengige signalintensiteten reduseres i hele rammen, eller spesifikt beskårne område av rammen, i tidsspenn som er relevant for analyse av hvert phagosome. Denne prosessen er vist i figurene 3 og 4.
- Under "Plugins"-menyen i Fiji, bruke "Time Series Analyzer" plug-in for å bestemme den generelle nedgangen i hele-frame, eller ROI spesifikk probe signal intensitet over tid (Figur 3).
Merk: Time Series Analyzer plug-in er tilgjengelig for nedlasting på http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html , i tilfelle det ikke allerede finnes i Plugins menyen. - Plott måling mot tiden (i sekunder) i MS Excel, bare for de rammer som tilsvarer rammene av en analysert phagosome.
- Påfør en lineær trend-linjen (figur 4A) til tomten, en negativ helling for den synkende signal indikerer tilstedeværelse av foto-bleking effekt.
- Påfør snudd skråningen til verdier fra en analysert phagosome (Tall 4B og 4C): Korrigert signalintensitet (SI) = rå SI + (i sekunder * bakfall)
Merk: hver enkelt analysert phagosome vil ha en bestemt tidsspenn (starter på komplett opptak ramme) under en innspilt time-lapse film, foto-bleacHing må beregnes på nytt for det spesifikke span og vil bare være gyldig for å korrigere de målte verdiene fra det bestemte phagosome.
9. Data Evaluering
- Sammenstille dataene og beregne gjennomsnitt og statistisk feil av bleking-korrigerte verdier i egnet programvare.
- Plott evaluerte data i en passende form.
Merk: Her, de vitenskapelige statistikk og plotting programvare GraphPad Prism ( http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ble) brukt. Prism programvare er i stand til å generere og plotte en gjennomsnittlig kurve med de tilsvarende feilindikatorer så lenge alle data har samme bildefrekvens (dvs. alle ble kjøpt med på de samme intervaller, for eksempel ett bilde hver 10 sek).
Merk: Store variasjoner av de absolutte SI verdier innenfor gjentakelser av samme experiment sett vil introdusere svært stor statistisk feil og gjengi data ubrukelig. Dette kan være tilfelle hvis protokollen, for eksempel bildeinnstillingene, ikke blir holdt strengt identisk mellom ulike eksperiment repetisjoner som skal sorteres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den korrekte fremstilling av cellene og perlene for avbildning er kritisk. Figur 1 viser omrisset av såing, sonde-lasting og innledende bilde trinnene i denne fremgangsmåte, basert på vår optimalisert protokoll for BMMs. Det er derfor viktig at protokollparametere bli testet og optimaliseres avhengig av type av celler og prober som skal benyttes.
Etter tilsetning av de IgG-belagte perler til de forhåndslastede celler, er det viktig at synsfeltet er valgt på en slik måte for å gi det største antall mulige opptaks hendelser i det største antall av celler er mulig, samtidig som det forhåndsdefinerte forstørrelse innstilling av protokollen. Som vist i figur 2, kan denne tilnærmingen sørge for et større antall analyser phagosomes i hvert intervall video. I tillegg til å øke de datapunkter pr video utbytte av hvert eksperimentsett og dermed reduseres variasjonen innført ved å variere perifereskapte betingelser og øker robustheten av dataene.
Det anbefales at signalkrets måleprosedyre (figur 2) utføres av en og samme person, og i en blind måte, hvis det er mulig. Dette kan bidra til å redusere feilen ved å eliminere flere personlige-feilkilder og redusere skjevhet, som ROI tilordnet hver phagosome skal velges og beveges manuelt etter hver ramme.
