Abstract
As células fagocíticas desempenhar um papel importante no sistema imune inato de remoção e eliminação de microrganismos invasores nas suas phagosomes. Maturação do fagossoma é o processo complexo e bem regulado durante o qual um phagosome nascente passa por uma transformação drástica por meio de interações bem orquestrados com diversas organelas celulares e compartimentos no citoplasma. Este processo, que é essencial para a função fisiológica das células fagocíticas, dotando phagosomes com suas propriedades líticas e bactericidas, culmina na fusão de fagossomos com lisossomos e biogênese de phagolysosomes que é considerada a última e crucial fase de maturação para phagosomes. Neste relatório, nós descrevemos um método baseado imagens de células vivas para a análise qualitativa e quantitativa do processo dinâmico de lisossoma para phagosome entrega de conteúdo, o que é uma característica da fagolisossomo biogênese. Esta abordagem utiliza microesferas IgG revestidas como um modelo para phagocytose e moléculas de dextrano fluoróforos como uma sonda de carga lisossômico luminal, a fim de acompanhar a entrega dinâmica de conteúdo lysosmal aos phagosomes em tempo real em macrófagos ao vivo usando imagens time-lapse e microscopia confocal a laser. Aqui vamos descrever em detalhe o plano de fundo, as etapas de preparação e configuração passo-a-passo experimental para permitir a implantação fácil e preciso desse método em outros laboratórios. Nosso método descrito é simples, robusta, e mais importante, pode ser facilmente adaptado para estudar as interações phagosomal e maturação em diferentes sistemas e em várias configurações experimentais, tais como uso de vários tipos de células fagocíticas, experiências de perda de função, as diferentes sondas e partículas fagocíticas.
Introduction
Fagócitos profissionais, incluindo macrófagos, desempenham um importante no sistema imune. Para além de ser a primeira linha de defesa do sistema imune inato, eles também desempenham um papel crítico na activação da imunidade adaptativa através da sua sinalização e apresentação de antigénio papel 1-3. Enquanto a função de fagócitos profissionais é multifacetada, maturação do fagossoma é crítica a espinha dorsal da função de processamento de antigénio e bactericida dos fagócitos profissionais 4,5. Após a imersão e absorção de um alvo fagocíticas, tais como bactérias receptor mediada, o fagossomo nascente passa por uma seqüência complexa e bem orquestrada de interação e intercâmbio com compartimentos da rede endocítica e várias outras organelas celulares 6. A natureza dos compostos trocados com essas entidades celulares, bem como a regulação e do calendário de eventos de fusão determina a phagosomal meio luminal e as phagoscomposição omal membrana e, portanto, 7, o destino do phagosome amadurecimento 8.
A relevância fisiológica da maturação do fagossoma é exemplificado pelas diversas estratégias empregadas por vários patógenos intracelulares para escapar, prender ou subverter maturação phagosome 9. A maioria destas estratégias directamente ou indirectamente impedir a fase final e crítica do processo de maturação do fagossoma: a fusão do fagossoma com tardias compartimentos endossomal / lisossomal, que lhes confere, com a maior parte das enzimas hidrolíticas e factores anti-bacteriana de um fagossoma madura 7 , 8,10. A análise desta etapa final e crítico, portanto, pode fornecer-nos com fortes indicadores sobre o estado de maturação das phagosomes e se o estado fisiológico natural está a ser positiva ou negativamente afetados nas configurações experimentais particulares que estão sendo utilizados.
O compartimento final endossomal / lisossomals são geralmente considerados como os compartimentos de terminais da via endocítica, definidos e distintos dos compartimentos endocíticas início com a presença de vários, Palco, moléculas marcadoras específicas. Por exemplo enzimas hidrolíticas ou componentes de membrana tais como proteínas de membrana Lysosomal associados (lâmpadas), entre outros 11. O terminal endocítico compartimentos-doravante referidos simplesmente como lisossomos-também servir como o principal local para as fases finais da digestão no final do fagocitária / endocítico caminho 12. Deste modo, as sondas não digeríveis podem ser carregados através de endocitose e macropinocitose do meio extracelular e transportado através da via endocítica para os lisossomas, onde se acumula 13,14 depois de seguir um ciclo de absorção definido e perseguição. Sondas fluoróforos para a microscopia de fluorescência, tais como o dextrano não digerível polímero orgânico são geralmente usados como endocyticprobes 15-17.
14,18.
Após a descrição do nosso método, experiências análogas podem ser projetados usando as configurações e os fatores modificados para investigar sua influência na maturação phagosome; praticamente qualquer otseu tipo de células fagocíticas primárias ou de linha de células aderentes, perda genética de experimentos de função, incluindo gene knock-out e knock-down, mutantes ou expressão de proteínas de fusão, fagocíticas-alvos, compostos de revestimento microbead, sondas endosomal / lisossomais e fatores de citocinas, inibidores químicos, ou siRNA entre outros, são todos variáveis que podem ser aplicadas à abordagem básica deste método.
Definimos o objetivo e os requisitos básicos deste método da seguinte forma:
- Objetivo do método: para permitir a observação directa, quantitativa e qualitativa e análise de maturação do fagossoma com alta resolução temporal em células fagocíticas vivo.
- Carga fagocítica: Uma micropartícula apropriadamente revestidos ou alvo biológico. Aqui usamos IgG-revestido 3 mM micropartículas de poliestireno esféricas que são rapidamente internalizados através do receptor de Fc-γ fagocitose mediada. Alternativamente, qualquer microrganismo ou microfone revestidoroparticle para o qual um receptor de fagocítica está presente nas células pode ser utilizado.
- As células fagocíticas: células fagocíticas aderentes que expressam os receptores apropriados fagocíticas. Aqui usamos primários BMMs rato que abundantemente expressam os receptores Fc-γ. Alternativamente, as células dendríticas (DC), monócitos ou células epiteliais fagocíticas ou seus mutantes ou variantes genéticas knock-out podem ser usados.
- Carga Lysosomal: Uma sonda fluorescente etiquetado lisossômico. Aqui, conjugado com vermelho do Texas 70000 kDa dextrano (Dex70kD) é usado como carga o lúmen dos lisossomos. Alternativamente, qualquer marcador detectável por fluorescência de um compartimento celular ou organelo, ou uma sonda adequada para propriedades phagosomal como acidez ou de degradação da capacidade, pode ser utilizado para estudar a progressão da maturação do fagossoma.
