Abstract
Фагоциты играют важную роль в системе врожденного иммунитета путем удаления и ликвидации вторжения микроорганизмов в их фагосом. Фагосомы созревание является сложным и жестко регулируется процесс, при котором зарождается Фагосомы претерпевает радикальные преобразования с помощью хорошо организованных взаимодействий с различных клеточных органелл и отсеков в цитоплазме. Этот процесс, который имеет важное значение для физиологической функции фагоцитирующих клеток по наделяя фагосом с их литических и бактерицидными свойствами, достигает кульминации в слиянии фагосом с лизосом и биогенеза фаголизосомах который считается последним и критический этап созревания для фагосом. В этом докладе мы описываем метод, основанный изображений живых клеток для качественного и количественного анализа динамического процесса лизосом в фагосомы Content Delivery, который является отличительной чертой фаголизосомы биогенеза. Этот подход использует микрошарики IgG-покрытые качестве модели для phagocytosis и флуорофорные-сопряженных декстрана молекулы как просвета лизосом грузов зонда, для того, чтобы следить за динамический доставки контента lysosmal к фагосом в режиме реального времени в живых макрофагов с помощью покадровой обработки изображений и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Здесь мы подробно описать фон, подготовительные шаги и шаг за шагом экспериментальную установку для включения легко и точно развертывание этого метода в других лабораториях. Наша Описанный метод является простой, надежный, а главное, может быть легко адаптирована для изучения phagosomal взаимодействия и созревание в разных системах и при различных экспериментальных условиях, таких как использование различных типов фагоциты, с потерей функции экспериментов, различных датчиков, а фагоцитарные частиц.
Introduction
Профессиональные фагоциты, включая макрофаги, играют решающую роль в иммунной системе. Помимо того, что первая линия обороны в врожденной иммунной системы, они также играют важную роль в активации адаптивного иммунитета через их сигнализации и антигенпредставляющих роль 1-3. В то время как функция профессиональных фагоцитов многогранна, Фагосомы созревания является критическим основой бактерицидного и антигена функции обработки профессиональных фагоцитов 4,5. После опосредованного рецептором охвате и поглощения в фагоцитарной цели, такие как бактерии, возникающий Фагосомы проходит через сложную и хорошо организованной последовательности взаимодействия и обменов с отсеках эндоцитотического сети и нескольких других клеточных органелл 6. Характер соединений обменялись с этими клеточными лиц, а также регулирования и сроки событий слияния определяет просвета phagosomal среду и фагоМембрана состав OMAL и, таким образом, 7, судьба созревания фагосомы 8.
Физиологическое значение фагосомы созревания иллюстрируется разнообразными стратегиями, используемыми различными внутриклеточных патогенов вырваться из, ареста или подорвать фагосомы созревание 9. Большинство из этих стратегий прямо или косвенно предотвратить окончательное и критическую стадию процесса созревания фагосомы: слияние фагосомы с конца эндосомный / лизосомальных отсеков, которые придают им основной массы гидролитических ферментов и антибактериальными факторов зрелой фагосомы 7 , 8,10. Анализ этой заключительной и важный шаг, следовательно, может предоставить нам сильных показателей о состоянии созревания фагосом и если естественное физиологическое состояние положительно или отрицательно быть затронуты в конкретных экспериментальных условиях, что в настоящее время используются.
Покойный эндосомный / лизосомные отсекс, как правило, рассматривается как терминал отсеки эндоцитотического пути, определенные и отличающиеся от ранних эндоцитотических отсеков наличием различных, Стадия конкретных, молекулы-маркеры. Например гидролитических ферментов или мембранные компоненты, такие как Лизосомные связанных мембранных белков (ламп) среди других 11. Терминал эндоцитотический отсеки-отныне называют просто лизосом-также служить в качестве основного места для заключительных этапах пищеварения в конце фагоцитарной / эндоцитотический пути 12. Таким образом, неперевариваемые зонды могут быть загружены через эндоцитоз и макропиноцитозом из внеклеточной среды и транспортируется через эндоцитоза пути к лизосом, где она накапливается 13,14 после выполнения определенного цикла поглощения и охоты. Флуорофора, конъюгированным зонды для флуоресцентной микроскопии, такие как органического полимера неперевариваемые декстрана обычно используются в качестве endocyticprobes 15-17.
14,18.
После описания нашего метода, аналогичные эксперименты могут быть разработаны с использованием модифицированных параметров и факторов, чтобы исследовать их влияние на фагосомы созревания; практически любой OTее тип прикрепленных первичных или клеточных линий клеток фагоцитов, генетическая потеря экспериментов функциональных включая ген нокаут и нокдаун, мутанты или выражение слитых белков, фагоцитарных-мишеней, соединений Microbead покрытия, эндосомный / лизосомальных зондов и факторов такого цитокины, химические ингибиторы или миРНК среди других все переменные, которые могут быть применены к основной подход, предусмотренный этим методом.
Определим цели и основные требования этого метода следующим образом:
- Цель метода: для прямого, количественный и качественный наблюдение и анализ фагосомы созревания с высоким временным разрешением в живых фагоцитарные клетки.
- Фагоцитарная грузов: надлежащим покрытием микрочастиц или биологической мишенью. Здесь мы используем IgG покрытием микрочастиц сферической полистирола 3 мкм, которые легко усвоенные через Fc-γ рецепторов опосредованного фагоцитоза. Кроме того, любой микроорганизм или микрофона с покрытиемroparticle для которых фагоцитарная рецептор присутствует в клетках могут быть использованы.
- Фагоциты: Приверженец фагоциты, выражающие соответствующие фагоцитарные рецепторы. Здесь мы используем мыши первичные BMMs которые обильно выразить FC-γ рецепторы. В качестве альтернативы, можно использовать дендритные клетки (DC), моноциты или фагоцитирующих эпителиальные клетки или их генетические мутанты или нокаут-варианта.
- Лизосомные грузов: флуоресцентно меченных лизосомные зонд. Здесь, Texas Red-конъюгированные 70000 кДа декстран (Dex70kD) используется в качестве просвета грузом лизосомах. Кроме того, любой флуоресцентно детектируемый маркер клеточной органеллы, или отсека, или соответствующего зонда для phagosomal свойств, таких как кислотность или деструктивного мощности, может быть использован для изучения прогрессирования фагосомы созревания.