Mens naturlig regelen om "den større prøvestørrelsen er, desto bedre" gjelder også her unngår vi evaluere mer enn 5 bead-phagosome per celle i synsfeltet for å hindre å gi for mye vekt til en enkelt celle som virkemåten for alle celler i samme kultur er ikke nødvendigvis homogen 19. Disse phagosomes bør velges tilfeldig så langt som mulig. I denne sammenheng er parametre som phagosomes blir fullt synlig i fokalplanet for hele varigheten av avbildning, og heller ikke å værepåvirket av overdreven foto bleking er avgjørende. Videre kan uptaking et stort antall store partikler av en enkelt celle påvirke fusjons dynamikken for phagosomes i cellen, slik at prioritet bør gis til de phagosomes som uptaken tidligere i prosessen ved en relativt "tom celle". Som en generell regel bør de gjennomsnittlige målinger fra minst fem celler fra opptil fem uavhengige eksperimenter (derav, opptil 25 phagosomes) sørge for god statistisk signifikans.
Anvendelsen av Time Series Analysis eller en tilsvarende metode for å påvise en mulig bilde-blekende effekt (figur 3) er svært viktig, som noen sonder vil lide av sterk bleking mens noen er veldig fotostabile. Den foto-bleking korreksjon trinn (figur 4) skal kun dersom en sterk blekende effekt observeres i alle forsøk med den samme probe anvendes. Det må bemerkes at denne prosess kan bare delvis riktigvirkningen av bleking. Viktigere, kan overdreven bleking i bare noen få tilfeller være et tegn på nonoptimal forhold, for eksempel feil eksitasjon eller bildeinnstillinger, feil medium pH, usunne celler, eller nonfresh reagenser.
I figur 5C, vulsten-phagosome indikert med en pil i figur 5A og figur 5B, blir analysert og den Dex70kD signalintensitet (SI) assosiasjon til modning phagosome i løpet av en periode på 90 min blir plottet. Den støykilde i kurven er en ramme til ramme variasjoner av det målte signalet på grunn av faktorer slik som blokkering av de analyserte phagosome av andre phagosome og focal plane svingninger. Men, er den tids trenden med signal assosiasjon til phagosome lett klart. Etter snitt analysen fra 10 phagosomes fra de to celler som er synlige i figur 5A, kan en gjennomsnittskurve plottes (figur 5D) hvor den statistiske error kan plottes som en standard feil av gjennomsnitt (SEM) eller standardavviket (SD), avhengig av prøvestørrelsen, og forsøksbetingelser. Mens den absolutte SI verdier av den gjennomsnitt-kurven er vanligvis forskjellig fra det av en enkelt analysert phagosome, er den tidsmessige utviklingen normalt svært lik. Etter analyse, kan det konkluderes med at levering av Dex70kD som lysosomal luminal last til perle-phagosomes i villtype BMMs nådd et platå i 35-40 min etter fagocytose.
Denne metode kan derfor anvendes for å undersøke den kvalitative eller kvantitative virkning av forskjellige faktorer på phagosome modningsprosess.
Figur 1. Utarbeidelse av celler for bildebehandling. Preprepared BMMs er seedet i en glassbunn fatet minst 12 timer før tilleggdekstran, er oppløsning av dekstran i medium tilsatt ved 20 pg / ml konsentrasjon og inkubert i 2-8 timer (lasting), Cellene ble vasket, friskt medium blir tilsatt og cellen inkubert i minst 4 timer (chase), cellene er vasket igjen og perlesuspensjon tilsettes like før starten av bildebehandling. for å vise større bilde .