- Fatores que influenciam: Por exemplo, moléculas de sinalização, compostos químicos, gene knock-down, ou expressão transitória de proteínas mutantes poderia. Aqui, nós Forgum uso de tal fator para uma questão de simplicidade, mas para um exemplo recente com a expressão da proteína mutante e knock-down que influenciam fatores por favor ver Kasmapour et al. 18 Qualquer fator que pode afetar a fagocitose ou as circunstâncias e mobilidade dos phagosomes e / ou os compartimentos que interagem com phagosomes maturação poderia potencialmente ser usada.
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Protocol
Cuidados com os animais e todos os procedimentos neste protocolo seguir as diretrizes institucionais e nacionais.
Prepare as preparações que são indicados por "Π-" de antemão.
1. Preparação de BMMs
- Execute o abate dos ratos por deslocamento cervical.
- Retirar fémur e ossos da tíbia, ossos isentos de tecido e cortar ambas as extremidades para a acessibilidade da medula óssea.
- Manter ossos em PBS gelado ou meio DMEM gelado (suplementado com 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina, em gelo até que o próximo passo.
Nota: Siga as seguintes etapas em uma cabine de segurança biológica classe II para minimizar o risco de contaminação. - Lave a cavidade medular com PBS frio + penicilina / estreptomicina, utilizando um 26 G (0,45 mm) de agulha ligada a uma seringa de 1 ml.
- Células por centrifugação suave a 350 g durante 10 min, ressuspender o sedimento em med BMMium e placa em microbiologia estéril não revestida placas de Petri.
- Preparação do meio BMM
- Modified Eagles Médium da Dulbecco DMEM
- 10% de FCS inactivado
- 20% de fibroblastos de rato linha L929 célula sobrenadante da cultura (fonte de fator estimulante de colônias de macrófagos, M-CSF)
- 5% de soro de cavalo
- 2 mM de glutamina
- Preparação da linha de meio de cultura celular L929;
- RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640
- 10% de FCS inactivado
- 2 mM de glutamina
- Preparação de fibroblastos de rato L929 linha celular sobrenadante da cultura;
- Células confluentes L929 foram divididas 1:04, cultivadas em frascos de 175 centímetros 2 durante 2 dias, utilizando 20 ml de meio de L929 e o sobrenadante de cultura foi recolhido após 48 h, filtrada e adicionada ao meio-BMM
- Preparação do meio BMM
- Incubar as células liberadas a partir deo fémur numa incubadora a 37 ° C em 5% de CO2.
- Após cada 48 horas (máximo 72 horas) de incubação, aspirar o meio e substituir por meio BMM fresco, por até 10 dias. Mais de 95% das células foram positivas para CD14 como testado por citometria de fluxo. CD14 é um receptor de reconhecimento de padrões expresso principalmente pelos macrófagos. Por meio da determinação da percentagem de células positivas para este receptor, de uma cultura pura de BMMs aderentes foi gerado.
Nota: preparar e cultura das células de acordo, se forem utilizados outros tipos de células.
2. Revestimento de Microbeads como fagocítica Carga
- Para a preparação de 1 ml de suspensão de esferas, utilizar 400 ul de 2,5% de 3 mM de micropartículas de poliestireno carboxiladas ou micropartículas alternativos.
- Transferência da suspensão de esferas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, lavar 3x com PBS e adicionar 100 ul de 500 mM de 2 - (N-morfolino) etanossal de sódio do ácido ulfonic, tampão MES a pH 6,7 para o sedimento talão.
- Dissolve-se 50 ug de IgG de rato (anticorpo IgG policlonal) em 50 ul de ddH2O estéril e adicionar a suspensão de pérolas.
- Encher a suspensão até 1 ml com ddH 2 O estéril (450 mL).
- Incubar a solução durante 15 minutos numa roda rotativa à temperatura ambiente.
- Prepare EDAC reticulante, N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida a uma concentração de 10 mg / ml e adicionar 14 ul de suspensão de esferas.
Nota: EDAC ligações cruzadas grupos amino da IgG com os grupos carboxilo sobre a superfície das pérolas e facilita a imobilização da IgG na superfície do grânulo. Isto é crítico para a captação do grânulo e, por conseguinte, a solução deve ser preparada de fresco. - Incubar a suspensão sobre uma roda rotativa, durante 1 h à TA.
- Adicionar 14 ul de EDAC de reticulação e incubar a suspensão sobre uma roda rotativa, durante 1 h à TA.
- Centrifugar a suspensão a 10.000 xg durante 2 minutos numa microcentrífuga.
- Lavar as pérolas 3x em tampão de paragem (1% de Triton X-100 em Tris 10 mM, pH 9,4), a fim de parar a reacção de reticulação, por ressuspensão do sedimento em tampão de paragem e girando a solução a 10000 g durante 2 min.
- Lavar as pérolas 3x em PBS e ressuspender o pellet em 1 ml de PBS.
Opcional: Preparar alíquotas de trabalho de 30-50 mL. - Armazenar a suspensão de contas de IgG-revestidas a 4 ° C durante não mais de 4 semanas e não permitir que a suspensão a ser congelado.
Nota: Um conservante, tal como azida de sódio a uma concentração final de 0,02% (w / v) pode ser adicionada à suspensão para prevenir o crescimento bacteriano e contaminação. Neste caso, a lavagem das esferas, antes da sua utilização tem de ser realizada para evitar os efeitos citotóxicos do agente de conservação. Centrifugar um volume de suspensão a 10.000 xg durante 2 minutos e lavar as contas por novasuspender o sedimento em PBS. Repita 3x de lavar.
3. Preparação do dextrano Sonda da Solução
- Dissolve-se o vermelho de Texas 70000 kDa dextrano (Dex70kD) em PBS a 20 mg / ml e armazenar a -20 ° C, de acordo com as instruções do fabricante.
