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Immunology and Infection

Estudio de fagolisosoma Biogénesis en macrófagos en directo

Published: March 10, 2014 doi: 10.3791/51201
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Research Group Phagosome Biology, Helmholtz Centre for Infection Research, 2Division of Mycobacterial Research, National Institute for Medical Research

Abstract

Las células fagocíticas juegan un papel importante en el sistema inmune innato mediante la eliminación y la eliminación de los microorganismos invasores en sus fagosomas. Maduración Fagosoma es el proceso complejo y estrechamente regulado durante el cual un fagosoma naciente se somete a transformación drástica a través de interacciones bien orquestados con diversos orgánulos celulares y los compartimentos en el citoplasma. Este proceso, que es esencial para la función fisiológica de las células fagocíticas dotando fagosomas con sus propiedades líticas y bactericidas, culmina en la fusión de fagosomas con los lisosomas y la biogénesis de fagolisosomas que se considera ser la última y crucial etapa de maduración de los fagosomas. En este reporte se describe un método basado en imágenes de células vivas para el análisis cualitativo y cuantitativo del proceso dinámico de lisosoma al fagosoma de distribución de contenidos, que es un sello distintivo de la biogénesis fagolisosoma. Este enfoque utiliza microperlas recubiertas con IgG como un modelo para phagocytosis y moléculas de dextrano conjugado con fluoróforo como sonda de carga lisosomal luminal, con el fin de seguir la entrega dinámica de contenidos lisosómica de los fagosomas en tiempo real en los macrófagos en vivo utilizando time-lapse y microscopía confocal de barrido láser. A continuación se describe en detalle los antecedentes, los pasos de preparación y la configuración paso a paso experimental para permitir el despliegue fácil y preciso de este método en otros laboratorios. Nuestro método descrito es simple, robusto, y lo más importante, puede ser fácilmente adaptado para estudiar las interacciones phagosomal y maduración en diferentes sistemas y bajo diferentes condiciones experimentales, como el uso de varios tipos de células fagocíticas, experimentos de pérdida de función, diferentes sondas y partículas fagocíticas.

Introduction

Fagocitos profesionales, incluyendo macrófagos, juegan un crítico en el sistema inmunológico. Además de ser la primera línea de defensa en el sistema inmune innato, sino que también desempeñan un papel crítico en la activación de la inmunidad adaptativa a través de su señalización y presentadora de antígeno papel 1-3. Mientras que la función de los fagocitos profesionales es multifacética, la maduración del fagosoma es la columna vertebral crítico de la función de procesamiento bactericida y el antígeno de los fagocitos profesionales 4,5. Después de la inmersión y la captación de un blanco fagocítica, tales como bacterias mediada por el receptor, el fagosoma naciente pasa a través de una secuencia compleja y bien orquestada de la interacción y los intercambios con compartimentos de la red endocítica y varios otros orgánulos celulares 6. La naturaleza de los compuestos intercambia con estas entidades celulares, así como la regulación y el calendario de eventos de fusión determina el medio phagosomal luminal y los fagoscomposición omal membrana y, por tanto, 7, el destino del fagosoma maduración 8.

La importancia fisiológica de la maduración del fagosoma se ejemplifica con las diversas estrategias empleadas por diversos patógenos intracelulares escapar, arrestar o subvertir fagosoma maduración 9. La mayoría de estas estrategias de evitar directa o indirectamente la etapa final y crítica del proceso de maduración fagosoma: la fusión de fagosoma con compartimientos endosomal / lisosomales finales de los años, que los dota de la mayor parte de las enzimas hidrolíticas y factores anti-bacterianas de un fagosoma madura 7 , 8,10. El análisis de este paso final y crítico, por tanto, nos puede proporcionar fuertes indicadores sobre el estado de maduración de los fagosomas, y si el estado fisiológico natural está siendo positiva o negativamente afectado bajo las condiciones experimentales particulares que se están utilizando.

El compartimento tarde endosomal / lisosomals son generalmente considerados como los compartimentos de terminales de la vía endocítica, definidos y distinguidos de los primeros compartimentos endocítica por la presencia de varios, Escenario, moléculas marcadoras específicas. Por ejemplo enzimas hidrolíticas o componentes de membrana tales como proteínas de la membrana lisosomal asociados (lámparas), entre otros 11. El terminal endocítica que se refiere compartimentos-de ahora en adelante simplemente como lisosomas-también sirven como la ubicación principal para las etapas finales de la digestión en el extremo de la fagocítica / endocítica vía 12. De esta manera, las sondas no digeribles se pueden cargar a través de endocitosis y macropinocitosis desde el medio extracelular y se transportan a través de la vía endocítica a los lisosomas, donde se acumula 13,14 después de seguir un ciclo definido de captación y Chase. Sondas conjugado con fluoróforo para microscopía fluorescente tal como el dextrano polímero orgánico no digerible se utilizan comúnmente como endocyticprobes 15-17.

14,18.

Después de la descripción de nuestro método, experimentos análogos pueden ser diseñados utilizando la configuración y factores modificados para investigar su influencia sobre la maduración fagosoma; prácticamente cualquier OTsu tipo de células fagocíticas primarios o de líneas de células adherentes, la pérdida genética de los experimentos de la función incluyendo genes knock-out y knock-down, mutantes o expresión de proteínas de fusión, fagocíticas-objetivos, compuestos de revestimiento microbead, sondas endosomal / lisosomales y factores como un citoquinas, inhibidores químicos, o ARNsi entre otros son todas las variables que se pueden aplicar para el enfoque básico de este método.