- Влияние факторов: Например, сигнальных молекул, химических соединений, генной нокдаун или временную экспрессию мутантных белков может. Здесь мы Forgодин использование такого фактора для простоты, но для недавнего примера с мутантной экспрессии белка и бросовым влияющих факторов размещается на Kasmapour др.. 18 Любой фактор, который может повлиять на фагоцитоз или обстоятельства и мобильность фагосом и / или отсеки, которые взаимодействуют с погашением фагосом потенциально могут быть использованы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Уход за животными и все процедуры в этом протоколе следуйте институциональных и национальных руководящих принципов.
Подготовьте препараты, которые указаны на "Π-" заранее.
1. Подготовка BMMs
- Выполнение отбраковывать мышей путем смещени шейных позвонков.
- Удалить бедра и голени кости, бесплатные кости из ткани и отделка оба конца для доступности костном мозге.
- Хранить кости в ледяной PBS или ледяной DMEM среде (не содержащей 100 Е / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина, на льду до следующей стадии.
Примечание: Провести следующие шаги под шкафом класс II биобезопасности, чтобы минимизировать риск заражения. - Флеш медуллярной полости с холодным PBS + пенициллина / стрептомицина с использованием 26 г (0,45 мм) иглы, прикрепленный к 1 мл шприц.
- Гранул клетки осторожным центрифугированием при 350 х г в течение 10 мин, ресуспендируют осадок в BMM Medду, а пластина в стерильной микробиологии непокрытыми чашки Петри.
- Приготовление среды BMM
- Игла в модификации Орлы Средний DMEM
- 10% инактивированной ФТС
- 20% фибробластов мыши L929 клеточной линии культуральный супернатант (источник макрофагального колониестимулирующего фактора, M-CSF)
- 5% лошадиной сыворотки
- 2 мМ глутамина
- Получение клеточной линии L929 культуральной среде;
- RPMI (Мемориал Институт Roswell Park) 1640
- 10% инактивированной ФТС
- 2 мМ глутамина
- Подготовка фибробластов мышей L929 клеточной линии супернатанта культуры;
- Сливной L929 клетки были разделены 1:04, культивировали в 175 см 2 колбы в течение 2 дней с использованием 20 мл L929 среду и культуральный супернатант собирали через 48 часов, фильтруют и добавляют к BMM-среде
- Приготовление среды BMM
- Инкубируйте клетки удаляется избедренная кость в инкубаторе при температуре 37 ° С в 5% CO 2 атмосферы.
- После каждого 48 часов (максимум 72 ч) инкубации, аспирация среду и заменить свежим ВММ среды, на срок до 10 дней. Более 95% клеток были положительны для CD14 как проверено с помощью проточной цитометрии. CD14 является рецептором распознавания выразил основном макрофагами. Определяя процент клеток, позитивных по этим рецептором, чистую культуру адгезивных BMMs был сформирован.
Примечание: подготовить и культура клеток соответственно, если используются другие типы клеток.
2. Покрытие микросферы как фагоцитарной Cargo
- Для приготовления 1 мл борта подвески, используйте 400 мкл 2,5% микрочастиц 3 мкм карбоксилированные полистирол, или альтернативные микрочастиц.
- Перенести шарик суспензии в 1,5 мл трубки микроцентрифужных, промыть 3 раза с PBS и добавьте 100 мкл 500 мМ 2 - (N-морфолино) этановсоль ulfonic натрия кислота, MES буфер при рН 6,7 на бортовое гранул.
- Растворить 50 мкг мыши IgG (поликлональные антитела IgG) в 50 мкл стерильной DDH 2 O и добавляют к суспензии борта.
- Заполните суспензии до 1 мл стерильной DDH 2 O (450 мкл).
- Инкубируйте раствор в течение 15 мин на вращающемся колесе при комнатной температуре.
- Подготовка EDAC сшивающий агент, N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида в концентрации 10 мг / мл и добавляют 14 мкл на бортовое суспензии.
Примечание: EDAC поперечные связи аминогруппами IgG с карбоксильными группами на поверхности гранул и облегчает иммобилизацию IgG на поверхности шарика. Это очень важно для поглощения борта и, следовательно, решение должно быть подготовлено недавно. - Инкубировать суспензии на вращающемся колесе в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Добавить 14 мкл EDAC сшивающего агента и инкубировать суспензии на вращающемся колесе в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Центрифуга суспензии при 10000 х г в течение 2 мин в микроцентрифуге.
- Мыть шарики 3x в стоп-буфера (1% Triton X-100 в 10 мМ Трис, рН 9,4), чтобы остановить реакции сшивки, путем ресуспендирования осадка в стоп-буфера и вращающийся раствора при 10000 х г в течение 2 мин.
- Вымойте бисером 3x в PBS и ресуспендируют осадок в 1 мл PBS.
Дополнительно: Подготовка рабочих аликвоты 30-50 мкл. - не хранить IgG покрытием шарик суспензии при 4 ° С в течение не более 4 недель и никогда не дать суспензии быть заморожены.
Примечание: консервантом, таким как азид натрия в конечной концентрации 0,02% (вес / объем) могут быть добавлены к суспензии для предотвращения роста бактерий и загрязнений. В этом случае стиральная шариков перед его использованием должна быть выполнена, чтобы избежать цитотоксическое действие консерванта. Центрифуга аликвоты суспензии при 10000 х г в течение 2 мин и мыть шарики по ресуспендированием осадка в PBS. Повторите стиральная 3x.
3. Приготовление зонда Декстран исходного раствора
- Растворите Texas Red 70000 килодальтонах декстран (Dex70kD) в PBS при 20 мг / мл и хранят при температуре -20 ° С, в соответствии с инструкциями изготовителя.
Примечание: Держите акции при -20 ° С в течение нескольких месяцев, или при температуре 4 ° С в течение нескольких недель, обратитесь к документации производителей. - Подготовьте декстрана решение для эксперимента со склада разбавлением ее в полной среде DMEM клеточной культуральной среды (DMEM, 10% FCS, 2 мМ L-глутамина) на приблизительно 1 мг / мл (в несколько раз, что концентрированный раствор будет разбавлен до Окончательный рабочий концентрация 20 мкг / мл перед добавлением к клеткам).
- Используйте водяной бани ультразвуковое чтобы разрушать ультразвуком декстрана аликвоты в течение 5 мин для гомогенизации раствора и растворяют агрегаты, которые в дальнейшем могут привести к артефактов поколения во время съемки.
- Центрифуга на максимальной гв течение 5 мин в микроцентрифуге, чтобы удалить любые нерастворенные комочки или загрязняющие вещества из раствора.
- Тщательно перемещать супернатант в чистую пробирку, избегая при этом осадок на дне пробирки и разбавить раствор до конечного рабочего концентрации 20 мкг / мл в полной среде DMEM среде для культивирования клеток.