Nota: Mantenha os estoques a -20 ° C por até vários meses, ou a 4 ° C por algumas semanas, consulte a documentação do fabricante. - Preparar a solução de dextrano para a experiência da diluindo-o em DMEM meio de cultura celular completo (DMEM, 10% FCS, 2 mM de L-glutamina) a aproximadamente 1 mg / ml (várias vezes solução concentrada que irá ser diluído com o concentração final de trabalho de 20 ug / ml antes da adição às células).
- Usar um banho de água de ultra-sons a sonicar a alíquota de dextrano durante 5 minutos para homogeneizar a solução e dissolver os agregados que poderiam mais tarde levar a geração artefacto durante o exame.
- Centrifugar a máxima gdurante 5 minutos numa microcentrífuga para remover quaisquer aglomerados não dissolvidas ou de contaminantes a partir da solução.
- Mover cuidadosamente o sobrenadante para um tubo novo, evitando o sedimento no fundo do tubo e dilui-se a solução para a concentração de trabalho final de 20 ug / ml em meio de cultura DMEM célula completa.
- Filtrar a solução estéril usando um filtro de seringa de 0,2 fim montado.
4. Dextran pré-carregamento
- Células de sementeira em um imagens de células com fundo de vidro prato vivo e incubar durante pelo menos 12 horas (a 37 ° C em 5% de CO2) para garantir a fixação e de aclimatação.
Nota: Há vidro segmentado pratos de fundo disponíveis que permitem executar várias experiências (até quatro compartimentos) por prato. - Prepare o dextrano em solução DMEM, conforme descrito no Protocolo no 3. Aquecer o dextrano preparado em solução de DMEM, usando um banho de água a 37 ° C.
- Aspirar meio de umnd adicionar solução de dextrano às células cuidadosamente e incuba-se a 37 ° C em 5% de CO2 durante 2-8 horas, para a absorção.
Nota: Plano e optimizar o protocolo de acordo com o tipo de sonda e de células que é utilizado e estritamente manter a esta duração quando repetindo experiências. Isto é essencial para o perfil de acumulação de dextrano na via endocítica e, assim, a reprodutibilidade dos experimentos. - Lave as células 3x com pré-aquecido meio DMEM completo, médio aspirado e lavar as células com cuidado com meio fresco.
- Incubar as células com meio DMEM completo para 4-12 horas a 37 ° C em 5% de CO2.
- Lave as células uma vez com fenol filtrada meio DMEM sem vermelho completo pré-aquecido.
- Para obter resultados de imagem ideal, a mudança para pré-aquecido completa fenol filtrada meio DMEM sem vermelho, pelo menos, 30 minutos antes do início da imagem. Vermelho de fenol pode causar extinção de sinais fluorescentes, aumentando o ruído de fundo e, assim, reduzir o contraste da imagem e clareza.
Nota: Configure o microscópio e as configurações de imagem de antecedência, de acordo com o protocolo pré-planejada e otimizada com base no tipo de sonda e células que são usadas.
5. Adicionando Contas IgG-revestidos
- Equilibrar uma alíquota de 1% preprepared suspensão de esferas para a TA e sonicar num banho de água de ultra-sons durante 2-3 min.
- Adicionar 1-6 ul da suspensão de esferas de 1% para o meio completo filtrada fenol-vermelho livre de DMEM sob uma cabine de segurança biológica de classe II para minimizar o risco de contaminação (uma boa concentração de partida é de 1 ^ l / 2 cm2 de superfície prato).
Nota: aqui BMMs foram semeadas a 25000 células / poço e de 6 mL de uma% suspensão de esferas foi adicionado ao meio no prato. Isto iguala aproximadamente uma proporção de grânulo / célula de 15:01. A proporção tem de ser ajustado para o tipo de células que é utilizado e ao material do cordão, i.e. esferas de látex têm baixa densidade e não vão para o fundo rapidamente, enquanto esferas de poliestireno pia e entram em contato com as células aderentes muito mais rápido e, portanto, em maior número.
Nota: Dependendo da experiência, que pode ser uma vantagem para seleccionar a região que vai ser observada em avanço. Suspensão de esferas pode então ser adicionado apenas para que a região específica de o fundo da placa de vidro, por conseguinte, aumentando a probabilidade de observar os eventos de absorção favoráveis. - A nuvem densa de esferas podem ser difundido pipetando suavemente a suspensão no fundo da placa de vidro.
- Espere até que os grânulos vão para o fundo do prato de vidro de fundo e estão aproximadamente no mesmo plano com as células fagocíticas aderentes.
- Concentre-se na região de interesse (ROI) e começar a imagem time-lapse.
Nota: Pode ser necessário ajustar o foco enquanto gráfica se encontra em andamento, de acordo com o sistema de imagem que é usado, o seu stabilidade e a mobilidade das células observadas. No entanto, note que isso pode tornar impossível, a análise adequada de phagosomes que fortemente se desviam do plano de foco, como resultado de reorientação.
6. Imagem
Siga as orientações gerais a seguir para a qualidade de imagem ideal;
- Use um sistema de imagem confocal, como um sistema a laser de varredura ou disco giratório.
Nota: A Leica TCS SP5 AOBS Laser confocal microscópio de varredura controlado pelo software Leica LAS AF e equipado com uma câmara de controle ambiental foi usado aqui para imagens de vídeo time-lapse. - Otimizar as configurações de imagem, como velocidade de digitalização, ampliação, resolução, etc. de forma a permitir uma taxa de uma armação em cada 7-20 segundos, dependendo do sistema utilizado.
Nota: Aqui, uma velocidade de varredura de 200 Hz, zoom de 2x e um scanner de linha média de 2 a 3 vezes em uma resolução de 512 x 512 pixels resuLted em um tempo de gravação entre 3-5 seg / rame. A taxa de um quadro em cada 10 segundos foi usado para gravar filmes de lapso de tempo com duração de pelo menos 120 min. - Use as configurações de excitação / emissão adequadas com base no sistema utilizado imagens e sonda (s).
- Otimizar as configurações para evitar excessiva de foto-branqueamento.