Definimos el objetivo y los requisitos básicos de este método de la siguiente manera:

  • Objetivo del método: para permitir la observación directa, cuantitativa y cualitativa y el análisis de la maduración del fagosoma con alta resolución temporal en las células fagocíticas viviente.
  • Fagocítica de carga: Una micropartícula adecuadamente recubiertos o diana biológica. Aquí se utiliza recubiertas de IgG-3 micras micropartículas esféricas de poliestireno que se internalizan fácilmente mediante el receptor de Fc-γ fagocitosis mediada. Alternativamente, cualquier microorganismo o micrófono revestidoroparticle para que un receptor fagocítico está presente en las células se puede utilizar.
  • Las células fagocíticas: células fagocíticas adherentes que expresan los receptores fagocíticas apropiados. Aquí usamos primarias BMMs de ratón que expresan abundantemente los receptores Fc-γ. Alternativamente, se podrían utilizar células dendríticas (DC), monocitos o células epiteliales fagocíticas o sus mutantes o variantes genéticos knock-out.
  • Lysosomal de carga: Una sonda lisosómico marcado con fluorescencia. Aquí, Texas conjugado-Rojo 70000 kilodaltons de dextrano (Dex70kD) se utiliza como la carga luminal de los lisosomas. Alternativamente, cualquier marcador fluorescente detectable de un compartimiento celular o de orgánulos, o una sonda apropiada para las propiedades phagosomal tales como la acidez o de degradación de la capacidad, se podría utilizar para estudiar la progresión de la maduración del fagosoma.
  • Factores de influencia: por ejemplo, las moléculas de señalización, compuestos químicos, genes knock-down, o la expresión transitoria de proteínas mutantes podían. Aquí, hemos forguno el uso de ese factor en aras de la simplicidad, pero para un ejemplo reciente con la expresión de la proteína mutante y derribo factores que influyen en favor ven Kasmapour et al. 18 Cualquier factor que puede afectar la fagocitosis o por las circunstancias y la movilidad de los fagosomas y / o los compartimentos que interactúan con los fagosomas vencimiento podrían ser utilizadas.

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Protocol

Cuidado de los animales y todos los procedimientos en este protocolo siguen las directrices institucionales y nacionales.

Preparar los preparativos que se indican mediante "Π" de antemano.

1. Preparación de BMMs

  1. Lleve a cabo el sacrificio de los ratones por dislocación cervical.
  2. Retire fémur y los huesos de tibia, huesos libres desde el tejido y corte los dos extremos de la accesibilidad de la médula ósea.
  3. Mantener los huesos en PBS enfriado con hielo o medio DMEM enfriado con hielo (suplementado con 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina, en hielo hasta el siguiente paso.
    Nota: Lleve a cabo los siguientes pasos bajo un gabinete de bioseguridad clase II para minimizar el riesgo de contaminación.
  4. Enjuague la cavidad medular con PBS frío + penicilina / estreptomicina usando un 26 G (0,45 mm) aguja unida a una jeringa de 1 ml.
  5. Precipitar las células por centrifugación suave a 350 g durante 10 min, resuspender el precipitado en med BMMio y la placa en microbiología estéril no revestidos placas de Petri.
    1. Preparación del medio de BMM
      • Eagles Modificado de Dulbecco medio DMEM
      • 10% de FCS inactivado
      • 20% de fibroblastos de ratón línea celular L929 sobrenadante de cultivo (fuente de factor estimulante de colonias de macrófagos, M-CSF)
      • 5% de suero de caballo
      • 2 mM de glutamina
    2. Preparación del medio de cultivo línea celular L929;
      • RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640
      • 10% de FCS inactivado
      • 2 mM de glutamina
    3. Preparación de ratón fibroblastos L929 línea celular sobrenadante del cultivo;
      • Células confluentes L929 se dividieron 1:04, cultivadas en 175 cm 2 frascos de 2 días utilizando 20 ml de medio de L929 y el sobrenadante de cultivo se recogió después de 48 h, se filtró y se añaden a la BMM-medio
  6. Se incuban las células enrojecidos porel fémur en una incubadora a 37 ° C en 5% de CO 2 atmósfera.
  7. Después de cada 48 horas (máximo 72 horas) de la incubación, aspirar el medio y reemplazar por medio BMM fresca, para un máximo de 10 días. Más del 95% de las células fueron positivas para CD14 como probado por citometría de flujo. CD14 es un receptor de reconocimiento de patrones expresado principalmente por los macrófagos. Al determinar el porcentaje de células positivas para este receptor, un cultivo puro de BMMs adherentes se ha generado.

Nota: preparar y cultivar las células en consecuencia si se utilizan otros tipos de células.

2. Recubrimiento de Microbeads como fagocítica Cargo

  1. Para la preparación de 1 ml de suspensión de perlas, utilizar 400 l de 2,5% 3 m micropartículas de poliestireno carboxiladas o micropartículas alternativos.
  2. Transferir la suspensión de perlas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, lavar 3x con PBS y se añaden 100 l de 500 mM de 2 - (N-morfolino) etanossal sódica del ácido ulfonic, tampón MES a pH 6,7 al sedimento de perlas.
  3. Disolver 50 g de IgG de ratón (anticuerpo IgG policlonal) en 50 l estéril ddH2O y añadir a la suspensión de perlas.
  4. Rellene la suspensión hasta 1 ml con ddH 2 O estéril (450 l).
  5. Incubar la solución durante 15 min en una rueda giratoria a temperatura ambiente.
  6. Preparar un EDAC reticulante, N-(3-dimetilaminopropil)-clorhidrato de N'-etilcarbodiimida en una concentración de 10 mg / ml y añadir 14 l de la suspensión de microesferas.
    Nota: EDAC enlaces cruzados grupos amino de la IgG con los grupos carboxilo en la superficie de las perlas y facilita la inmovilización de la IgG en la superficie de la perla. Esto es crítico para la captación de talón y por lo tanto, la solución debe prepararse recientemente.
  7. Incubar la suspensión en una rueda giratoria durante 1 hora a TA.
  8. Añadir 14 l de un EDAC reticulante y se incuba la suspensión en una rueda giratoria durante 1 hora a TA.
  9. Centrifugar la suspensión a 10.000 xg durante 2 min en una microcentrífuga.
  10. Lavar el perlas 3 veces en tampón de parada (1% de Triton X-100 en 10 mM Tris, pH 9,4) con el fin de detener la reacción de reticulación, resuspendiendo el sedimento en tampón de parada y girar la solución a 10.000 xg durante 2 min.
  11. Lavar perlas de 3x en PBS y resuspender el sedimento en 1 ml de PBS.
    Opcional: Preparar alícuotas de trabajo de 30 a 50 l.
  12. Guarde la suspensión de perlas con recubrimiento de IgG a 4 º C durante no más de 4 semanas y nunca permita la suspensión a congelar.

Nota: un conservante tal como azida de sodio a una concentración final de 0,02% (w / v) puede ser añadido a la suspensión para evitar el crecimiento bacteriano y la contaminación. En este caso, el lavado de las perlas antes de su uso se tiene que realizar para evitar los efectos citotóxicos de la conservante. Centrifugar una parte alícuota de la suspensión a 10.000 xg durante 2 min y lavar las perlas por REsuspender el sedimento en PBS. Repita el lavado 3 veces.