- Фильтр-стерильный раствор с помощью 0,2 мкм шприц, установленный фильтр с.
4. Декстран Предварительная загрузка
- Семенной клеток в живом изображений клеток со стеклянным дном блюда и инкубировать в течение не менее 12 часов (при 37 ° С в 5% CO 2 атмосферы) для обеспечения привязанность и акклиматизацию.
Примечание: Есть сегментированный стеклянным дном блюда, доступные, которые позволяют выполнять несколько экспериментов (до четырех отсеков) за блюдо. - Подготовьте декстран в растворе DMEM, как описано в Протоколе 3. Прогреть подготовленный декстран в растворе DMEM, с использованием водяной бани при температуре 37 ° С.
- Аспирируйте среднегой добавить декстрана решение к клеткам тщательно и инкубировать при температуре 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы для 2-8 ч в течение поглощения.
Примечание: План и оптимизации протокола в зависимости от типа зонда и клеток, который используется и строго поддерживать на эту продолжительность при повторении эксперимента. Это очень важно для профиля декстрана накопления в эндоцитотического пути и, таким образом воспроизводимости экспериментов. - Вымойте клеток 3x с нагретого полной DMEM среда; аспирации средних и тщательно промыть клетки свежей средой.
- Инкубируйте клетки с полной DMEM среде в течение 4-12 ч при 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы.
- Вымойте клеток один раз нагретого полной фильтруется фенола красного без DMEM среде.
- Для получения оптимальных результатов обработки изображений, изменение нагретого полной фильтруется фенола красного без DMEM среде, по крайней мере 30 минут до начала съемки. Фенол красный может вызвать тушение флуоресцентных сигналов, увеличивая фоновый шум итаким образом, уменьшить контрастность и четкость изображения.
Примечание: Настройте микроскоп и настройки визуализации заранее, в соответствии с запланированного и оптимизированного протокола в зависимости от типа зонда и клеток, которые используются.
5. Добавление бисер IgG-покрытием
- Равновесие аликвоты preprepared 1% шарик суспензии до комнатной температуры и разрушать ультразвуком в водяной бане ультразвука в течение 2-3 мин.
- Добавить 1-6 мкл 1% суспензии борта к полной фильтрованной фенол-красный свободный DMEM среде в шкафу биологической безопасности класс II свести к минимуму риск загрязнения (хорошей отправной концентрации 1 мкл / 2 см2 поверхности тарелки).
Примечание: Здесь BMMs высевали при 25000 клеток / лунку и через 6 мкл 1% запас шарик суспензии добавляли к среде в чашке. Это примерно равно отношение шарик / клеток 15:01. Отношение должно быть отрегулировано с типом клеток, которые используются и в шарик материала; я.э. латексные шарики имеют низкую плотность и не опускаются на дно быстро, в то время как полистирольные гранулы раковиной и вступают в контакт с адгезивными клетками гораздо быстрее и, таким образом, в больших количествах.
Примечание: В зависимости от эксперимента, это может быть преимуществом, чтобы выбрать область, которая будет наблюдаться в заранее. Бисера подвеска может быть добавлена только к этой конкретной области со стеклянным дном блюдо, что увеличивает вероятность наблюдения благоприятные поглощения фотохимических окислителей события. - Плотное облако из бисера может быть распространено, осторожно пипеткой подвеску в стекло нижней блюдо.
- Подождите, пока шарики не опускаются на дно стакана нижней блюдо и примерно в одной плоскости с прилипшие фагоцитов.
- Сосредоточьтесь на интересующей области (ROI) и начать покадровой обработки изображений.
Примечание: Это может быть необходимо, чтобы тонкая настройка фокуса в то время как изображения в прогресс, в зависимости от системы формирования изображения, которая используется, его станцииность и мобильность наблюдаемых клеток. Тем не менее, обратите внимание, что это может вывести невозможно, надлежащего анализа фагосом, что сильно отклоняются от плоскости фокуса в результате переориентации.
6. Изображений
Следуйте общие рекомендации ниже, обеспечивающие оптимальное качество изображения;
- С помощью конфокальной системы визуализации, таких как система лазерного сканирования или вращающегося диска.
Примечание: Leica TCS SP5 AOBS лазерной сканирующей конфокальной микроскопии управляет программное обеспечение Leica LAS AF и оснащен экологического контроля камере используется здесь для видео покадровой обработки изображений. - Оптимизация настроек визуализации, такие как скорость сканирования, увеличения, разрешение и т.д.. таким образом, чтобы обеспечить скоростью кадра в каждом 7-20 сек, в зависимости от используемой системы.
Примечание: Здесь скорость 200 сканирования Гц, 2x зум сканер и линия усреднение 2-3x с разрешением 512 х 512 пикселей RESUlted в времени записи между 3-5 сек / Раме. Скорость кадра в каждом 10 сек был использован для записи покадровой фильмы с длительностью не менее 120 мин. - Используйте соответствующие параметры возбуждения / выбросов, основанные на используемой системе формирования и зонда (ов).
- Оптимизация настроек для предотвращения чрезмерного фото-отбеливание.
Примечание: Здесь Texas Red Декстран 70kD был взволнован использованием DPSS (561 нм) лазера и излучение света была обнаружена с помощью Leica гибридного детектора (гидравлические) на 600-650 нм с пиком излучения на длине волны 610 нм. Интенсивность лазера должна быть адаптирована к интенсивности сигнала и настолько низким, насколько возможно, чтобы минимизировать фото-отбеливание флуорофора (ов) и токсичности фото действием лазерного излучения на клетки. Как правило, важно, чтобы сбалансировать скорость сканирования, линии усреднение, разрешение сканирования, интервал кадров и продолжительность обработки изображений, чтобы получить правильное и устойчивое интенсивности сигнала и захватить полную длительность захвата шарика и фагосомы созревания проналог.
- Оптимизация настроек для предотвращения чрезмерного фото-отбеливание.
- Включите светлого поля (BF) канал для наблюдения за бусы, если они не сопряжен с флуорофором.
Примечание: Кроме Красного канала Техас, BF канал был использован для визуализации шарики, то же самое DPSS лазер был использован в качестве источника света и сигнал был обнаружен с фотографией умножитель (ФЭУ) детектора.