Nota: Aqui, o vermelho do Texas dextrano 70kD foi animado utilizando um DPSS (561 nm) e a emissão de luz do laser foi detectado por um detector de híbrido Leica (HYD) a 600-650 nm, com o pico de emissão a 610 nm. Intensidade do laser tem de ser adaptado para a intensidade de sinal e mantido tão baixo quanto possível para minimizar o foto-branqueamento do fluoróforo (s) e foto toxicidade efeito da luz do laser sobre as células. Geralmente, é importante equilibrar a velocidade de varredura, linha média, resolução de digitalização, intervalo do quadro e da duração da imagem para obter a intensidade de sinal adequado e estável e capturar a duração completa de captação de grânulo e phagosome maturação processo.
- Otimizar as configurações para evitar excessiva de foto-branqueamento.
- Incluir uma brilhante campo (BF) canal para observar as contas, se eles não são conjugados com um fluoróforo.
Nota: Para além do canal de Texas Red, canal BF foi utilizado para visualizar as esferas, o mesmo laser DPSS foi usado tal como foi detectado a fonte luminosa e o sinal com um fotomultiplicador (PMT) do detector.
Nota: Certifique-se de aplicar as configurações de gravação idênticos quando a aquisição de dados que está a ser agrupadas. Parâmetros mais importantes são: intensidade do laser de excitação, configuração, definições de detector de aquisição, ampliação e intervalos de quadros. Não usar intervalos de quadros idênticos exigirá um passo curva de média como os pontos de dados de observação não se sobrepõem (por exemplo, para agrupar uma observação com quadros adquiridos a cada 7 segundos com um outro conjunto de quadros a cada 12 segundos). Isso aumentaria os passos necessários para a avaliação dos dados e requer software adicional com função curva-média, como OriginLab 's Origin software Pro estatísticas ( http://www.originlab.com/ ). - De preferência, salvar o vídeo time-lapse no arquivo de formato nativo do sistema de imagens utilizado e evitar exportar em formatos compactados.
Nota: Aqui, os filmes de lapso de tempo foram salvos no formato Leica LAS AF nativo de arquivos, que foram importados diretamente para abrir em Fiji (LIF.). Fiji é capaz de ler os formatos de arquivos nativos da maioria dos fabricantes de microscópios que utilizam o incluída Bio formatos importador plug-in. Exportando o arquivo de filme de lapso de tempo em uma série de imagens com JPG ou TIFF ou como um arquivo de vídeo em formato AVI recipiente não é necessário nem recomendado. Além de preservar a melhor qualidade de imagem possível a partir da observação original, evitando algoritmos de compressão com perdas (por exemplo, JPEG), utilizando o formato de arquivo nativo microscópio assegura que os meta-dados do arquivo (carimbos de tempo, de ampliação, de laser e de aquisição de intensidades, Configurações detector etc) é preservada e disponível para Fiji. No entanto, se por qualquer motivo, os arquivos de vídeo time-lapse precisam ser exportados em um formato diferente para a análise, certifique-se de usar formatos de arquivo sem compressão, como a série de imagens TIFF e cor RGB separados (vermelho, verde, azul) canais já nesta passo, como Fiji, muitas vezes não se pode separar com sucesso o canal de BF de outros canais de cores em arquivos exportados. Além disso, certifique-se de preservar os arquivos originais do microscópio como uma referência.
7. Análise dos Time-lapse Filmes
- Use ImageJ, Fiji ou qualquer outro software que fornece uma capacidade de análise de associação de sinais análogos.
Nota: Aqui, Fiji foi utilizado para a análise de filmes de lapso de tempo. Fiji é uma distribuição ImageJ contendo um pacote de processamento de imagem com menus de ferramentas reorganizados e plug-ins nativos adicionais, disponíveis para download gratuito em http://fiji.sc . O processo descrito nesta seitade iões é apresentado na Figura 2. - Abra o arquivo em Fiji, clicando em "Arquivo", "Abrir" e escolher o arquivo, ou ao arrastar e soltar o arquivo para Fiji.
- Escolha as seguintes opções;
- Empilhe visualização: Vista acumulam com hyperstack,
- As opções de cor: Modo de cor colorida,
- Divisão de canais em janelas separadas: Divisão de canais (para cada canal de cor RGB que foi gravada uma janela separada será aberta).
- No caso de uma série de imagens é para ser usado, coloque a série para Fiji, indo para "Arquivo", "Importar", "Sequência de Imagens" e escolha qualquer arquivo de imagem na pasta que contém a série imagem de destino.
- Defina os filtros e as condições para carregamento imagens selecionadas da série, por exemplo;
- Número de imagens: quantos quadros são para ser carregado.
- A partir da imagem: qual a imagem é o quadro de partida na série.
- Incremento: o incremento entrequadros a serem carregados (cada quadro, cada segundo quadro, etc.).
- O nome do arquivo contém: a filtragem de canal específico usando o nome do arquivo (por exemplo, definindo "c001", que é como normalmente as imagens do "Canal 1" são rotulados após cor-separação de um vídeo time-lapse multicanal).
- Defina os filtros e as condições para carregamento imagens selecionadas da série, por exemplo;
- Remover dimensionamento, indo para "Analisar", "Definir escala ...", marcando a caixa "Global" e clicando em "Clique para remover escala".
Nota: Este passo permite a análise à base de pixel das imagens no caso ampliações diferentes foram utilizadas para os vários conjuntos experimentais que estão a ser avaliadas. Se as configurações de ampliação sempre foram mantidas constantes eo arquivo microscópio nativa foi importado diretamente para Fiji, esta etapa pode ser ignorada, como Fiji possam compreender e utilizar os dados de ampliação de escala e de metadados do arquivo microscópio. - Configure parâmetro de mediçãos, indo para "Analisar", "Definir Medidas" e verificando as seguintes caixas: "Área", "Desvio Padrão", "densidade integrada", "etiqueta de Display" e "valor de cinza média".
- Redirecionar para o canal de cores que contém o sinal da sonda que está a ser medido e confirme com "OK".
- Ir para o quadro, em que as medições devem ser iniciados e seleccionar o canal de janela BF clicando sobre a borda superior da janela.
- Use a "ferramenta de seleção oval" para selecionar uma região de interesse (ROI), ou seja, um ROI circular na esfera internalizado. Assegure-se que a selecção é montado rigidamente até ao bordo exterior do rebordo como se vê no canal de BF.