Figur 2. Trinnvis instruksjon for bildeanalyse. Etter lasting av time-lapse video eller bildesekvens i ulike kanaler i Fiji, følger evalueringen i disse trinnene (Merk at figuren viser et bilde collage og ikke alle vinduene som vises her vil forbli åpne samtidig ). (A) Under "Analyze"-menyen, pixel tilAvstanden skalering er tilbake i tilfelle meta-data i bilder er ikke tilgjengelige for Fiji, har forskjellige forstørrelser tidligere blitt brukt i Fiji eller intervallopptak er på ulike forstørrelser, ved å gå til (b) "Set Scale", ( c) tikkende "Global" boksen som gjelder den tilbakestilt til all senere lastet bildeserie og klikke på "Klikk for å fjerne Scale". (D) Kontroller at både den lyse feltet (BF) kanal bildeserie (der perle-phagosomes er godt synlig) og kanalen inneholder sonde signal er lastet og har nøyaktig samme ramme-teller og pikselstørrelsen, f.eks. to serier av hver 400 rammer med 450 x 450 pixel dimensjoner. (E) Under "Analyze"-menyen, kan parametre for evaluering settes under "Set Målinger", der "Area", "Integrated tetthet" og "visningsetikett" parametere må velges. (F (G) Dette sikrer måling av den rød-kanalen intensitet i samme Region of Interest (ROI) som er vist av den stiplede linjen og den hvite pilen i rød-kanalen. Den Rundskriv ROI er valgt i BF kanal med "Oval" markeringsverktøy. (H) Start målingen under "Analyze" "Mål" eller bruker snarveien kommandoen, og gjenta for hver ramme av hele serien for den ønskede varigheten av forsøket (f.eks 90 min). I hver ramme, flytte og justere ROI plassering til perle-phagosome av interesse, og merk at du går til neste ramme i BF serien og gi "Mål" kommandoen automatisk måler avkastningen i tilsvarende rammen av den rød-kanal. (i) Måleresultatervil vises som en liste i "Resultater"-vinduet. Under "Label"-kolonnen, er den nøyaktige ramme for hver linje tydelig identifisert; bruke dette til å kontrollere for gjentatt måling av en enkelt ramme eller hoppet rammer i langbildeserien. (J) "IntDen" short for integrert tetthet er kritisk utdataparameteren; kopiere minst etiketten og "IntDen" verdier til en MS Excel-ark til å fortsette med evalueringen. Enheten for IntDen verdi er udefinert og angitt som vilkårlige enheter (AU), betyr dette ikke skaper noen problemer så lenge protokollene er strengt fulgt. Scale bar er 10 mikrometer. Klikk her for å se større bilde .
Figur 3. Analyse av bilde-bleking.60; (a) Åpen bildeserie i kanalen av interesse og sørge for at skalaen er fjernet hvis nødvendig, (b) Under "Plugins"-menyen klikk (c) "Time Series Analyzer". (D) Bruke den rektangulære markeringsverktøy, tegne en rektangulær ROI som dekker nesten hele rammen, eller i det minste hele cellen av interesse for hele varigheten av filmen, (e) legge til den valgte ROI, (f) på "Hent Gjennomsnittlig "og (g) Resultatene vil vises i" Time Traces "bord og" Time Traces Gjennomsnittlig "plot. Merk imidlertid at bare en "gjennomsnittlig" (Mean intensitet) verdi er plottet mot rammenummeret og ikke "IntDen" verdi. (H) Under "Analyze"-menyen, run "Mål" uten å endre noen andre parametere, for å måle "IntDen" for nøyaktig samme avkastning på den samme rammen. Dette vil gi tilsvarende den Meen intensitet i "IntDen", bruker denne verdien for å beregne omregningsfaktor (lik den "Area") og plott "IntDen" av hele ramme ROI mot tiden i sekunder i MS Excel. (J) Klikk "List", kopiere listen med verdier til et Excel-ark og konvertere alle "mener" verdiene til «IntDen" verdier. Klikk her for å se større bilde .
Figur 4. Korreksjon av foto-bleking. Avhengig av brukt sonde og bildeinnstillinger, kan foto bleking oppstå. Dette kan sterkt påvirke utfallet av evalueringen. A) Raw IntDen verdier (i au) av sonden fra den hele rammen er plottet mot tiden i sekunder i MS Excel. Legg til en lineærtrendlinje;.. en klart negativ helling indikerer tilstedeværelse av foto-bleking effekt B) Som et eksempel, bruk av reversert pytt på rå IntDen bruke korreksjon formel gir den korrigerte IntDen C) Korrigerte IntDen verdier er delvis kompensert for Effekten av foto-bleking. Klikk her for å se større bilde .