Примечание: Убедитесь, чтобы применить одинаковые параметры записи при приобретении данных, которые должны быть собраны. Наиболее важные параметры: лазерные возбуждения интенсивности, настройка детектора, настройки приобретение, увеличение и интервалы кадров. Не используя идентичные интервалы кадров потребует шаг кривая усреднения как точки данных наблюдений не будут пересекаться (например, собирать наблюдение с кадрами, приобретенных на каждом 7 сек с другим набором с кадрами на всех 12 сек). Это приведет к увеличению шаги, необходимые для оценки данных и требует дополнительного программного обеспечения с функцией кривой усреднения, например OriginLab 'с Происхождение Pro Статистика программное обеспечение ( http://www.originlab.com/ ). - Предпочтительно, сохранить длительная запись на родном файл-формате используемой системы формирования изображения и избежать экспорта в сжатых форматах.
Примечание: Здесь, покадровой фильмы были сохранены в собственном формате Leica LAS AF файлы, которые были затем непосредственно импортного открыть в Фиджи (LIF.). Фиджи является возможность читать родных форматов файлов от большинства производителей микроскопов с помощью входящего в Bio форматы импортера плагин. Экспорт файла покадровой фильм в серии изображений с JPG или TIFF или в виде видеофайла в формате контейнера AVI не требуется и не рекомендуется. В дополнение к сохранению наилучшее качество изображения от первоначального наблюдения, избегая потерями алгоритмы сжатия (например, JPEG), используя родной формат микроскоп файл гарантирует, что мета-данные файла (штампы времени, увеличение, лазерные и приобретение интенсивности, Настройки детектора и т.д.) сохраняется и доступна для Фиджи. Однако, если по какой-либо причине, покадровой видео файлы должны быть экспортированы в другом формате для анализа, не забудьте использовать несжатых форматов, таких как серии TIFF изображений и отдельным цветом RGB (красный, зеленый, синий) каналов уже на этом шаг, как Фиджи, часто не могут успешно отделить BF канал из других цветовых каналов в экспортируемых файлов. Кроме того, убедитесь, чтобы сохранить оригинальные файлы микроскопа в качестве эталона.
7. Анализ покадровой Фильмы
- Используйте ImageJ, Фиджи или любое другое программное обеспечение, которое обеспечивает возможность анализа ассоциации сигнал аналоги.
Примечание: Здесь, Фиджи был использован для анализа покадровой фильмов. Фиджи является распределение ImageJ содержащий пакет обработки изображения с реорганизованных меню инструмента и дополнительных родных плагинов, доступных для свободного скачивания на http://fiji.sc . Способ, описанный в этой сектыион изображен на рисунке 2. - Откройте файл в Фиджи, нажав кнопку "Файл", "Открыть" и выбрать файл, или с помощью перетаскивания файла на Фиджи.
- Выберите следующие параметры;
- Стек осмотр: Посмотреть суммируется с HyperStack,
- Варианты цвета: цветной режим Раскрашенная,
- Сплит каналов в отдельных окнах: Сплит каналов (для каждого RGB цветовой канал, который был записан откроется отдельное окно).
- В случае серии изображение, которые будут использоваться, загрузить серию Фиджи, перейдя в "Файл", "Импорт", "Изображение Последовательность" и выбрать любой файл изображения в папке, содержащей ряд изображения целевой.
- Настройка фильтров и условия для загрузки выбранных изображений в серии, например;
- Количество изображений: сколько кадров должны быть загружены.
- Начиная изображение: какой образ является отправной кадров в серии.
- Увеличение объема: приращение междукадры должны быть загружены (каждый кадр, каждый второй кадр и т.д.)..
- Имя файла содержит: фильтрацию для определенного канала, используя имя файла (например, установив "C001", которая является, как правило, изображения с "Канал 1" помечены после цветовой разделения многоканального покадровой видео).
- Настройка фильтров и условия для загрузки выбранных изображений в серии, например;
- Удалить масштабирование, перейдя в "Анализ", "Установить масштаб ...", установив флажок "Глобальный" и нажать кнопку "Нажмите, чтобы удалить масштаб".
Примечание: Этот шаг позволяет пиксель на основе анализа изображений в случае разные увеличения были использованы для различных экспериментальных наборов, которые должны быть оценены. Если настройки увеличения всегда остается постоянной и файл родной микроскоп был напрямую импортированы в страну Фиджи, этот шаг можно пропустить, как Фиджи могут понять и использовать увеличение и масштабные данные из метаданных файла микроскопа. - Настройте параметр измеренияс, перейдя в "Анализ", "Set Измерения" и следующие флажки: "Площадь", "Стандартное отклонение", "Комплексная плотность", "ярлык Изображение" и "Среднее значение серого".
- Перенаправление на цветовой канал, который содержит сигнал от зонда, который должен быть измерен и подтвердите "OK".
- Перейти в кадре, в котором измерения должен быть начат и выберите окно BF канала, нажав на верхней кромке окна.
- Используйте "овальное выделение функции", чтобы выбрать интересующую область (ROI), т.е. круговой ROI на интернализованной шарик. Убедитесь, что выбор плотно подогнаны к внешнему краю борта, как в видимой BF канала.
Примечание: При использовании ПК, держите Shift-ключ, используя инструмент выделения, чтобы обеспечить круговую ROI. - Начать измерение оптимально несколько кадров перед полном охвате борта выполнены и отметитькадр, в котором полностью сформирован возникающий шарик-Фагосомы формируется и фагоцитарной чашка закрыт. Это должно быть относительно четко распознаваемы в BF канала.
- К "Анализ" и нажмите "Измерить" для выполнения измерений; результат будет отображаться в отдельном окне под названием "Результаты".
- Перейти к следующему кадру, отрегулируйте положение ROI в случае шарик переехал, и повторите измерение. Результат будет добавлен в список в окне результатов, каждый проанализированы кадр может быть идентифицирован на основе значения в колонке "Метка".
Примечание: Используя сочетания клавиш (например, "M" для измерения) может значительно ускорить процесс оценки, см. список ярлыков и назначить костюм них в меню "Плагины". - После завершения измерения всех соответствующих кадров, результаты могут быть скопированы в электронных таблицах, таких как MS Excel. В столбце "IntDen" изображает intensitieс выбранной области в канале, что измерение был перенаправлен в.
8. Отбеливание Исправление
В зависимости от используемого зонда и настройки изображений, фото-отбеливание может произойти. В зависимости от его степени, это может сильно повлиять на исход оценки. Тем не менее, этот эффект может быть частично исправлены путем применения равное, но противоположное скорость изменения к измеренным значениям. Если присутствует, коэффициент фото-отбеливание может быть рассчитана путем измерения нестационарного снижение интенсивности сигнала во всем кадре, или специально обрезанной область кадра, в течение времени пролета, имеющие отношение к анализу каждого фагосомы. Этот процесс изображен на фиг.3 и 4.