Nota: Ao usar um PC, segure a tecla Shift enquanto estiver usando a ferramenta de seleção para garantir um ROI circular. - Inicie a medição de forma otimizada alguns quadros antes da imersão total do cordão está concluído e observe oquadro no qual uma nascente talão-phagosome completamente formada é formada eo cálice fagocitária está fechada. Isto deve ser relativamente claramente discernível no canal de BF.
- Vá em "Analisar" e clique em "Measure" para executar a medição, o resultado será exibido em uma janela separada intitulada "Resultados".
- Ir para o quadro seguinte, ajustar a posição do ROI no caso de o cordão se desloca, e repetir a medição. O resultado irá ser adicionado à lista na janela de resultado, cada quadro analisado pode ser identificado com base no valor na coluna "etiqueta".
Nota: Usando as teclas de atalho (por exemplo, "m" para a medida) pode acelerar significativamente o processo de avaliação, ver a lista de atalhos e atribuir os trajes sob o menu "Plugins". - Depois de completar a medição de todos os quadros relevantes, os resultados podem ser copiados para um aplicativo de planilha, como o Microsoft Excel. A coluna "IntDen" descreve o intensities da área selecionada no canal que a medida foi redirecionado para.
8. Correção Branqueamento
Dependendo da sonda utilizada e as definições de imagem, foto-branqueamento pode ocorrer. Dependendo de sua extensão, isto pode afetar fortemente o resultado da avaliação. No entanto, este efeito pode ser parcialmente corrigido pela aplicação de uma taxa igual mas oposto da variação dos valores medidos. Se estiver presente, o coeficiente de foto-branqueamento pode ser calculado medindo a diminuição dependente do tempo, a intensidade de sinal em toda a estrutura, ou área especificamente recortada da moldura, durante o período de tempo relevante para a análise de cada fagossoma. Este processo é ilustrado nas Figuras 3 e 4.
- Sob o menu "Plugins" de Fiji, use o "Time Series Analyzer" plug-in para determinar a diminuição geral em toda a quadro, ou ROI intensidade específica sinal da sonda ao longo do tempo (Figura 3).
Nota: Time Series Analyzer plug-in está disponível para download em http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html , caso ainda não estiver presente no menu Plugins. - Traçar a medida contra o tempo (em segundos) em MS Excel, somente para os quadros que correspondem aos quadros de uma phagosome analisado.
- Aplique uma linha de tendência linear (Figura 4A) para a trama, uma inclinação negativa para o sinal diminuindo indica a presença de efeito de branqueamento foto.
- Aplique a inclinação revertida para valores de um phagosome analisado (Figuras 4B e 4C): intensidade do sinal corrigido (SI) = matéria-SI + (tempo em segundos * inclinação para trás)
Nota: cada um phagosome analisada terá um período de tempo específico (a partir de quadro absorção completa) durante um filme de lapso de tempo gravado, o foto-bleaching deve ser recalculado para esse período específico e será válido apenas para corrigir os valores medidos a partir daquela phagosome específico.
9. Avaliação dos dados
- Agrupar os dados e calcular o erro médio e estatístico dos valores corrigidos de branqueamento em software apropriado.
- Plotar os dados avaliados de uma forma adequada.
Nota: Aqui, as estatísticas científicas e plotagem software GraphPad Prism ( http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ foi usado). Software Prism é capaz de gerar e traçar uma curva média com os indicadores de erro correspondente, desde que todos os dados tenham a mesma taxa de quadros (ou seja, todos foram adquiridos com nos mesmos intervalos, como por exemplo uma estrutura a cada 10 segundos).
Nota: Grandes variações dos valores absolutos SI dentro de repetições do mesmo experimconjunto ent introduzirá muito grande erro estatístico e tornar os dados inutilizáveis. Este pode ser o caso se o protocolo, por exemplo, configurações de imagem, não são mantidas estritamente idêntica entre diferentes repetições da experiência que são para ser coligidos.
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Representative Results
A preparação correcta das células e as pérolas de imagiologia é crítica. Figura 1 mostra o contorno da semeadura, a sonda de carregamento e as etapas iniciais de imagem neste método, com base no nosso protocolo optimizado para BMMs. É, portanto, essencial que os parâmetros de protocolo ser testada e optimizada, dependendo do tipo de células e as sondas que são para ser usados.
Após a adição dos grânulos revestidos com IgG às células pré-carregadas, é importante que o campo de visão é escolhido de forma a proporcionar o maior número de potenciais eventos de absorção no maior número possível de células de, mantendo a configuração de ampliação predefinido do protocolo. Como representado na Figura 2, esta abordagem pode fornecer um maior número de fagossomas analisáveis em cada lapso de tempo vídeo. Além de aumentar os pontos de dados por rendimento vídeo de cada conjunto de experiência, isso diminui a variação introduzida por periphe variandocondições ral e aumenta a robustez dos dados.
Recomenda-se que o procedimento de medição de sinal-associação (Figura 2) ser realizada pela mesma pessoa, e de uma forma cega, se possível. Isto poderia ajudar a reduzir o erro, eliminando várias fontes pessoais de erros e reduzir o preconceito, como o ROI atribuído a cada phagosome deve ser selecionada e movida manualmente após cada quadro.
Embora, naturalmente, a regra de "quanto maior o tamanho da amostra, o melhor" também se aplica aqui, evitamos avaliar mais de 5 talão-phagosome por célula no campo de visão para evitar dar muito peso a uma única célula como o comportamento de todos células dentro da mesma cultura não é necessariamente homogénea 19. Estes phagosomes deve ser seleccionado aleatoriamente tanto quanto possível. Neste contexto, os parâmetros tais como phagosomes ser totalmente visível no plano focal durante todo o tempo de imagiologia e também não estandoafetados pelo branqueamento foto excessiva são essenciais. Além disso, de absorção de um grande número de partículas grandes por uma única célula pode afetar a dinâmica de fusão para os phagosomes em que a célula, por isso deve ser dada a prioridade aos phagosomes que são captados no início do processo por uma "célula vazia" relativamente. Como uma regra geral, as medições médias calculadas a partir de, pelo menos, cinco células a partir de um máximo de cinco experiências independentes (daí, até 25 phagosomes) deve proporcionar uma boa significância estatística.