3. Preparación de la solución madre de dextrano Sonda

  1. Disolver el Rojo Texas 70000 kiloDaltons dextrano (Dex70kD) en PBS a 20 mg / ml y almacenar a -20 ° C, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    Nota: Mantenga las existencias a -20 ° C durante un máximo de varios meses, o bien a 4 º C durante varias semanas, consulte la documentación de los fabricantes.
  2. Preparar la solución de dextrano para el experimento del stock de diluyéndolo en medio completo de cultivo celular DMEM (DMEM, 10% de FCS, 2 mM de L-glutamina) a aproximadamente 1 mg / ml (varias veces solución concentrada que se diluye a la concentración de trabajo final de 20 g / ml antes de la adición a las células).
  3. Use un baño de agua de ultrasonido para sonicar la alícuota de dextrano durante 5 minutos para homogeneizar la solución y disolver los agregados que más tarde podrían dar lugar a la generación de artefactos durante la exploración.
  4. Centrifugar a máxima gdurante 5 min en una microcentrífuga para eliminar los grumos o contaminantes no disueltos de la solución.
  5. Mover con cuidado el sobrenadante a un tubo nuevo evitando al mismo tiempo el sedimento en la parte inferior del tubo y diluir la solución a la concentración de trabajo final de 20 g / ml en medio completo de cultivo celular DMEM.
  6. -Filtro estéril de la solución utilizando un filtro de 0,2 micras jeringa montada.

4. El dextrano precarga

  1. Se siembran las células en una imagen de células plato con fondo de cristal en vivo y se incuba durante al menos 12 horas (a 37 ° C en el 5% atmósfera de CO 2) para asegurar el apego y la aclimatación.
    Nota: Hay platos de cristal segmentado inferiores disponibles que permiten la realización de múltiples experimentos (hasta cuatro compartimientos) por plato.
  2. Prepare el dextrano en solución DMEM como se describe en el Protocolo 3. Caliente el dextrano preparado en solución DMEM, usando un baño de agua a 37 ° C.
  3. Aspirar medio de unnd añadir solución de dextrano a las células cuidadosamente y se incuba a 37 ° C en 5% de CO 2 atmósfera durante 2-8 horas para la absorción.
    Nota: Planificar y optimizar el protocolo basado en la sonda y tipo de célula que se utiliza y mantener estrictamente a esta duración al repetir los experimentos. Esto es esencial para el perfil de la acumulación de dextrano en la vía endocítica y por lo tanto la reproducibilidad de los experimentos.
  4. Lavar las células 3 veces con medio completo DMEM precalentado; medio aspirado y enjuague células cuidadosamente con medio fresco.
  5. Se incuban las células con medio completo DMEM durante 4-12 horas a 37 ° C en 5% de CO 2 atmósfera.
  6. Lave las células una vez con medio DMEM sin rojo fenol filtrada completa precalentado.
  7. Para obtener resultados óptimos de imagen, cambio de precalentado fenol filtrada medio completo DMEM libre de rojo de al menos 30 minutos antes del inicio de la proyección de imagen. Rojo fenol puede causar extinción de señales fluorescentes, lo que aumenta el ruido de fondo ypor lo tanto reducir el contraste y claridad de imagen.

Nota: Configure el microscopio y los ajustes de imagen de antelación, según el protocolo previamente planificada y optimizada en función del tipo de sonda y las células que se utilizan.

5. Adición de perlas recubiertas con IgG

  1. Equilibrar una alícuota de preprepared 1% suspensión de perlas a temperatura ambiente y someter a ultrasonidos en un baño de agua de ultrasonidos durante 2-3 min.
  2. Añadir 1-6 l de la suspensión de cuentas 1% al medio DMEM libre completa filtrada de fenol rojo debajo de un gabinete de bioseguridad de clase II para minimizar el riesgo de contaminación (una buena concentración inicial es de 1 l / 2 cm2 de superficie de plato).
    Nota: Aquí BMMs se sembraron a 25.000 células / pocillo y un 6 l de 1% de suspensión de stock de talón se añadió al medio en el plato. Esto equivale aproximadamente a una relación grano / celular de 15:01. La relación tiene que ser ajustado al tipo de las células que se utiliza y al material de bolas; i.e. perlas de látex tienen una baja densidad y no se hunden hasta el fondo con rapidez, mientras que las perlas de poliestireno se hunden y se ponen en contacto con las células adherentes mucho más rápido y por lo tanto en mayor número.
    Nota: En función de la experiencia, puede ser una ventaja para seleccionar la región que se observará con antelación. Suspensión de perlas se puede añadir sólo a esa región específica de la placa de fondo de cristal, por lo tanto, el aumento de la probabilidad de observar eventos de captación favorables.
  3. La densa nube de perlas se puede difundir pipeteando suavemente la suspensión en el plato de fondo de vidrio.
  4. Esperar hasta que los granos se hunden hasta el fondo de la placa inferior de vidrio y están aproximadamente en el mismo plano con las células fagocíticas adherentes.
  5. Centrarse en la región de interés (ROI) e iniciar el time-lapse.

Nota: Puede ser necesario ajustar el enfoque mientras la imagen está en curso, en función del sistema de imagen que se utiliza, su estaciónbilidad y la movilidad de las células observadas. Sin embargo, tenga en cuenta que esto puede hacer imposible, el adecuado análisis de los fagosomas que se desvían fuertemente desde el plano de enfoque, como resultado de la reorientación.

6. Imaging

Siga las siguientes indicaciones generales para la calidad de imagen óptima;