- В меню "Плагины" Фиджи, использовать "Время анализатор серии" подключаемый модуль для определения общее снижение всей рамы, или ROI конкретный интенсивность сигнала датчика с течением времени (рис. 3).
Примечание: серии Time Analyzer плагин доступен для скачивания на http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html , в случае уже нет в меню Плагины. - Участок измерение против времени (в секундах) в MS Excel, только для кадров, которые соответствуют рамках анализируемого фагосомы.
- Применить линейный тренд-линии (рис. 4А) с участком; отрицательный наклон для уменьшения сигнала указывает на наличие фото-отбеливающий эффект.
- Примените обратную склону до значений от анализируемого фагосомы (рис. 4В и 4С): Исправлено интенсивность сигнала (SI) = сырой С.И. + (время в секундах * обратный наклон)
Примечание: каждый отдельный проанализированы Фагосомы будет иметь определенный временной промежуток (начиная с полного поглощения кадра) во время записанного покадровой фильма; фото-bleacХин должен быть пересчитан для этого конкретного диапазона и будет действовать только для коррекции измеренных значений от этой конкретной фагосомы.
9. Оценка данных
- Подборка данных и рассчитать среднее и статистическую погрешность значений отбеливающих коррекцией в соответствующее программное обеспечение.
- Участок оцененные данные в соответствующей форме.
Примечание: Здесь, научные статистики и построения программного обеспечения GraphPad Prism ( http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ был использован). Призма программное обеспечение способно генерировать и сюжет среднюю кривую с соответствующими показателями ошибок тех пор, пока все данные имеют одинаковую частоту кадров (т.е. все были приобретены с той же периодичностью, например, один кадр каждые 10 сек).
Примечание: Широкие вариации абсолютных значений СИ в рамках повторов одного и того же ЭксперимЛОР набор познакомит очень большой статистической погрешности и сделать данные непригодными для использования. Это может быть в случае, если протокол, настройки например изображений, не проводятся строго идентичны между различными повторов эксперимента, которые должны быть собраны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Правильная подготовка клеток и бусы для визуализации имеет решающее значение. Рисунок 1 показывает схему посева, зонда-погрузки и первых шагов изображений в этом методе, основанном на нашем оптимизированного протокола для BMMs. Поэтому крайне важно, что параметры протокола быть проверены и оптимизированы в зависимости от типа клеток и зондов, которые должны быть использованы.
После добавления IgG, покрытых шариков к предварительно загруженных клеток, важно, что поле зрения выбирается таким образом, чтобы обеспечить наибольшее число потенциальных событий поглощения в наибольшего числа клеток возможных, сохраняя при этом с установкой заранее определенного увеличения протокола. Как показано на рисунке 2, этот подход может обеспечить большее количество анализируемых фагосом в каждом покадровой видео. В дополнение к увеличению точки данных на видео выходом каждого набора эксперимента, это уменьшает вариацию введен путем изменения peripheRAL условия и повышает надежность данных.
Рекомендуется, чтобы процедура измерения сигнала ассоциация (рис. 2) осуществляться тем же лицом и в слепой образом, если это возможно. Это могло бы помочь уменьшить ошибку, устраняя несколько источников личного ошибках и уменьшения смещения, как ROI присваивается каждому фагосомы должен быть выбран и перемещать вручную после каждого кадра.
Хотя, естественно, правило "чем больше размер выборки, тем лучше", также применимо и здесь, мы избегаем оценки более чем на 5 шарик-фагосомы на ячейку в поле зрения, чтобы предотвратить давая слишком большой вес на одну ячейку, как поведение всех клетки в той же культуре не обязательно однородной 19. Эти фагосомы должен быть выбран случайным образом, насколько это возможно. В этом контексте такие параметры, как быть фагосомы полностью видны в фокальной плоскости для всей продолжительности визуализации, а также не бытьпострадавших от чрезмерного фото отбеливания имеют важное значение. Кроме того, uptaking большое количество крупных частиц по одной ячейке может повлиять на динамику синтеза для фагосом в этой ячейке, так что приоритет должен быть отдан на фагосом, которые uptaken ранее в процессе по относительно "пустой ячейки". Как правило, усредненные измерения с не менее пяти клеток из до пяти независимых экспериментов (отсюда, до 25 фагосом) должна обеспечивать хорошую статистическую значимость.
Применение анализу временных рядов и т.п. на метод обнаружения возможного фото-отбеливающий эффект (рис. 3) очень важно, так как некоторые зонды будут страдать от сильного обесцвечивания а некоторые из них очень фото-стабильным. Коррекция шаг фото-отбеливание (рис. 4) следует применять только тогда, когда сильный отбеливающий эффект наблюдается во всех экспериментах с тем же зондом. Следует отметить, что этот процесс может лишь отчастиэффект отбеливания. Важно отметить, что чрезмерное отбеливание лишь в нескольких случаях может быть признаком неоптимальных условиях, таких как неправильное возбуждения или настройки визуализации, неправильного рН среды, неправильное клеток, или nonfresh реагентов.
На рисунке 5С, шарик-Фагосомы указано стрелкой на рисунке 5А и на фиг.5В, анализируется и интенсивность Dex70kD сигнал (СИ) объединение до созревания фагосомы в течение определенного интервала 90 мин строится. Источником шума в кривой является кадра к кадру вариации измеряемого сигнала за счет таких факторов, как препятствование анализируемого фагосомы другими фагосомы и фокальной плоскости колебаний. Тем не менее, временная тенденция объединения сигнала к фагосомы легко понятно. После усреднения анализ от 10 фагосом из двух клеток видимых на рисунке 5А, кривая средних могут быть построены (рис. 5D), для которых статистическая еrror могут быть построены как стандартная ошибка среднего (SEM) или стандартного отклонения (SD) в зависимости от размера выборки и экспериментальных условиях. В то время как абсолютные значения SI усредненной кривой, как правило, отличается от какого-либо одного анализируемого фагосомы, временная тенденция, как правило, очень похожи. После анализа, можно сделать вывод, что доставка Dex70kD как лизосомные просвета грузов в бортовых-фагосом в диких BMMs типа достигли плато в 35-40 мин после фагоцитоза.
Таким образом, этот способ может быть использован для исследования количественных или качественных влияние различных факторов на фагосомы процесса созревания.