A aplicação da Análise de Séries ou um método similar para detectar um possível efeito de foto-branqueamento (Figura 3) é muito importante, já que algumas sondas vai sofrer de forte branqueamento, enquanto alguns são muito foto-estável. A etapa de correção de foto-branqueamento (Figura 4) só deve ser aplicada se um efeito de branqueamento forte é observado em todos os experimentos com a mesma sonda. É de notar que este processo só pode corrigir parcialmenteo efeito de branqueamento. Importante, branqueamento excessivo em apenas alguns casos pode ser um sinal de condições não ótimos, como excitação errado ou configurações de imagem, errado pH do meio, as células não saudáveis ou reagentes nonfresh.
Na Figura 5C, o talão-fagossoma indicado com uma seta na Figura 5A e na Figura 5B, é analisada e a intensidade do sinal Dex70kD (SI) para associação amadurecimento fagossoma durante um período de 90 min é traçado. A fonte de ruído na curva é o quadro a quadro variações do sinal medido, devido a fatores como a obstrução do phagosome analisado por outras flutuações phagosome e plano focal. No entanto, a tendência temporal da associação de sinal para o fagossomo é prontamente claro. Após a análise média de 10 phagosomes das duas células visíveis na Figura 5A, uma curva média podem ser representados (Figura 5D) para os quais o e estatísticarror podem ser representados como o erro padrão da média (SEM) ou o desvio padrão (SD), dependendo do tamanho da amostra e as condições experimentais. Enquanto os valores absolutos de SI de a curva média é geralmente diferente da de qualquer único fagossoma analisados, a tendência temporal é normalmente muito semelhante. Após a análise, pode concluir-se que a entrega de Dex70kD como carga lisossomal luminal de Bead-phagosomes em BMMs tipo selvagem atingido um patamar dentro de 35-40 minutos após a fagocitose.
Este método pode, por conseguinte, ser empregue para investigar o efeito quantitativo ou qualitativo de vários factores no processo de maturação do fagossoma.
Figura 1. Preparação das células para a imagem latente. Preprepared BMMs são semeados em um prato de vidro de fundo, pelo menos, 12 horas antes da adiçãode dextrano, uma solução de dextrano em média for adicionado na concentração de 20 ug / ml e incubou-se durante 2-8 horas (carga), as células são lavadas, adicionou-se meio fresco e de células são incubadas durante pelo menos 4 horas (chase), as células são lavado novamente e suspensão de esferas é adicionado um pouco antes do início da imagem. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 2. Instruções passo a passo para a análise de imagens. Depois de carregar o vídeo time-lapse ou sequência de imagens em diferentes canais em Fiji, a avaliação segue estes passos (Note que a figura mostra uma colagem de imagens e não todas as janelas mostradas aqui permanecerão abertas simultaneamente ). (A) Em "Analisar" Menu, pixel adimensionamento distância é reposto no caso dos meta-dados das imagens não estão disponíveis para Fiji, diferentes ampliações foi usado anteriormente em Fiji ou as gravações time-lapse estão em diferentes ampliações, indo até (b) "Set Scale", ( c) assinalando a caixa "Global", que se aplica a reposição de todas as séries imagem posteriormente carregado e clicando em "Clique para remover Scale". (D) Certifique-se de que tanto o campo claro (BF) canal série de imagens (onde Bead-phagosomes são claramente visíveis) e do canal contendo sinal da sonda são carregados e ter as exatas mesmas frame-contagens e dimensões em pixels, por exemplo. duas séries de cada 400 quadros com 450 x 450 pixel dimensões. (E) De acordo com menu "Analisar", parâmetros de avaliação pode ser definido em "Definir Medidas", onde "Área", "densidade integrada" e os parâmetros "rótulo de exibição" têm de ser selecionado. (F (G) Este assegura a medição da intensidade de canal vermelho na mesma região de interesse (ROI) que está indicado pela linha a tracejado e a seta branca no canal vermelho. O ROI Circular é selecionado no canal BF usando a ferramenta de seleção "Oval". (H) Inicie a medição em "Analisar", "medida", ou usando o comando de atalho, e repita para cada quadro de toda a série para o período desejado de experiência (por exemplo, 90 minutos). Em cada quadro, mover e reajustar o local ROI para o talão-phagosome do interesse e note que vai para o próximo quadro na série BF e dar o comando "Measure" automaticamente mede o ROI no quadro correspondente do canal vermelho. (i) Os resultados da mediçãoaparecerá como uma lista na janela "Resultados". Na coluna "Etiqueta", o quadro exato para cada linha esteja claramente identificada, usar isso para verificar a existência de medição repetida de um único quadro ou ignorado quadros em série de imagens de comprimento. (J) O "IntDen" curto para a densidade integrada é o parâmetro de saída crítica; copiar pelo menos a etiqueta e os valores "IntDen" para uma folha de Excel MS para continuar com a avaliação. A unidade de valor IntDen é indefinida e indicado como unidades arbitrárias (UA), este não cria quaisquer problemas desde que os protocolos são estritamente seguido. Barra de escala é de 10 m. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 3. Análise de foto-branqueamento.60; (a) séries Abrir imagem no canal de interesse e verifique se a escala foi removido, se necessário, (b) Em "Plugins" menu do botão (c) "Time Series Analyzer". (D) Utilizando a ferramenta de seleção retangular, desenhe um ROI retangular que cobre quase todo o quadro, ou pelo menos toda a célula de interesse para toda a duração do filme, (e) adicionar o ROI selecionada, (f) clique em "Get Média "e (g) Os resultados serão apresentados no" Time Traces "mesa e" Time Traços Média enredo ". Note, no entanto, que só um (intensidade média) valor "médio" é plotado contra o número do quadro e não o valor "IntDen". (H) Em "Analisar" menu run "Medida", sem alterar quaisquer outros parâmetros, para medir o "IntDen" para o mesmo ROI exatamente no mesmo quadro. Isto vai proporcionar o equivalente a de meuma intensidade de "IntDen", usar este valor para calcular o fator de conversão (igual à "Área") e traçar o "IntDen" do ROI de todo o quadro contra o tempo em segundos em MS Excel. (J) Clique em "List", copie a lista de valores para uma folha de Excel e converter todos os "Mean" valores aos valores "IntDen". Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 4. Correção da foto-branqueamento. Dependendo da sonda utilizada e as definições de imagem, foto-branqueamento pode ocorrer. Isso poderia afetar fortemente o resultado da avaliação. A) valores Raw IntDen (em au) da sonda de todo o quadro são plotados contra o tempo em segundos em MS Excel. Adicionar uma lineareslinha de tendência,.. uma inclinação claramente negativo indica a presença de efeito de branqueamento foto B) Como exemplo, a aplicação do slop revertida no IntDen crua utilizando a fórmula de correção fornece valores IntDen o IntDen corrigido C) corrigidos são parcialmente compensados pela efeito de foto-branqueamento. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 5. Apresentação das células representativas, cinética e cálculo da média do sinal corrigido. A) BMMs carregado com sonda de dextrano, a 0 min após a captação do grânulo de IgG-revestido indicada pela seta. A barra de escala representa 10 um. Corresponde a um filme B) 2.5X zoom inserir a partir de um filme de lapso de tempo, descrevendo a phagosome indicado em um período de 85 minutos após a absorção, o falso-cor para uma melhor visibilidade com look-up-table "Thal" (LUT) no ImageJ. O ROI phagosome medido é indicado com a linha tracejada branca. Os casos de entrega de dextrano e acumulação no fagossomo são indicados com setas brancas. C) Corrigido sinal de fluorescência de Texas Red 70kDa dextrano entregues a partir de lisossomos para o fagossomo indicado. D), calculados valores IntDen fluorescência a partir de 10 phagosomes dentro das duas células indicadas ± SEM . Clique aqui para ver a imagem ampliada .