  1. Utilice un sistema de imagen confocal, como un sistema de escaneo láser o spinning disco.
    Nota: Se utilizó un Leica TCS SP5 AOBS láser microscopio confocal de barrido controlado por el software Leica LAS AF y equipado con una cámara de control ambiental aquí para obtener imágenes de vídeo time-lapse.
  2. Optimizar los ajustes de imagen como la velocidad de exploración, ampliación, resolución, etc. de una manera para permitir una tasa de una trama en cada 7-20 segundos, dependiendo del sistema utilizado.
    Nota: Aquí, una velocidad de 200 Hz de barrido, zoom 2x escáner y un promediado línea de 2 a 3 veces a una resolución de 512 x 512 píxeles resuLted en un tiempo de grabación entre 3-5 seg / rame. Se utilizó una tasa de un fotograma de cada 10 segundos para grabar películas a intervalos con una duración de al menos 120 min.
  3. Utilice los ajustes de excitación / emisión adecuadas en función del sistema utilizado de imágenes y sonda (s).
    1. Optimizar los ajustes para evitar la excesiva foto-blanqueo.
      Nota: En este caso, el Texas Red dextrano 70 kDa estaba emocionado usando un DPSS (561 nm) de luz láser y la emisión fue detectado por un detector híbrido Leica (HYD) a 600-650 nm, con el pico de emisión a 610 nm. Intensidad del láser tiene que adaptarse a la intensidad de la señal y debe mantenerse lo más bajo posible para reducir al mínimo la foto-blanqueo del fluoróforo (s) y la imagen un efecto de toxicidad de la luz láser sobre las células. En general, es importante equilibrar la velocidad de exploración, con un promedio de línea, resolución de escaneado, el intervalo de fotogramas y la duración de la proyección de imagen para obtener una intensidad de señal adecuada y estable y la captura de la duración completa de la captación del grano y maduración pro fagosomaproceso.
  4. Incluir un canal de campo brillante (BF) para la observación de las perlas si no se conjugan con un fluoróforo.
    Nota: Al lado de la canal Rojo de Texas, se utilizó canal de BF para visualizar las perlas, el mismo láser DPSS se utiliza como se detectó la fuente de luz y la señal con un fotomultiplicador (PMT) del detector.
    Nota: Asegúrese de aplicar los ajustes de grabación idénticos en la adquisición de datos que se va a cotejar. Parámetros más importantes son: la intensidad del láser de excitación, la fijación de detector, los ajustes de adquisición, ampliación y intervalos de trama. No usar intervalos de trama idénticos requerirá un paso de curva de promedio como los puntos de datos de observación no se solaparán (por ejemplo, para cotejar una observación con marcos adquiridos en cada 7 segundos con otro conjunto con marcos en cada 12 seg). Esto aumentaría los pasos necesarios para la evaluación de datos y requerir software adicional con función de curva de promediación, tales como OriginLab 's Origen software Pro estadísticas ( http://www.originlab.com/ ).
  5. Preferiblemente, guardar el video time-lapse en el formato de archivo nativo del sistema de imagen utilizado y evitar la exportación en formatos comprimidos.

Nota: Aquí, películas a intervalos se guardan en el formato Leica LAS AF nativa archivos, que luego fueron importados directamente para abrir en Fiji (LIF.). Fiji es capaz de leer los formatos de archivos nativos de la mayoría de fabricantes de microscopios utilizando el incluido Bio formatos importador de plug-in. Exportar el archivo de película de lapso de tiempo en una serie de imágenes con formato JPG o TIFF o como un archivo de vídeo en un formato contenedor AVI no es necesario ni recomendable. Además de preservar la mejor calidad de imagen posible de la observación original evitando algoritmos de compresión con pérdida (por ejemplo, JPEG), utilizando el formato de archivo nativo microscopio asegura que las intensidades de los meta-datos del fichero (sellos de tiempo, de ampliación, de láser y de adquisición, La configuración del detector, etc) se conserva y está disponible para Fiji. Sin embargo, si por cualquier razón, los archivos de video de lapso de tiempo deben ser exportados en un formato diferente para el análisis, asegúrese de usar los formatos de archivo sin comprimir, como serie de imágenes TIFF y color RGB por separado (rojo, verde, azul) canales ya en esta paso, como Fiji menudo no puede separar con éxito el canal BF de otros canales de color en archivos exportados. Además, asegúrese de conservar los archivos originales de microscopio como referencia.

7. El análisis de los Time-lapse películas

  1. Utilice ImageJ, Fiji o cualquier otro software que proporciona una capacidad de análisis de asociación de señales análogos.
    Nota: Aquí, Fiji se utilizó para el análisis de películas a intervalos. Fiji es una distribución ImageJ que contiene un paquete de procesamiento de imágenes con los menús de herramientas reorganizadas y los plug-ins nativos adicionales, disponibles para su descarga gratuita en http://fiji.sc . El proceso descrito en esta sectade iones se representa en la Figura 2.
  2. Abra el archivo en Fiji haciendo clic en "Archivo", "Abrir" y elegir el archivo o arrastrando y soltando el archivo en Fiji.
  3. Elija entre las siguientes opciones;
    1. Pila de arte: Ver apila con HyperStack,
    2. Opciones de color: modo de coloreado de color,
    3. Canales Dividir en ventanas separadas: canales en Split (para todos los colores canales RGB que se grabó se abrirán una ventana separada).
  4. En el caso de una serie de imágenes se va a utilizar, cargue la serie a Fiji, vaya a "Archivo", "Importar", "Secuencia de imágenes" y elige cualquier archivo de imagen en la carpeta que contiene la serie de imagen de destino.
    1. Filtros y las condiciones de carga de las imágenes seleccionadas de la serie, por ejemplo Set;
      1. Número de imágenes: la cantidad de fotogramas que desea cargar.
      2. Imagen de inicio: la que la imagen es el marco de partida de la serie.
      3. La subasta: el incremento entremarcos para cargarse (cada cuadro, cada segundo fotograma, etc.).
      4. Nombre de archivo contiene: el filtrado de canal específico usando el nombre del archivo (por ejemplo, mediante el establecimiento de "c001", que es como normalmente se etiquetan las imágenes de "Channel 1" después de la separación de color de un time-lapse video multicanal).
  5. Retire la escala, vaya a "Analizar", "Set escala ...", marcando la casilla "Global" y haciendo clic en "Haga clic para eliminar escamas".
    Nota: Este paso permite que el análisis basado en píxeles de las imágenes en caso de diferentes aumentos han sido utilizados para los distintos juegos de experimentos que se van a evaluar. Si los ajustes de ampliación siempre se han mantenido constantes y el archivo microscopio nativo fue importado directamente a Fiji, este paso se puede omitir, como Fiji puede entender y usar los datos de aumento de escala y de los metadatos del archivo microscopio.
  6. Establecer parámetros de medicións, vaya a "Analizar", "Medidas Set" y marcar las siguientes casillas: "Área", "desviación estándar", "densidad integrado", "etiqueta Display" y "valor de gris medio".
  7. Redireccionar el canal de color que contiene la señal de la sonda que se va a medir y confirmar con "OK".
  8. Ir al marco en el que las mediciones se deberían de empezar y seleccionar la ventana del canal BF haciendo clic en el borde superior de la ventana.
  9. Utilice la opción "herramienta de selección ovalada" para seleccionar una región de interés (ROI), es decir, un ROI circular sobre la perla interiorizado. Asegúrese de que la selección está estrechamente ajustados hasta el borde exterior de la perla como visible en el canal de BF.
    Nota: Si utiliza un PC, mantenga la tecla Shift mientras se utiliza la herramienta de selección para garantizar un ROI circular.
  10. Inicie la medición óptima unos cuantos fotogramas antes de la inmersión total de la perla se completa y tenga en cuenta lamarco en el que se forma un cordón de naciente-fagosoma completamente formado y la copa fagocítica está cerrado. Esto debería ser relativamente claramente discernible en el canal de BF.
  11. Pulsa en "Analizar" y haga clic en "Measure" para ejecutar la medida, el resultado se mostrará en una ventana separada titulada "Resultados".
  12. Ir al siguiente fotograma, ajuste la posición del retorno de la inversión en caso de que el grano se ha movido, y repetir la medición. El resultado será añadido a la lista en la ventana de resultado; cada trama analizada puede ser identificado basándose en el valor en la columna "Etiqueta".
    Nota: El uso de teclas de acceso directo (por ejemplo, "M" para la medida) puede acelerar significativamente el proceso de evaluación, ver la lista de accesos directos y asignar los disfraces en el menú "Plugins".
  13. Después de completar la medición de todos los marcos pertinentes, los resultados se pueden copiar en una aplicación de hoja de cálculo como MS Excel. La columna "IntDen" representa la intensities de la zona seleccionada en el canal que la medición fue redirigido a.