Рисунок 1. Получение клеток для визуализации. Preprepared BMMs высевают в стеклянной нижней тарелки по меньшей мере 12 ч перед добавлениемдекстрана, раствор декстрана в среду добавляют в концентрации 20 мкг / мл и инкубировали в течение 2-8 ч (нагрузка), клетки промывают, добавляют свежую среду и клетки инкубируют в течение по меньшей мере 4 ч (погони), клетки снова промывают и шарик суспензию добавляют непосредственно перед началом съемки. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 2. Пошаговая инструкция для анализа изображений. После загрузки покадровой видео или последовательности изображений в различных каналах на Фиджи, оценка следует в этих шагах (Заметим, что эта цифра изображает изображения коллаж, а не все окна, показанные здесь, останутся открытыми одновременно ). (А) Под "Анализ" меню, пиксельРасстояние масштабирование сбрасывается в случае мета-данные изображения не доступны на Фиджи, разные увеличения ранее использовался на Фиджи или покадровой записи находятся на разных увеличениях, перейдя в (б) "указан Scale", ( в) установив флажок "Global", которая применяется сброс всем впоследствии загруженной серии изображений и нажав на кнопку "Нажмите для удаления окалины". (Г) Убедитесь, что оба светлое поле (BF) серии изображений канала (где шарик-фагосомы четко видны) и канал, содержащий сигнал датчика загружаются и имеют точно такой же кадр-графов и размер в пикселях, например. две серии из каждого 400 кадров с 450 х 450 размер в пикселях. (Е) В меню "Анализ", параметры оценки могут быть установлены в разделе "Набор измерений», где «Район», «Комплексное плотность" и "Этикетка Дисплей" параметры должны быть выбраны. (Е (Г) Это обеспечивает измерение интенсивности красно-канала в том же регионе интереса (ROI), что обозначается пунктирной линии и белой стрелкой в красном-канала. Циркуляр ROI выбран в BF канала с помощью "Овал" инструмент выбора. (H) Начать измерение в разделе "Анализ", "измерения" или с помощью команды быстрого доступа, и повторить для каждого кадра всей серии для желаемой продолжительности эксперимента (например, 90 мин). В каждом кадре двигаться и скорректировать расположение ROI на бортовое-фагосомы интереса и отмечают, что собирается к следующему кадру в серии BF и давая команду "Измерить" автоматически измеряет рентабельность инвестиций в соответствующем кадре красно-канала. (I) Результаты измеренийпоявится в виде списка в окне «Результаты». В столбце "Label", точное рамка для каждой линии четко определены; использовать это, чтобы проверить для повторного измерения одного кадра или пропущенных кадров в длинной серии изображений. (К) "IntDen" сокращение от интегральной плотности является параметром Важнейшим результатом; скопировать хотя бы этикетку и значения "IntDen" в MS Excel листа, чтобы продолжить с оценкой. Единицей стоимости IntDen не определено и указано, как условных единицах (AU), это не создает никаких проблем, пока протоколы строго соблюдаются. Шкала бар составляет 10 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 3. Анализ фото-отбеливание.60; (а) серии Открыть изображение в канале интерес и убедитесь, что масштабы были удалены, если это необходимо, (б) В "Плагины" меню мыши (с) "временных рядов анализатор". (Г) Использование прямоугольное выделение, нарисуйте прямоугольную ROI, охватывающий почти весь кадр, или по крайней мере всю клетку интереса для всей продолжительности фильма, (е) добавить выбранный ROI, (е) нажмите кнопку "Получить Обыкновенный »и (г) Результаты будут отображаться в" Время следы "стол и" Время Следы Средний "сюжет. Однако заметьте, что только "средний" (Средняя интенсивность) значение виде зависимости от количества кадров и не величина "IntDen". (Ч) В разделе "Анализ" меню запустите "Измерить" без изменения других параметров, для измерения "IntDen" за ту же самую ROI в том же кадре. Это обеспечит эквивалент себеинтенсивность в "IntDen", использовать это значение для расчета коэффициента преобразования (равный "Площадь") и земельный участок "IntDen» всей кадра ROI от времени в секундах в MS Excel. (К) Нажмите "Список", скопируйте список значений в листе Excel и конвертировать все »означает« значения к значениям "IntDen". Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 4. Коррекция фото-отбеливания. В зависимости от используемого зонда и настройки изображений, фото-отбеливание может произойти. Это может сильно повлиять на исход оценки.) Значения сырье IntDen (в а.е.) зонда со всей кадра в зависимости от времени в секундах, в MS Excel. Добавить линейнуютренд-линии;.. четко отрицательный наклон указывает на наличие фото-отбеливающий эффект б) в качестве примера применения обратную помои на сырье IntDen помощью коррекции формула дает исправленный IntDen С) скорректированные значения IntDen частично компенсируется Влияние фото-отбеливание. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 5. Презентация представительных клеток, кинетики и усреднения скорректированного сигнала. A) BMMs загружен декстрана зонда в мин 0 на поглощение IgG-покрытый шарик в указанном стрелкой. Шкала бар составляет 10 мкм. Соответствует Movie 1 Б) 2.5X увеличено вставить из покадровой фильм, изображающий указанный фагосомы над пролетом 85 мин после поглощения, ложно-цветные для лучшей видимости с "Тал" Look-Up-таблицы (LUT) в ImageJ. Измеренная Фагосомы ROI указывается с белым пунктиром. Экземпляры декстрана доставки и накопления в фагосомы обозначены белыми стрелками. C) Исправлено флуоресценции сигнал Texas Red 70kDa декстрана доставлено из лизосом в указанный фагосомы. D) Среднемесячная флуоресценции IntDen значения от 10 фагосом в пределах двух указанных клеток ± SEM . Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В следующем разделе мы обсудим важные этапы предложенного метода и его ограничения. Кроме того, мы подключим некоторые из распространенных проблем, с их решениями, ввести возможные изменения и рассмотреть преимущества нашего метода, а также подходящие дополнительные методы для этого подхода.
Приготовление шариков, в том числе сочетания IgG к поверхности шарика, имеет решающее значение, и использование несвежий препаратов следует избегать. В добавок к этому, она также имеет важное значение, что декстран получают из замороженного складе (разбавленной и стерилизованного) недавно перед каждым экспериментом. Важно, что загрузка декстрана следующим образом точный график, чтобы добиться последовательности в клеточное поглощение и распределение отсека и накопления. Кроме того, важно использовать не только такую же установку микроскопии и настройки программного обеспечения, но и сохранить периферийные условия как можно более постоянным (например, теmperature, CO 2, влажность, шарик-дополнение техника, и т.д..). Другим важным моментом является выбор поля зрения или клетки интереса, образец должен быть Неисследован перед началом визуализации, чтобы выбрать ячейки, которые являются репрезентативными.