Figur 5. Presentasjon av representative celler, kinetikk og gjennomsnitt av det korrigerte signalet. A) BMMs lastet med dekstran-proben med min 0 ved opptak av den IgG-belagte perler er angitt med pilen. Scale bar er 10 mikrometer. Tilsvarer Movie 1 B) 2.5x zoomet inn, fra en time-lapse film, som skildrer den indikerte phagosome over en periode på 85 min etter opptak, falsk-farget for bedre synlighet med "Thal" Look-up-table (LUT) i ImageJ. Den målte phagosome ROI er indikert med hvite stiplede linjen. Forekomster av dekstran levering og akkumulering i phagosome er markert med hvite piler. C) Korrigert fluorescens signal om Texas Red 70kDa dekstran levert fra lysosomer til den angitte phagosome. D) i gjennomsnitt fluorescens IntDen verdier fra 10 phagosomes innenfor de to indikerte cellene ± SEM . Klikk her for å se større bilde .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I neste avsnitt vil vi diskutere kritiske trinn av det presenterte metoden og dens begrensninger. Videre vil vi koble noen av de vanligste problemene med sine løsninger, introdusere mulige modifikasjoner og vurdere fordelene med vår metode samt egnede komplementære metoder for denne tilnærmingen.
Fremstillingen av kulene, blant annet koblingen av IgG til perleoverflaten, er avgjørende, og bruken av unfresh preparater bør unngås. I tillegg til det, er det også avgjørende at dekstran er fremstilt fra den frosne lager (fortynnet og sterilisert) ferskt før hvert eksperiment. Det er viktig at lastingen av dekstran følger en nøyaktig plan for å oppnå konsistens i cellulært opptak og rommet fordeling og oppsamling. I tillegg er det viktig å bruke ikke bare den samme mikros oppsett og programvare innstillinger, men også til å holde de perifere tilstander så konstant som mulig (f.eks temperature, CO 2, fuktighet, perle-tillegg teknikk, etc.). Et annet kritisk punkt er utvalget av et synsfelt eller celle av interesse, bør prøven være speidet før starten av avbildning for å velge celler som er representative.
En av de store begrensningene av fremgangsmåten er antall forsøk er nødvendige for å gi betydelige eksempler størrelser. Den beskrevne fremgangsmåte er forholdsvis tidskrevende og arbeidet, siden antallet observer phagosomes i ett synsfelt, avhengig av den valgte oppløsningen, er begrenset. Pooling resultatene av et svært lavt antall tilfeldig utvalgte phagosomes innebærer risikoen for at noen få ekstreme uteliggere kan ha en fremtredende effekt på gjennomsnittsverdier. Større prøvestørrelser på den annen side gjør det mulig maskering av phagosome-til-phagosome eller celle-til-celle variasjon.
De vanligste problemene som kan oppstå inkluderer forurensing, mangel på fagocytose og overdreven bleking og bildetoksisitet effekt på grunn av laserlys.
Sterilitet, forsvarlig oppbevaring og tilberedning av dekstran er avgjørende for å unngå forurensing. I vår erfaring, bør den kjøpte dekstran ikke betraktes som en steril løsning. Faren for forurensning av prøven kan bli betydelig redusert ved omfattende sentrifugering av lager-og steril filtrering av fortynnet dekstran-løsning. På den annen side, vanlig tilberedning av frisk perlesuspensjon, som inneholder proteiner, og er utsatt for forurensninger, kan også redusere risikoen for forurensing.
Manglende eller lave nivåer av fagocytose kan skyldes suboptimal IgG-belegget på kulene. Derfor er det viktig å fremstille komponenter for IgG-kobling av vulsten (IgG-løsning, EDAC) ferske og ikke å bruke perler som er mer enn 4 uker gamle, eller ikke har blitt holdt utelukkende ved 4 ° C. Ettersom perlene er kort sonikert før utnyttelse, er det anbefalt å forberedearbeider alikvoter for å unngå gjentatt sonikator av utgangssuspensjonen. En annen årsak til lavere enn forventet phagocytic ytelse kan være usunn, suboptimalt kultivert eller gamle celler, streng overholdelse av anbefalte kultur vilkår for brukte celletype er derfor viktig. For eksempel, kan en kraftig trypsinization under innhøstingen skade fagocyttiske overflate reseptorer og svekke phagocytic kapasitet.