8. Corrección Blanqueamiento

Dependiendo de la sonda utilizada y los ajustes de imagen, se puede producir foto-blanqueo. Dependiendo de su extensión, esto podría afectar fuertemente el resultado de la evaluación. Sin embargo, este efecto puede ser parcialmente corregido mediante la aplicación de una tasa igual pero opuesta de cambio de los valores medidos. Si está presente, el coeficiente de foto-blanqueo se puede calcular midiendo la disminución dependiente del tiempo intensidad de la señal en todo el marco, o área específicamente recortada de la trama, durante el período de tiempo relevante para el análisis de cada fagosoma. Este proceso se representa en las figuras 3 y 4.

  1. Bajo el menú "Plugins" de Fiji, utilice el "Time Series Analyzer" plug-in para determinar la disminución general en el conjunto de fotograma, o la intensidad de la señal de la sonda específica ROI a través del tiempo (Figura 3).
    Nota: Time Series Analyzer plug-in está disponible para su descarga en http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html , en caso de que no está presente en el menú de Plugins.
  2. Trazar la medición contra el tiempo (en segundos) en MS Excel, sólo para los cuadros que corresponden a los marcos de un fagosoma analizado.
  3. Aplique una línea de tendencia lineal (Figura 4A) a la trama; una pendiente negativa de la señal de la disminución indica la presencia de efecto de foto-blanqueo.
  4. Aplicar la pendiente inversa a los valores de un fagosoma analizado (figuras 4B y 4C): intensidad de la señal corregida (SI) = prima SI + (tiempo en segundos * revertir la pendiente)

Nota: cada sola fagosoma analizado tendrá un período de tiempo específico (a partir de la captación de marco completo) durante una película de lapso de tiempo grabado, la foto-Aclaradores de Uso C.hing debe ser recalculado para ese período específico y sólo será válida para la corrección de los valores medidos a partir de ese fagosoma específico.

9. Evaluación de los datos

  1. Reunir los datos y calcular el promedio y el error estadístico de los valores de blanqueo con corrección en el software apropiado.
  2. Grafica los datos evaluados en la forma adecuada.

Nota: En este caso, las estadísticas científicas y trazando software GraphPad Prism ( http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ se utilizó). Software Prism es capaz de generar y trazar una curva normal, con los indicadores de error correspondientes, siempre y cuando todos los datos tienen la misma velocidad de cuadro (es decir, todos fueron adquiridos con los mismos intervalos, como un fotograma cada 10 seg).

Nota: Amplias variaciones de los valores absolutos del SI dentro de repeticiones de la misma experimset ent introducirá gran error estadístico y hacer que los datos inutilizables. Este puede ser el caso si el protocolo, por ejemplo, la configuración de imagen, no se llevan a cabo estrictamente idénticos entre diferentes repeticiones de experimentos que han de ser cotejada.

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Representative Results

La preparación correcta de las células y los granos para la formación de imágenes es crítico. Figura 1 muestra el esquema de la siembra, la sonda de carga y las etapas iniciales de formación de imágenes en este método, basado en nuestro protocolo optimizado para BMMs. Es esencial por lo tanto, que los parámetros del protocolo de ser probados y optimizados en función del tipo de células y sondas que se van a utilizar.

Después de la adición de las perlas recubiertas con IgG a las células precargadas, es importante que el campo de visión se elige de una manera para proporcionar el mayor número de eventos potenciales de absorción en el mayor número de células posibles, mientras se mantiene a la configuración de la ampliación predefinida del protocolo. Como se representa en la figura 2, este enfoque puede prever un mayor número de fagosomas analizables en cada uno de vídeo de lapso de tiempo. Además de aumentar los puntos de datos por el rendimiento de vídeo de cada conjunto experimento, esto disminuye la variación introducida mediante la variación de periphecondiciones RAL y aumenta la robustez de los datos.

Se recomienda que el procedimiento de medición de señal-asociación (Figura 2) se lleva a cabo por la misma persona y de una manera ciega si es posible. Esto podría ayudar a reducir el error mediante la eliminación de múltiples fuentes personales-de error y reducir el sesgo, como el retorno de la inversión asignado a cada fagosoma es para ser seleccionado y movido manualmente después de cada marco.

Aunque, naturalmente, la regla de "cuanto mayor sea el tamaño de la muestra, mejor" también se aplica aquí, evitamos la evaluación de más de 5 perlas fagosoma por célula en el campo de visión para evitar dar demasiado peso a una sola célula que el comportamiento de todos células dentro de la misma cultura no es necesariamente homogéneo 19. Estos fagosomas deben ser seleccionados aleatoriamente en la medida de lo posible. En este contexto, los parámetros tales como los fagosomas ser totalmente visible en el plano focal para toda la duración de la formación de imágenes y también no estarafectados por el exceso de blanqueo de fotos son esenciales. Por otra parte, uptaking un gran número de partículas grandes por una sola célula puede afectar la dinámica de fusión de los fagosomas en esa celda, por lo que la prioridad debe ser dada a los fagosomas que se uptaken antes en el proceso de una "celda vacía" relativamente. Como regla general, las medidas promedio de al menos cinco células de hasta cinco experimentos independientes (por lo tanto, de hasta 25 fagosomas) deben proporcionar para la buena significación estadística.