Одним из главных ограничений метода является ряд экспериментов, необходимых для получения значительных размеров образцов. Описанный метод является относительно времени и работа интенсивная, так как число наблюдаемых фагосом в одном поле зрения, в зависимости от выбранного разрешения, ограничено. Объединение результатов очень низким числом случайно выбранных фагосом влечет за собой риск, что через несколько экстремальные выбросы могут иметь заметную влияние на усредненных значений. Большие размеры выборки, с другой стороны позволит маскирование Фагосомы к фагосомы или от клетки к клетке вариаций.
Общие проблемы, которые могут возникнуть, включают загрязнения, отсутствие фагоцитоза и чрезмерного отбеливания и фотоЭффект токсичность из-за лазерного света.
Бесплодие, надлежащее хранение и подготовка декстрана имеют решающее значение, чтобы избежать загрязнения. По нашему опыту, купленный декстран не следует рассматривать в качестве стерильного раствора. Риск загрязнения образца может быть значительно уменьшено по обширной центрифугированием складе и стерильной фильтрации разбавленной декстрана раствор. С другой стороны, регулярное приготовление свежего шарик суспензии, содержащей белков и подвержен загрязнений, также может снизить риск контаминации.
Отсутствие или низкий уровень фагоцитоза может быть связано с Субоптимальное IgG-покрытие из бисера. Таким образом, важно, чтобы подготовить компоненты для связи IgG борта (раствор IgG, EDAC) недавно и не использовать шарики, которые более чем 4 недели или не были сохранены исключительно при 4 ° С. Поскольку шарики кратко ультразвуком до использования, рекомендуется подготовитьработает аликвоты избежать повторного ультразвуком фондового подвески. Другая причина ниже, чем ожидалось фагоцитарной производительности может быть вредно для здоровья, неоптимально культивируют или старые клетки; строгое соблюдение рекомендуемых условий культивирования для используемого типа клеток имеет огромное значение. Например, чрезмерное трипсинизации во время сбора урожая может привести к повреждению фагоцитарные рецепторы на поверхности и ухудшают фагоцитарную способность.
Чрезмерное фото-отбеливание может быть серьезной проблемой с некоторыми флуорофорами. Настройка параметров микроскопа, т.е. интенсивности возбуждающего света и продолжительности воздействия образца, в соответствии с отбеливающим восприимчивости флуорофора помогает контролировать отбеливание. Что касается временного интервала между приобретением последовательных кадров, баланс между частотой кадров, которая на более высокой частоте обеспечивает высоким временным разрешением и более откровения важных динамики взаимодействия и отбеливания зонда имеет то быть поражен. Оптимальный баланс, прежде всего, зависит от вопросов, которые должны быть рассмотрены в данном эксперименте. Регулировка разрешение сканирования, частоту сканирования и строки или кадра усреднение представляют параметры, которые могут быть изменены в целях дальнейшей оптимизации продолжительность образца воздействия возбуждающего света. Наличие некоторых из этих вариантов, однако, определяется типом системы микроскопа, который используется.
Те же общие принципы должны быть соблюдены, чтобы минимизировать фото токсичен воздействие света лазерного возбуждения на клетки. Этот эффект может проявляться как смерть клеток, подвергшихся воздействию лазерного излучения во время визуализации или заметное увеличение неестественных морфологии 20.
Здесь мы представили собой основополагающий и общий метод, который позволяет за изменения и адаптации к различных экспериментальных условиях. Как уже упоминалось, этот способ может быть использован для с потерей функции исследований, таких как в моделях с нокаутом,Ген нокдаун или выражение мутантный белок. Он также позволяет различные стратегии опсонизации для решения конкретных фагоцитарные рецепторы, использование различных эндосомный / лизосомальных зондов, а также изучение химических ингибиторов или цитокинами.
За экспрессии исследований с различными белками люминесцентные синтеза и их мутантов может быть использован для исследования влияния на поставки соответствующего зонда к фагосом. Кроме того кинетика и динамика взаимодействия самого белка с фагосом могут быть проанализированы. Есть несколько зондов доступны, которые могут быть использованы для этих целей. Ярким примером общего класса зондов включают группу Lysotracker из acidotropic красителей, которые широко используются для отслеживания протонирования просвет эндосомных отсеков, а также phagosomal просвет. Покрытие гранул предлагает другой множество возможностей. Лиганды, в том числе нуклеиновых кислот, таких как специфические сайты CpG бактериальной ДНК 21 bacteальных поверхностные компоненты, такие как ЛПС, белки, такие как авидин, сывороточные белки в том числе факторов комплемента (например C1Q или iC3b) все может быть пересечь связаны с бисером 22-24. Это позволяет изучение роли этих лигандов в фагоцитоза и фагосомы созревания. Использование сигнальных молекул и иммунных медиаторов (например цитокинов) открыть еще ряд возможностей.
И, наконец, этот способ также может быть расширена и адаптирована для проведения прямых исследований с микроорганизмами, например путем сравнения поглощение живой против убиты или патогенный против непатогенных бактерий, хотя неправильной формы бактерий создает новые проблемы во время анализа изображений.
Будущие приложения этого метода заключаются в многообразии также любые изменения, которые могут применяться. В качестве следующего шага, методы анализа соотношение метрике могут быть адаптированы. Сочетание рН чувствительных и рН-нечувствительным люминесцентные красители для бисера-покрытия или с использованием отдельных зондов для МПСЮр phagosomal рН (например pHrodo, FluoProbes), а также соединения, которые дают возможность экспериментально проследить кинетику белка и деградации липидов внутри фагосомы (например OVA, HRP, бычьего сывороточного альбумина и триглицеридлипазы субстратов) доступны 25-31. Они вместе делают возможным создание огромного количества следственных подходов, основанных на основного метода живых клеток визуализации фагосом представленных здесь.
Описанный метод может достичь гораздо более высоких временных резолюций по сравнению с подходами, которые основаны на изоляции фагосомы 32. ИФА или Вестерн-блот анализ фагосом может представлять очень большого числа событий в определенные моменты времени, но данные представляют собой гораздо более пеструю и потенциально несинхронизированный население событий. Проточная цитометрия подходы, основанные теоретически позволяют анализ вплоть до отдельных клеточном уровне, и таким образом может быть менее склонны к heterogeneiти клеточных популяций, но подобная проблема неуверенного синхронности и необходимость очень большого количества ошибок событий для надежной оценки по-прежнему сохраняются. Тем не менее, высокая пропускная способность, чувствительность и воспроизводимость проточной цитометрии подходы 33,34 делают их оптимальным дополнением к подходу изображений живых клеток.