Overdreven foto-bleking kan være et stort problem med noen fluoroforer. Justering mikroskop innstillinger, dvs. intensiteten av den magnetisering lys og varighet av prøven eksponering, i henhold til bleke mottakelighet for fluoroforen hjelper til å kontrollere bleking. Med hensyn til tidsintervallet mellom kjøp av suksessive rammer, en balanse mellom en ramme-sats, som ved en høyere frekvens muliggjør høyere tidsmessig oppløsning og bedre åpenbaring av viktige interaksjons dynamikk, og blekingen av sonden har to bli rammet. Den optimale balansen avhenger først og fremst de spørsmålene som tas opp i den gitte forsøket. Justering av scanning-oppløsning, frekvensavsøkningen og linje eller ramme gjennomsnitt representerer innstillinger som kan endres for å optimalisere varigheten av prøven utsettes for eksitasjon lyset videre. Tilgjengelighet av noen av disse alternativene er imidlertid bestemt av den type mikroskopsystem som blir brukt.
De samme generelle retningslinjer som er beskrevet, for å minimalisere den foto toksisk effekt av laser magnetisering lyset på cellene. Denne effekten kan være manifestert som død av cellene utsatt for laserlys under avbildning eller en markert økning i unaturlige morfologi 20.
Her har vi presentert en enkel og generell metode, som gjør det mulig for modifikasjoner og tilpasning til ulike eksperimentelle innstillinger. Som nevnt, kan denne metoden anvendes for tap-av-funksjon-studier som i knockout-modeller,gene knockdown eller mutant protein uttrykk. Det gir også mulighet for forskjellige opsonization strategier for å målrette bestemte fagocytiske reseptorene, ved bruk av forskjellige endosomal / lysosomale prober samt studiet av kjemiske inhibitorer eller cytokiner.
Over ekspresjonsstudier med ulike fluorescerende fusjonsproteiner og deres mutanter kan bli brukt for å undersøke effektene på tilførsel av en egnet probe til phagosomes. Videre kinetikk og dynamikk for interaksjon av proteinet i seg selv med phagosomes kan analyseres. Det er flere sensorer er tilgjengelig som kan brukes til disse formålene. Et fremtredende eksempel på vanlig klasse av sonder omfatter LysoTracker gruppe acidotropic fargestoffer, som er mye brukt til å spore protonering lumen av endosomal avdelinger samt phagosomal lumen. Belegget av perlene har en rekke muligheter. Ligander, inkludert nukleinsyrer slik som spesifikke CpG områder av bakteriell DNA-21, bakterial overflaten komponenter som LPS, proteiner som avidin, serumproteiner inkludert komplementfaktorer (f.eks C1q eller iC3b) alle kan krysse knyttet til perler 22-24. Dette gjør studiet av rollen til disse ligander i fagocytose og phagosome modning. Ved hjelp av signalmolekyler og immunmediatorer (for eksempel cytokiner) åpne et annet utvalg av muligheter.
Endelig kan denne metoden også bli utvidet og tilpasset til å lede direkte studier med mikroorganismer, for eksempel ved å sammenligne opptak av levende g. drept eller patogene g. patogeniske bakterier, selv om den irregulære formen på bakterier gir nye utfordringer ved bildeanalyse.
Fremtidige anvendelser av denne metoden er like mangfoldige som de modifikasjoner som kan brukes. Som et neste skritt, kan forholdet metriske analysemetoder tilpasses. Kombinasjon av pH-sensitive og pH-insensitive fluorescerende fargestoffer for perle-belegg, eller gjøre bruk av enkelt sonder til tiltakure phagosomal pH (f.eks pHrodo, FluoProbes) så vel som forbindelser som gjør det mulig å eksperimentelt å følge kinetikken av protein og lipid nedbrytning inne phagosome (f.eks OVA, HRP, bovint serum albumin og triglyserid lipase substrater) er tilgjengelig 25-31. Disse sammen gjør det mulig å opprette et stort antall undersøkende tilnærminger basert på den grunnleggende metoden for live-cell imaging av phagosomes som presenteres her.