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Discussion
Na seção seguinte, vamos discutir as etapas críticas do método apresentado e as suas limitações. Além disso, iremos ligar alguns dos problemas comuns com as suas soluções, introdução de modificações possíveis e considerar as vantagens de nosso método, bem como métodos complementares adequadas para esta abordagem.
A preparação dos grânulos, incluindo o acoplamento de IgG para a superfície do grânulo, é essencial e deve ser evitado o uso de preparações unfresh. Em adição a isso, também é fundamental que o dextrano é preparado a partir do estoque congelado (diluído e esterilizados) recém antes de cada experimento. É importante que o carregamento do dextrano segue uma programação precisa para conseguir consistência na incorporação celular e distribuição do compartimento e acumulação. Além disso, é importante usar não só a mesma configuração de microscopia e definições do software, mas também para manter as condições periféricas tão constante quanto possível (por exemplo, temperatura, CO 2, a humidade, a técnica do grânulo-adição, etc.). Outro ponto crítico é a seleção de um campo de visão ou a célula de interesse, a amostra deve ser observado antes do início da imagem, a fim de escolher as células que são representativos.
Uma das principais limitações do método é o número de experiências necessárias para se obter a dimensão das amostras significativas. O método descrito é relativamente longo e de trabalho intensivo, visto que o número de fagossomas observáveis em um campo de visão, dependendo da resolução escolhida, é limitada. Reunir os resultados de um número muito baixo de phagosomes escolhidos aleatoriamente implica o risco de que alguns valores discrepantes extremas podem ter um efeito importante sobre os valores médios. Amostras maiores, por outro lado vai permitir o mascaramento de phagosome-to-phagosome ou variações célula-célula.
Os problemas mais comuns que podem ocorrer incluem contaminação, falta de fagocitose e branqueamento excessivo e fotoefeito de toxicidade devido à luz laser.
Esterilidade, armazenamento e preparação de dextrano adequada são essenciais para evitar contaminações. Na nossa experiência, o dextrano comprado não deve ser considerado como uma solução estéril. O risco de contaminação da amostra pode ser significativamente reduzido em grande centrifugação do estoque e filtração estéril da solução diluída de dextrano. Por outro lado, a preparação da suspensão de esferas normal fresco, o qual contém proteínas e é susceptível a contaminação, pode também reduzir o risco de contaminações.
Falta ou baixos níveis de fagocitose pode ser devido a ilações IgG-revestimento dos grânulos. Portanto, é importante preparar os componentes para o acoplamento de IgG do talão (solução de IgG, EDAC) recentemente e não utilizar os grânulos que são mais do que 4 semanas de idade, ou não foram mantidas exclusivamente a 4 ° C. Uma vez que os grânulos são brevemente sonicada antes da utilização, é recomendado para prepararalíquotas trabalhando para evitar sonicação repetido da suspensão de ações. Outra razão para a menor do que o desempenho esperado fagocítica pode ser insalubre, subótimamente culta ou células velhas; adesão estrita a condições de cultivo recomendadas para o tipo de célula utilizada é, portanto, essencial. Por exemplo, tripsinização excessivo durante a colheita pode danificar os receptores de superfície fagocíticas e prejudicar a capacidade fagocitária.
Excesso de foto-branqueamento pode ser um grande problema com alguns fluoróforos. Ajustando as configurações de microscópio, ou seja, a intensidade da luz de excitação e da duração da exposição da amostra, de acordo com a susceptibilidade de branqueamento do fluoróforo ajuda a controlar o branqueamento. No que diz respeito ao intervalo de tempo entre as aquisições de quadros sucessivos, um equilíbrio entre a taxa de quadros, o que em uma freqüência maior, prevê maior resolução temporal e melhor revelação da dinâmica de interação importantes, eo branqueamento da sonda tem to ser atingidas. O equilíbrio ideal depende principalmente sobre as questões que devem ser abordadas no experimento deu. Ajustando a resolução da digitalização, a freqüência de varredura e linha ou quadro média representam configurações que podem ser alteradas para otimizar ainda mais o tempo de exposição da amostra à luz de excitação. Disponibilidade de algumas destas opções é no entanto determinado pelo tipo de sistema de microscópio que está a ser usado.
As mesmas orientações gerais devem ser seguidas para minimizar o efeito de foto-tóxicas de luz de excitação laser sobre as células. Este efeito pode ser manifestado como a morte das células expostas a luz de laser, durante o processamento de imagens ou um aumento marcado em morfologias artificiais 20.
