Las células fagocíticas juegan un papel importante en el sistema inmune innato mediante la eliminación y la eliminación de los microorganismos invasores en sus fagosomas. Maduración Fagosoma es el proceso complejo y estrechamente regulado durante el cual un fagosoma naciente se somete a transformación drástica a través de interacciones bien orquestados con diversos orgánulos celulares y los compartimentos en el citoplasma. Este proceso, que es esencial para la función fisiológica de las células fagocíticas dotando fagosomas con sus propiedades líticas y bactericidas, culmina en la fusión de fagosomas con los lisosomas y la biogénesis de fagolisosomas que se considera ser la última y crucial etapa de maduración de los fagosomas. En este reporte se describe un método basado en imágenes de células vivas para el análisis cualitativo y cuantitativo del proceso dinámico de lisosoma al fagosoma de distribución de contenidos, que es un sello distintivo de la biogénesis fagolisosoma. Este enfoque utiliza microperlas recubiertas con IgG como un modelo para phagocytosis y moléculas de dextrano conjugado con fluoróforo como sonda de carga lisosomal luminal, con el fin de seguir la entrega dinámica de contenidos lisosómica de los fagosomas en tiempo real en los macrófagos en vivo utilizando time-lapse y microscopía confocal de barrido láser. A continuación se describe en detalle los antecedentes, los pasos de preparación y la configuración paso a paso experimental para permitir el despliegue fácil y preciso de este método en otros laboratorios. Nuestro método descrito es simple, robusto, y lo más importante, puede ser fácilmente adaptado para estudiar las interacciones phagosomal y maduración en diferentes sistemas y bajo diferentes condiciones experimentales, como el uso de varios tipos de células fagocíticas, experimentos de pérdida de función, diferentes sondas y partículas fagocíticas.
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Artículo de método
Estudio de fagolisosoma Biogénesis en macrófagos en directo
En este artículo
Resumen
Introducción
Fagocitos profesionales, incluyendo macrófagos, juegan un crítico en el sistema inmunológico. Además de ser la primera línea de defensa en el sistema inmune innato, sino que también desempeñan un papel crítico en la activación de la inmunidad adaptativa a través de su señalización y presentadora de antígeno papel 1-3. Mientras que la función de los fagocitos profesionales es multifacética, la maduración del fagosoma es la columna vertebral crítico de la función de procesamiento bactericida y el antígeno de los fagocitos profesionales 4,5. Después de la inmersión y la captación de un blanco fagocítica, tales como bacterias mediada por el receptor....
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Protocolo
Cuidado de los animales y todos los procedimientos en este protocolo siguen las directrices institucionales y nacionales.
Preparar los preparativos que se indican mediante "Π" de antemano.
1. Preparación de BMMs
- Lleve a cabo el sacrificio de los ratones por dislocación cervical.
- Retire fémur y los huesos de tibia, huesos libres desde el tejido y corte los dos extremos de la accesibilidad de la médula ósea.
- Mantener los huesos en PBS enfriado con hielo o medio DMEM enfriado con hielo (suplementado con 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina, en hielo hasta el sigu....
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Resultados
La preparación correcta de las células y los granos para la formación de imágenes es crítico. Figura 1 muestra el esquema de la siembra, la sonda de carga y las etapas iniciales de formación de imágenes en este método, basado en nuestro protocolo optimizado para BMMs. Es esencial por lo tanto, que los parámetros del protocolo de ser probados y optimizados en función del tipo de células y sondas que se van a utilizar.
Después de la adición de las perlas recubiertas con IgG a .......
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Discusión
En la siguiente sección vamos a discutir los pasos críticos del método presentado y sus limitaciones. Además, vamos a conectar algunos de los problemas comunes con sus soluciones, introducir posibles modificaciones y considerar ventajas de nuestro método, así como métodos complementarios adecuados para este enfoque.
La preparación de las perlas, incluyendo el acoplamiento de IgG a la superficie de la perla, es crucial y el uso de preparaciones de filetes debe ser evitado. En adición a eso, t.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Damos las gracias a los miembros del Laboratorio de Biología Fagosoma para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo es apoyado por una beca de Helmholtz Young Investigator (Iniciativa y los fondos de red de la Asociación Helmholtz) y un Programa Prioritario SPP1580 Grant, del Consejo Alemán de Investigación (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) | PAA, Austria | E15-009 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium sin rojo fenol (D-MEM) | PAA, Austria | E15-047 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA, Austria | A15-151 | |
| L-Glutamina | PAA, Austria | M11-004 | |
| PBS | PAA, Austria | H15-002 | |
| Penicilina/Estreptomicina | PAA, Austria | P11-010 | |
| WillCo-dish® Plato con fondo de vidrio (35 mm &vacío;, #1.5) | WillCo Wells, Países Bajos | GWSt-3522 | |
| CELLviewTM plato con fondo de vidrio, 35 mm | Greiner Bio one, Alemania | 627871 | Alternativa: Disponible como |
| microesferas de látex carboxilado | Polysciences, USA | #09850 | Disponible en diferentes diámetros, utilizamos 3 μ m |
| Micropartículas de poliestireno | Kisker Biotech, Alemania | PPs-3.0COOH | |
| Triton-X 100 | ROTH, Alemania | 305.1.3 | |
| ratón entero IgG | Rockland, EE. UU. | 010-0102 | |
| Reticulante EDAC | Sigma-Aldrich, EE. UU. | E6383-1g | |
| 10 mM Tris | Sigma-Aldrich, EE. UU. | T1503 | |
| jeringa de 1 ml Omnifix -F | B.Braun, Alemania | 9161406V | |
| 26 Aguja G (0.45 * 25 mm) | B.Baun, Alemania | 4657683 | |
| RPMI 1640 | PAA, Austria | E15-039 | |
| Suero de caballo | Gibco, EE. UU | 16050-122 | |
| Hidrato MES | Sigma-Aldrich, EE. UU. | M2933 | |
| 0.2 μ M filtro de jeringa | Sartorius, Alemania | 83.1826.001 |
Referencias
- Greenberg, S., Grinstein, S. Phagocytosis and innate immunity. Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).
- Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).
- Iwasaki, A., Medzhit....
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Reimpresiones y permisos