La aplicación de análisis de series temporales o un método similar para detectar un posible efecto de foto-blanqueo (Figura 3) es muy importante, ya que algunas sondas sufren de fuerte blanqueo, mientras que algunos son muy foto-estable. La corrección de paso de fotoblanqueado (Figura 4) sólo debe aplicarse si un fuerte efecto de blanqueo se observa en todos los experimentos con la misma sonda. Se ha de señalar que este proceso sólo puede parcialmente correctael efecto de la decoloración. Es importante destacar que, el blanqueado excesivo en sólo unos pocos casos puede ser una señal de condiciones no óptimas, tales como excitación equivocado o ajustes de imagen, medio mal pH, células enfermas, o reactivos nonfresh.

En la Figura 5C, el cordón-fagosoma indica con una flecha en la Figura 5A y en la Figura 5B, se analiza y la intensidad de la señal Dex70kD (SI) asociación de maduración fagosoma durante un lapso de 90 min se traza. La fuente de ruido en la curva es la trama a trama variaciones de la señal de medición debido a factores tales como la obstrucción del fagosoma analizado por otras fluctuaciones fagosoma y plano focal. Sin embargo, la tendencia temporal de la asociación de señal al fagosoma es fácilmente evidente. Después de promediar el análisis de 10 fagosomas de las dos celdas visibles en la Figura 5A, una curva promedio puede ser trazado (Figura 5D) para el cual el correo estadísticarror pueden representarse gráficamente como el error estándar de la media (SEM) o la desviación estándar (SD) dependiendo del tamaño de la muestra y las condiciones experimentales. Mientras que los valores de SI absolutos de la curva de promediado es normalmente diferente de la de cualquier fagosoma analizado sola, la tendencia temporal es normalmente muy similar. Tras el análisis, se puede concluir que la entrega de Dex70kD como luminal lisosomal carga a los talones-fagosomas en BMMs tipo salvaje llegó a una meseta en el de 35-40 minutos después de la fagocitosis.

Por tanto, este método puede ser empleado para investigar el efecto cualitativa o cuantitativa de varios factores en proceso de maduración fagosoma.

Figura 1
Figura 1. Preparación de las células para la formación de imágenes. Preprepared BMMs se siembran en un fondo del plato de cristal por lo menos 12 horas antes de la adiciónde dextrano, se añadió una solución de dextrano en medio a una concentración de 20 mg / ml y se incubó durante 2-8 horas (carga), las células se lavan, se añade medio fresco y las células se incuban durante al menos 4 h (Chase), las células son lava de nuevo y la suspensión de microesferas se añade justo antes del inicio de la proyección de imagen. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Figura 2
Figura 2. Paso a paso las instrucciones para el análisis de la imagen. Después de cargar el video time-lapse o secuencia de imágenes en diferentes canales en Fiji, la evaluación sigue estos pasos (Tenga en cuenta que la cifra representa un collage de imágenes y no todas las ventanas que se muestran aquí se mantendrá abierta de manera simultánea ). (A) En la sección "Analizar" menú, pixel aescalamiento distancia se restablece en caso de que los metadatos de las imágenes no están disponibles para Fiji, diferentes aumentos se ha utilizado previamente en Fiji o las grabaciones con lapso de tiempo se encuentran en diferentes aumentos, por ir a (b) "Set Scale", ( c) marcando la casilla de "Global" que se aplica el reset para todas las series de imagen posteriormente cargado y haciendo clic en "Haga clic para eliminar incrustaciones". (D) Asegúrese de que tanto el campo claro (BF) serie de imágenes de canal (donde talón-fagosomas son claramente visibles) y el canal que contiene la señal de la sonda están cargados y tienen los mismos marcos cantidades exactas y las dimensiones en píxeles, por ejemplo. dos series de cada 400 marcos con 450 x 450 dimensiones en píxeles. (E) En el menú "Analizar", los parámetros de la evaluación se pueden ajustar en "Medidas set", donde "Zona", "densidad integrado" y los parámetros "de la etiqueta de visualización" han de ser seleccionados. (F (G) Esto asegura la medición de la intensidad-canal rojo en la misma región de interés (ROI) que se indica por la línea de puntos y la flecha blanca en-canal rojo. Se selecciona el ROI circular en el canal BF utilizando el "Oval" herramienta de selección. (H) Iniciar la medición en "Analizar", "Medición" o utilizando el comando de acceso directo, y repita para cada fotograma de la serie completa de la duración deseada del experimento (por ejemplo, 90 min). En cada fotograma, mover y reajustar la ubicación ROI a la perla-fagosoma de los intereses y tenga en cuenta que va a la siguiente fotograma de la serie BF y dar la orden de "Measure" automáticamente mide el retorno de la inversión en el marco correspondiente del canal rojo. (i) Los resultados de mediciónaparecerán como una lista en la ventana "Resultados". En la columna "Etiqueta", el marco correspondiente a cada línea se identifica claramente, el uso de esta para comprobar la medición repetida de una sola imagen o la omite fotogramas de la serie de imágenes de largo. (J) El "IntDen" corto para la densidad integrada es el parámetro de salida crítico; copiar al menos los valores de la "IntDen" etiqueta y a una hoja de MS Excel para continuar con la evaluación. La unidad de valor IntDen es indefinido y se indica en unidades arbitrarias (UA), esto no crea ningún problema, siempre que los protocolos se siguen estrictamente. La barra de escala es de 10 micras. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Figura 3
Figura 3. Análisis de la foto-blanqueo.60, (a) la serie de imágenes Abrir en el canal de interés y asegurarse de que la escala se ha eliminado si es necesario, (b) En "Plugins" del menú y haga clic (c) "Time Series Analyzer". (D) Con la herramienta de selección rectangular, dibuja un ROI rectangular que cubre casi todo el marco, o al menos toda la célula de interés para toda la duración de la película, (e) añadir el retorno de la inversión seleccionada, (f), haga clic en "Get Media "y (g) Los resultados se mostrarán en el" Time Traces "mesa y" Time Traces Promedio trama ". Tenga en cuenta sin embargo, que sólo un "promedio" (intensidad media) de valor se representa en función del número de marco y no el valor "IntDen". (H) En la sección "Analizar" menú, ejecute "Medida" sin cambiar ningún otro parámetro, para medir la "IntDen" para el mismo ROI exacto en el mismo marco. Esto proporcionará el equivalente de la meuna intensidad de "IntDen", utilice este valor para calcular el factor de conversión (igual a la "Zona") y trazar la "IntDen" del retorno de la inversión de todo el marco contra el tiempo en segundos en MS Excel. (J) Haga clic en la "Lista", copie la lista de valores a una hoja de Excel y convertir todos los valores de "media" a los valores "IntDen". Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Figura 4
Figura 4. Corrección de foto-blanqueo Dependiendo de la sonda utilizada y los ajustes de imagen, se puede producir. Foto-blanqueo. Esto podría afectar fuertemente el resultado de la evaluación. A) los valores sin procesar IntDen (in) de la sonda de todo el marco se representan gráficamente frente al tiempo en segundos en MS Excel. Añadir un lineallínea de tendencia;.. una pendiente claramente negativo indica la presencia de efecto de foto-blanqueo B) A modo de ejemplo, la aplicación de la decantación invertido en la IntDen cruda mediante la fórmula de corrección de los rendimientos de los valores IntDen la IntDen corregido C) Corregidos están parcialmente compensado por el efecto de foto-blanqueo. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .

La figura 5
Figura 5. Presentación de células representativas, cinética y promediado de la señal corregida. A) BMMs cargado con sonda de dextrano a 0 min sobre la captación de la bola recubierta con IgG indicada por la flecha. La barra de escala es de 10 micras. Se corresponde con la película 1 B) 2.5X zoom insertar de una película de lapso de tiempo, que representa el fagosoma se indica en un lapso de 85 minutos después de la absorción, de color falso para una mejor visibilidad con "thal" Look-Up-Table (LUT) en ImageJ. El ROI fagosoma medido se indica con la línea discontinua blanca. Los casos de entrega de dextrano y la acumulación en el fagosoma se indican con flechas blancas. C) Corregido señal de fluorescencia del Rojo Texas 70 kDa dextrano librado de los lisosomas al fagosoma indicada. D) promedió valores IntDen fluorescencia desde 10 fagosomas dentro de las dos celdas indicadas ± SEM . Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

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Discussion

En la siguiente sección vamos a discutir los pasos críticos del método presentado y sus limitaciones. Además, vamos a conectar algunos de los problemas comunes con sus soluciones, introducir posibles modificaciones y considerar ventajas de nuestro método, así como métodos complementarios adecuados para este enfoque.

La preparación de las perlas, incluyendo el acoplamiento de IgG a la superficie de la perla, es crucial y el uso de preparaciones de filetes debe ser evitado. En adición a eso, también es crítico que el dextrano se preparó a partir de la solución madre congelada (diluido y esterilizado) recién antes de cada experimento. Es importante que la carga del dextrano sigue un calendario preciso para lograr la consistencia en la captación celular y la distribución del compartimiento y la acumulación. Además, es importante utilizar no sólo la misma configuración de la microscopía y la configuración de software, sino también para mantener las condiciones de periféricos lo más constante posible (por ejemplo, TEmperature, CO 2, la humedad, la técnica de talón de adición, etc.). Otro punto crítico es la selección de un campo de visión o la célula de interés, la muestra debe ser realizado antes del inicio de formación de imágenes con el fin de elegir las células que son representativos.

Una de las principales limitaciones del método es el número de experimentos necesarios para producir muestras significativas tamaños. El método descrito es relativamente tiempo y un trabajo intensivo, ya que el número de los fagosomas observables en un campo de vista, dependiendo de la resolución elegida, es limitada. La combinación de los resultados de un número muy bajo de fagosomas elegidos al azar conlleva el riesgo de que unos pocos valores atípicos extremos pueden tener un efecto importante en los valores promediados. Muestras de mayor tamaño, por otro lado permitirán enmascaramiento de fagosoma-a fagosoma o variaciones de célula a célula.

Los problemas más comunes que pueden presentarse incluyen las contaminaciones, la falta de la fagocitosis y el blanqueamiento excesivo y fotoefecto de toxicidad debido a la luz láser.

Esterilidad, almacenamiento y preparación del dextrano adecuada son críticos para evitar contaminaciones. En nuestra experiencia, el dextrano comprado no debe ser considerada como una solución estéril. El riesgo de contaminación de la muestra se puede reducir de manera significativa por centrifugación extensa del stock y la filtración estéril de la solución de dextrano diluido. Por otro lado, la preparación regular de suspensión de perlas fresco, que contiene proteínas y es susceptible a contaminaciones, también puede reducir el riesgo de contaminaciones.

La falta de o bajos niveles de fagocitosis podrían ser debido a subóptima de IgG-recubrimiento de las perlas. Por lo tanto, es importante para preparar los componentes para el acoplamiento de IgG del talón (solución de IgG, EDAC) recientemente y no usar cuentas que tengan más de 4 semanas de edad o no se han mantenido exclusivamente a 4 ° C. Puesto que las perlas se sometieron a ultrasonidos brevemente antes de la utilización, se recomienda para prepararalícuotas de trabajo para evitar la sonicación repetida de la suspensión de acciones. Otra razón para la reducción de las prestaciones fagocítica espera podría ser poco saludable, subóptima o cultivadas las células viejas, por lo que el cumplimiento estricto de las condiciones de cultivo recomendadas para el tipo de célula utilizada es esencial. Por ejemplo, tripsina excesiva durante la cosecha podría dañar los receptores de la superficie fagocíticas y deteriorar la capacidad fagocítica.

El exceso de fotoblanqueado puede ser un problema importante con algunos fluoróforos. Ajuste de la configuración de microscopio, es decir, la intensidad de la luz de excitación y la duración de la exposición de la muestra, de acuerdo a la susceptibilidad de blanqueo del fluoróforo ayuda a controlar el blanqueo. Con respecto al intervalo de tiempo entre las adquisiciones de cuadros sucesivos, un equilibrio entre la velocidad de fotogramas, que a una frecuencia más alta proporciona para una mayor resolución temporal y mejor revelación de la dinámica de interacción importantes, y el blanqueo de la sonda tiene to ser golpeado. El equilibrio óptimo depende principalmente de las cuestiones que han de abordarse en el experimento dado. Ajuste de la resolución de escaneado, la frecuencia de barrido y la línea o un promedio de marco representan los ajustes que se pueden cambiar para optimizar aún más la duración de la exposición de la muestra a la luz de excitación. La disponibilidad de algunas de estas opciones está sin embargo determinada por el tipo de sistema de microscopio que se utiliza.