Взятые вместе, преимущество нашего метода заключается в точности и высоким временным разрешением, с которой одиночные фагосомы можно следовать в процессе их созревания в живых клетках. По сравнению со всеми другими подходами, которые ограничивают наблюдений к уменьшению количества временных точках, в нежизнеспособных клеток, предварительно обработанных и, возможно здесь, чтобы следовать клеточных событий динамически и непрерывно в течение длительного периода времени при легко модифицируемых физиологических условиях. Можно было бы определить события по отношению к поглощению фагоцитарной груза, что позволяет дискриминацию из этапов фагоцитоза точнее. Таким образом, синхронизация позволяет не оолько визуализировать подобное поведение фагосом, но и позволяет выявить индивидуальные различия, например, из-за клетки к клетке вариаций. Самое главное, динамика взаимодействий, может дать ключ к пониманию сложных взаимодействий может быть эффективно горит высоким временным разрешением, используя наш подход изображений живых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим членов биологической лаборатории фагосомы за критическое прочтение рукописи. Эта работа поддержана грантом Гельмгольца Молодая следователь (инициатива и Сетевые средств из Гельмгольца) и Программы Priority SPP1580 Грант немецкого исследовательского совета (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) | PAA, Austria | E15-009 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM) | PAA, Austria | E15-047 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA, Austria | A15-151 | |
| L-Glutamine | PAA, Austria | M11-004 | |
| PBS | PAA, Austria | H15-002 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA, Austria | P11-010 | |
| WillCo-dish® Glass bottom dish (35 mm ∅, #1.5) | WillCo Wells, Netherlands | GWSt-3522 | |
| CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm | Greiner Bio one, Germany | 627871 | Alternative: Available as segmented |
| Carboxylated latex microspheres | Polysciences, USA | #09850 | Available in different diameters, we used 3 μm |
| Polystyrene microparticles | Kisker Biotech, Germany | PPs-3.0COOH | |
| Triton-X 100 | ROTH, Germany | 305.1.3 | |
| mouse whole IgG | Rockland, USA | 010-0102 | |
| EDAC crosslinker | Sigma-Aldrich, USA | E6383-1g | |
| 10 mM Tris | Sigma-Aldrich,USA | T1503 | |
| 1-ml syringe Omnifix -F | B.Braun, Germany | 9161406V | |
| 26 G needle (0.45*25 mm) | B.Baun, Germany | 4657683 | |
| RPMI 1640 | PAA, Austria | E15-039 | |
| Horse Serum | Gibco, USA | 16050-122 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich, USA | M2933 | |
| 0.2 μM syringe mounted filter | Sartorius, Germany | 83.1826.001 |
References
- Greenberg, S., Grinstein, S. Phagocytosis and innate immunity. Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).
- Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
- Stuart, L., Ezekowitz, R. Phagocytosis: elegant complexity. Immunity. 22, 539-550 (2005).
- Blander, J. M., Medzhitov, R. On regulation of phagosome maturation and antigen presentation. Nat. Immunol. 7, 1029-1035 (2006).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).
- Vieira, O. V., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: aging gracefully. Biochem. J. 366, 689-704 (2002).
- Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
- Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).
- Luzio, J., Pryor, P., Bright, N. Lysosomes: fusion and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 622-632 (2007).
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30, 3481-3500 (2011).
- Luzio, J. P., et al. Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis. J. Cell. Sci. 113 (pt 9), 1515-1524 (2000).
- Eissenberg, L., Goldman, W. Fusion of lysosomes with phagosomes containing Histoplasma capsulatum: use of fluoresceinated dextran). Adv. Exp. Med. Biol. 239, 53-61 (1988).
- de Souza Carvalho, C., et al. Internalization, phagolysosomal biogenesis and killing of mycobacteria in enucleated epithelial cells. Cell. Microbiol. 13, 1234-1249 (2011).
- Wang, Y. L. Differential and sequential delivery of fluorescent lysosomal probes into phagosomes in mouse peritoneal macrophages. J. Cell Biol. 104, 1749-1754 (1987).
- Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes Fuse with Late Endosomes and/or Lysosomes by Extension of Membrane Protrusions along Microtubules: Role of Rab7 and RILP. Mol. Cell. Biol. 23, 6494-6506 (2003).
- Huynh, K. K., et al. LAMP proteins are required for fusion of lysosomes with phagosomes. EMBO J. 26, 313-324 (2007).
- Kasmapour, B., Gronow, A., Bleck, C., Hong, W., Gutierrez, M. Size-dependent mechanism of cargo sorting during lysosome-phagosome fusion is controlled by Rab34. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20485-20490 (2012).
- Snijder, B., et al. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).
- Knight, M., Roberts, S., Lee, D., Bader, D. Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, 9 (2003).
- Hemmi, H., et al. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature. 408, 740-745 (2000).
- Underhill, D., Ozinsky, A. Toll-like receptors: key mediators of microbe detection. Curr. Opin. Immunol. 14, 103-110 (2002).
- Bohdanowicz, M., Cosío, G., Backer, J., Grinstein, S. Class I and class III phosphoinositide 3-kinases are required for actin polymerization that propels phagosomes. J. Cell Biol. 191, 999-1012 (2010).
- Hoffmann, E., et al. Initial receptor-ligand interactions modulate gene expression and phagosomal properties during both early and late stages of phagocytosis. Eur. J. Cell Biol. 89, 693-704 (2010).
- Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. The kinetics of phagosome maturation as a function of phagosome/lysosome fusion and acquisition of hydrolytic activity. Traffic. 6, 413-420 (2005).
- Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126, 205-218 (2006).
- Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. Recording phagosome maturation through the real-time, spectrofluorometric measurement of hydrolytic activities. Methods Mol. Biol. 531, 157-171 (2009).
- Russell, D., Vanderven, B., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
- Hoffmann, E., et al. Autonomous phagosomal degradation and antigen presentation in dendritic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14556-14561 (2012).
- Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, R., Parish, T., Russell, D. Mycobacterium tuberculosis Responds to Chloride and pH as Synergistic Cues to the Immune Status of its Host Cell. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Aziz, M., Yang, W. -L., Wang, P., et al. Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Current protocols in immunology. Coliganet, J. E., et al. 14, (2013).
- Rogers, L., Foster, L. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18520-18525 (2007).
- Russell, D. G., Vanderven, B. C., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. S. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
- Savina, A., Vargas, P., Guermonprez, P., Lennon, A. -M., Amigorena, S. Measuring pH, ROS production, maturation, and degradation in dendritic cell phagosomes using cytofluorometry-based assays. Methods. Mol. Biol. 595, 383-402 (2010).