Den beskrevne metoden kan oppnå langt høyere timelige resolusjoner i forhold til tilnærminger som er basert på phagosome isolasjon 32. ELISA eller Western Blot analyser av phagosomes kan representere svært høyt antall hendelser på bestemte tidspunkter, men dataene representerer en langt mer heterogen og potensielt usynkroniserte befolkning på arrangementer. Strømningscytometri baserte tilnærminger teoretisk tillate analyse ned til den enkelte celle-nivå og på den måten kan være mindre tilbøyelige til å heterogeneity av cellepopulasjoner, men lignende problem med usikkert synkronitet og behovet for svært høye teller event for pålitelig evaluering fortsatt vedvarer. Likevel, cytometry nærmer seg høy gjennomstrømning, sensitivitet og reproduserbarhet av flyt 33,34 gjør dem til et optimalt tillegg til live cell imaging tilnærming.
Tatt sammen, fordelen med vår metode ligger i nøyaktighet og høy tidsmessig oppløsning som enkelt phagosomes kan følges i sin modningsprosess i levende celler. Sammenlignet med alle andre tilnærminger som begrenser observasjoner på færre tidspunkter, i ikke-levedyktige og forbehandlede celler, er det her mulig å følge cellulære hendelser for dynamisk og kontinuerlig over lange tidsperioder i henhold lett modifiserbare fysiologiske betingelser. Man kan definere hendelser i forhold til opptaket av fagocytisk last, noe som tillater diskriminering av de stadier av fagocytose mer nøyaktig. På den måten, gjør det mulig å ikke o synkroniseringnly visualisere lignende oppførsel av phagosomes, det tillater også identifisere individuelle forskjeller på grunn av for eksempel celle-til-celle variasjoner. Viktigst, kan dynamikken i samspillet som kan holde nøkkelen til å forstå komplekse interaksjoner være effektivt opplyst i høy tidsoppløsning ved hjelp av vår live-cell imaging tilnærming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker medlemmene av phagosome Biology Laboratory for kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet støttes av en Helmholtz Young Investigator Grant (Initiative og Nettverk midler av Helmholtz Association) og en Priority Program SPP1580 Grant av den tyske Research Council (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) | PAA, Austria | E15-009 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM) | PAA, Austria | E15-047 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA, Austria | A15-151 | |
| L-Glutamine | PAA, Austria | M11-004 | |
| PBS | PAA, Austria | H15-002 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA, Austria | P11-010 | |
| WillCo-dish® Glass bottom dish (35 mm ∅, #1.5) | WillCo Wells, Netherlands | GWSt-3522 | |
| CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm | Greiner Bio one, Germany | 627871 | Alternative: Available as segmented |
| Carboxylated latex microspheres | Polysciences, USA | #09850 | Available in different diameters, we used 3 μm |
| Polystyrene microparticles | Kisker Biotech, Germany | PPs-3.0COOH | |
| Triton-X 100 | ROTH, Germany | 305.1.3 | |
| mouse whole IgG | Rockland, USA | 010-0102 | |
| EDAC crosslinker | Sigma-Aldrich, USA | E6383-1g | |
| 10 mM Tris | Sigma-Aldrich,USA | T1503 | |
| 1-ml syringe Omnifix -F | B.Braun, Germany | 9161406V | |
| 26 G needle (0.45*25 mm) | B.Baun, Germany | 4657683 | |
| RPMI 1640 | PAA, Austria | E15-039 | |
| Horse Serum | Gibco, USA | 16050-122 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich, USA | M2933 | |
| 0.2 μM syringe mounted filter | Sartorius, Germany | 83.1826.001 |
References
- Greenberg, S., Grinstein, S. Phagocytosis and innate immunity. Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).
- Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
- Stuart, L., Ezekowitz, R. Phagocytosis: elegant complexity. Immunity. 22, 539-550 (2005).
- Blander, J. M., Medzhitov, R. On regulation of phagosome maturation and antigen presentation. Nat. Immunol. 7, 1029-1035 (2006).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).
- Vieira, O. V., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: aging gracefully. Biochem. J. 366, 689-704 (2002).
- Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
- Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).
- Luzio, J., Pryor, P., Bright, N. Lysosomes: fusion and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 622-632 (2007).
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30, 3481-3500 (2011).
- Luzio, J. P., et al. Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis. J. Cell. Sci. 113 (pt 9), 1515-1524 (2000).
- Eissenberg, L., Goldman, W. Fusion of lysosomes with phagosomes containing Histoplasma capsulatum: use of fluoresceinated dextran). Adv. Exp. Med. Biol. 239, 53-61 (1988).
- de Souza Carvalho, C., et al. Internalization, phagolysosomal biogenesis and killing of mycobacteria in enucleated epithelial cells. Cell. Microbiol. 13, 1234-1249 (2011).
- Wang, Y. L. Differential and sequential delivery of fluorescent lysosomal probes into phagosomes in mouse peritoneal macrophages. J. Cell Biol. 104, 1749-1754 (1987).
- Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes Fuse with Late Endosomes and/or Lysosomes by Extension of Membrane Protrusions along Microtubules: Role of Rab7 and RILP. Mol. Cell. Biol. 23, 6494-6506 (2003).
- Huynh, K. K., et al. LAMP proteins are required for fusion of lysosomes with phagosomes. EMBO J. 26, 313-324 (2007).
- Kasmapour, B., Gronow, A., Bleck, C., Hong, W., Gutierrez, M. Size-dependent mechanism of cargo sorting during lysosome-phagosome fusion is controlled by Rab34. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20485-20490 (2012).
- Snijder, B., et al. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).
- Knight, M., Roberts, S., Lee, D., Bader, D. Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, 9 (2003).
- Hemmi, H., et al. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature. 408, 740-745 (2000).
- Underhill, D., Ozinsky, A. Toll-like receptors: key mediators of microbe detection. Curr. Opin. Immunol. 14, 103-110 (2002).
- Bohdanowicz, M., Cosío, G., Backer, J., Grinstein, S. Class I and class III phosphoinositide 3-kinases are required for actin polymerization that propels phagosomes. J. Cell Biol. 191, 999-1012 (2010).
- Hoffmann, E., et al. Initial receptor-ligand interactions modulate gene expression and phagosomal properties during both early and late stages of phagocytosis. Eur. J. Cell Biol. 89, 693-704 (2010).
- Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. The kinetics of phagosome maturation as a function of phagosome/lysosome fusion and acquisition of hydrolytic activity. Traffic. 6, 413-420 (2005).
- Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126, 205-218 (2006).
- Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. Recording phagosome maturation through the real-time, spectrofluorometric measurement of hydrolytic activities. Methods Mol. Biol. 531, 157-171 (2009).
- Russell, D., Vanderven, B., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
- Hoffmann, E., et al. Autonomous phagosomal degradation and antigen presentation in dendritic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14556-14561 (2012).
- Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, R., Parish, T., Russell, D. Mycobacterium tuberculosis Responds to Chloride and pH as Synergistic Cues to the Immune Status of its Host Cell. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Aziz, M., Yang, W. -L., Wang, P., et al. Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Current protocols in immunology. Coliganet, J. E., et al. 14, (2013).
- Rogers, L., Foster, L. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18520-18525 (2007).
- Russell, D. G., Vanderven, B. C., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. S. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
- Savina, A., Vargas, P., Guermonprez, P., Lennon, A. -M., Amigorena, S. Measuring pH, ROS production, maturation, and degradation in dendritic cell phagosomes using cytofluorometry-based assays. Methods. Mol. Biol. 595, 383-402 (2010).