Las mismas pautas generales se deben seguir para minimizar el efecto foto-tóxico de la luz láser de excitación en las células. Este efecto se puede manifestar como la muerte de las células expuestas a la luz láser durante la formación de imágenes o un marcado aumento en morfologías no naturales 20.

Aquí hemos presentado un método básico y general, que permite la modificación y adaptación a diferentes condiciones experimentales. Como se ha mencionado, este método puede emplearse para estudios de pérdida de función, como en los modelos knockout,desmontables expresión de genes o proteínas mutantes. También permite diferentes estrategias de opsonización para destinadas a los receptores específicos fagocíticas, el uso de diferentes sondas endosomal / lisosomales, así como el estudio de inhibidores químicos o citoquinas.

Durante los estudios de expresión con diferentes proteínas de fusión fluorescentes y sus mutantes se pueden utilizar para investigar los efectos sobre la entrega de una sonda apropiada a los fagosomas. Además cinética y la dinámica de la interacción de la proteína en sí con los fagosomas pueden ser analizados. Hay varias sondas disponibles que pueden ser utilizados para estos fines. Un ejemplo destacado de clase común de sondas incluyen el grupo LysoTracker de colorantes acidotropic, que son ampliamente utilizados para realizar un seguimiento del lumen de protonación de los compartimientos endosomal así como el lumen phagosomal. El recubrimiento de las perlas ofrece otra multitud de posibilidades. Los ligandos, incluyendo ácidos nucleicos, tales como sitios específicos CpG de ADN bacteriano 21, baccomponentes de la superficie rial como LPS, proteínas tales como avidina, proteínas séricas, incluyendo los factores del complemento (por ejemplo C1q o iC3b) todos pueden cruzar vinculados a cuentas de 22 a 24. Esto permite el estudio del papel de estos ligandos en la fagocitosis y la maduración del fagosoma. El uso de moléculas de señalización y mediadores inmunológicos (por ejemplo, citoquinas) abrir otro abanico de posibilidades.

Finalmente, este método también se puede ampliar y adaptado para llevar a cabo los estudios directos con microorganismos, por ejemplo mediante la comparación de la captación de vs vivo o muerto patógena vs bacterias no patógenas, aunque la forma irregular de las bacterias plantea nuevos retos durante el análisis de la imagen.

Las futuras aplicaciones de este método son como colector como las modificaciones que se pueden aplicar. Como siguiente paso, los métodos de análisis de relación métrica se pueden adaptar. Combinación de pH sensibles y con pH insensible tintes fluorescentes para el grano de recubrimiento, o haciendo uso de sondas individuales de mediciónpH phagosomal Ure (por ejemplo pHrodo, FluoProbes), así como los compuestos que hacen que sea posible seguir experimentalmente la cinética de las proteínas y la degradación de los lípidos en el interior del fagosoma (por ejemplo, OVA, HRP, albúmina de suero bovino y substratos de lipasa de triglicéridos) están disponibles desde 25 hasta 31. Estas juntas hacen posible la creación de un gran número de métodos de investigación basados ​​en el método básico de imágenes de células vivas de los fagosomas que aquí se presentan.

El método descrito puede lograr resoluciones temporales mucho más altos en comparación con los enfoques que se basan en el aislamiento fagosoma 32. ELISA o Western Blot análisis de fagosomas puede representar un número muy elevado de eventos en determinados momentos de la hora, pero los datos representan una población mucho más heterogénea y potencialmente no sincronizada de los acontecimientos. Citometría de flujo se aproxima a base teóricamente permiten el análisis hasta el nivel celular individual y de esa manera puede ser menos propenso a heterogeneiTy de poblaciones de células, pero el problema similar de la sincronicidad incierto y la necesidad de recuentos muy altos de eventos para la evaluación fiable aún persisten. No obstante, el alto rendimiento, la sensibilidad y reproducibilidad de citometría de flujo se aproxima 33,34 hacerles un complemento óptimo para el enfoque de imágenes de células vivas.

Tomados en conjunto, la ventaja de nuestro método reside en la precisión y alta resolución temporal con la que los fagosomas individuales pueden ser seguidas en su proceso de maduración en las células vivas. En comparación con todos los otros enfoques que restringen observaciones a menos puntos de tiempo, en las células no viables y pretratadas, es posible aquí para seguir los eventos celulares dinámicamente y de forma continua durante largos períodos de tiempo bajo condiciones fisiológicas fácilmente modificables. Se podría definir los eventos relativos a la absorción de la carga fagocítica, que permite la discriminación de las etapas de la fagocitosis más precisamente. De esa manera, la sincronización permite no Oólo visualizar el comportamiento similar de los fagosomas, sino que también permite la identificación de las diferencias individuales debido a por ejemplo, variaciones de célula a célula. Lo más importante, la dinámica de las interacciones que pueden ser la clave para la comprensión de las complejas interacciones se pueden iluminar de manera efectiva en una alta resolución temporal utilizando nuestro enfoque de formación de imágenes de células vivas.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Damos las gracias a los miembros del Laboratorio de Biología Fagosoma para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo es apoyado por una beca de Helmholtz Young Investigator (Iniciativa y los fondos de red de la Asociación Helmholtz) y un Programa Prioritario SPP1580 Grant, del Consejo Alemán de Investigación (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) PAA, Austria E15-009
Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM) PAA, Austria E15-047
Fetal Bovine Serum (FBS) PAA, Austria A15-151
L-Glutamine PAA, Austria M11-004
PBS PAA, Austria H15-002
Penicillin/Streptomycin PAA, Austria P11-010
WillCo-dish® Glass bottom dish (35 mm ∅, #1.5) WillCo Wells, Netherlands GWSt-3522
CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm Greiner Bio one, Germany 627871 Alternative: Available as segmented
Carboxylated latex microspheres Polysciences, USA #09850 Available in different diameters, we used 3 μm
Polystyrene microparticles Kisker Biotech, Germany PPs-3.0COOH
Triton-X 100 ROTH, Germany 305.1.3
mouse whole IgG Rockland, USA 010-0102
EDAC crosslinker Sigma-Aldrich, USA E6383-1g
10 mM Tris Sigma-Aldrich,USA T1503
1-ml syringe Omnifix -F B.Braun, Germany 9161406V
26 G needle (0.45*25 mm) B.Baun, Germany 4657683
RPMI 1640 PAA, Austria E15-039
Horse Serum Gibco, USA 16050-122
MES hydrate Sigma-Aldrich, USA M2933
0.2 μM syringe mounted filter Sartorius, Germany 83.1826.001

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