Aqui apresentamos um método básico e geral, o que permite modificações e adaptação a diferentes configurações experimentais. Como mencionado, este método pode ser utilizado para estudos de perda de função, tal como em modelos knockout,knockdown gene ou expressão da proteína mutante. Também permite que diferentes estratégias de opsonização alvejar receptores específicos fagocíticas, o uso de diferentes sondas endossomal / lisossomal, bem como o estudo de inibidores químicos ou citocinas.
Durante os estudos de expressão com diferentes proteínas de fusão fluorescentes e seus mutantes pode ser utilizada para investigar os efeitos sobre a entrega de uma sonda adequada para fagossomas. Além disso cinética e dinâmica de interação da própria proteína com phagosomes pode ser analisado. Existem várias sondas disponíveis que podem ser utilizados para estes fins. Um exemplo importante da classe comum de sondas incluem o grupo de corantes acidotropic Lyso Tracker, que são amplamente utilizados para rastrear lúmen de protonação de compartimentos endossomais, bem como no lúmen phagosomal. O revestimento dos grânulos oferece outra multiplicidade de possibilidades. Ligantes, incluindo ácidos nucleicos, tais como locais específicos CpG de ADN bacteriano 21, bactericidarial componentes da superfície, tais como LPS, as proteínas, tais como avidina, proteínas do soro, incluindo factores de complemento (por exemplo, C1q ou iC3b) todos pode ser reticulada para grânulos 22-24. Isto permite o estudo da função destes ligandos na fagocitose e maturação do fagossoma. Usando as moléculas de sinalização e mediadores imunes (por exemplo, citocinas) abrir uma outra gama de possibilidades.
Finalmente, este método também pode ser ampliado e adaptado para realizar estudos diretos com microorganismos, por exemplo, comparando a absorção de vs ao vivo ou morto patogênica contra bactérias não patogênicas, embora a forma irregular de bactérias coloca novos desafios durante a análise de imagem.
Futuras aplicações deste método são como colector de como as modificações que podem ser aplicadas. Como próximo passo, os métodos de análise de relação métrica pode ser adaptado. Combinação de pH corantes sensíveis e pH-insensitive fluorescentes para talão de revestimento, ou fazer uso de sondas simples para mediçãoure phagosomal pH (por exemplo, pHrodo, FluoProbes), bem como compostos que tornam possível a seguir experimentalmente a cinética de degradação de proteínas e de lípidos dentro do fagossoma (p.ex. OVA, HRP, albumina de soro bovino e substratos de lipase de triglicéridos) estão disponíveis 25-31. Estes, juntamente possibilitará o estabelecimento de um grande número de abordagens de investigação com base no método básico de imagens de células vivas de phagosomes aqui apresentadas.
O método descrito pode alcançar resoluções temporais muito mais elevados em comparação com métodos que são baseados em fagossoma isolamento 32. ELISA ou Western Blot análises de phagosomes pode representar números muito elevados de eventos em determinados momentos, mas os dados representam uma população muito mais heterogênea e, potencialmente, não sincronizado de eventos. A citometria de fluxo abordagens baseadas teoricamente permitir a análise para o nível de células individuais e em que a forma pode ser menos propenso a hetety de populações de células, mas o problema semelhante de sincronia incerto e a necessidade de contagem de eventos muito elevados para avaliação segura ainda persistem. No entanto, a alta taxa de transferência, sensibilidade e reprodutibilidade de citometria de fluxo aproxima 33,34 torná-los um complemento ideal para a abordagem de imagens de células vivas.
Tomados em conjunto, a vantagem de o nosso método reside na precisão e alta resolução temporal, com a qual phagosomes individuais pode ser seguido no seu processo de maturação em células vivas. Em comparação com todas as outras abordagens que restringem observações ao menos pontos de tempo, em células pré-tratadas e não viáveis, é possível aqui a seguir eventos celulares dinamicamente e continuamente durante longos períodos de tempo sob condições fisiológicas facilmente modificáveis. Pode-se definir os eventos relativos à absorção da carga fagocitária, que permite a discriminação dos estágios de fagocitose mais precisamente. Dessa forma, a sincronização permite não oomente visualizar comportamento semelhante de phagosomes, mas também permite a identificação de diferenças individuais, por exemplo, devido a variações de célula-célula. Mais importante ainda, a dinâmica de interações que podem conter a chave para a compreensão das interações complexas podem ser eficazmente iluminado em alta resolução temporal utilizando a nossa abordagem de imagem de células vivas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a membros do Laboratório de Biologia phagosome para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho é apoiado por uma bolsa de Helmholtz Young Investigator (Iniciativa e os fundos de rede da Associação Helmholtz) e um Programa Prioritário SPP1580 Grant do Conselho de Pesquisa Alemão (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) | PAA, Austria | E15-009 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM) | PAA, Austria | E15-047 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA, Austria | A15-151 | |
| L-Glutamine | PAA, Austria | M11-004 | |
| PBS | PAA, Austria | H15-002 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA, Austria | P11-010 | |
| WillCo-dish® Glass bottom dish (35 mm ∅, #1.5) | WillCo Wells, Netherlands | GWSt-3522 | |
| CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm | Greiner Bio one, Germany | 627871 | Alternative: Available as segmented |
| Carboxylated latex microspheres | Polysciences, USA | #09850 | Available in different diameters, we used 3 μm |
| Polystyrene microparticles | Kisker Biotech, Germany | PPs-3.0COOH | |
| Triton-X 100 | ROTH, Germany | 305.1.3 | |
| mouse whole IgG | Rockland, USA | 010-0102 | |
| EDAC crosslinker | Sigma-Aldrich, USA | E6383-1g | |
| 10 mM Tris | Sigma-Aldrich,USA | T1503 | |
| 1-ml syringe Omnifix -F | B.Braun, Germany | 9161406V | |
| 26 G needle (0.45*25 mm) | B.Baun, Germany | 4657683 | |
| RPMI 1640 | PAA, Austria | E15-039 | |
| Horse Serum | Gibco, USA | 16050-122 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich, USA | M2933 | |
| 0.2 μM syringe mounted filter | Sartorius, Germany | 83.1826.001 |
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