Studie av Phagolysosome biogenes i Live Makrofager

Abstract

Fagocytiska celler spelar en viktig roll i det medfödda immunförsvaret genom att ta bort och eliminera invaderande mikroorganismer i sina phagosomes. Phagosome mognad är den komplexa och hårt reglerad process under vilken en begynnande phagosome genomgår drastisk förvandling genom väl iscensatt interaktion med olika cellulära organeller och fack i cytoplasman. Denna process, som är avgörande för den fysiologiska funktionen av fagocyterande celler genom att förse phagosomes med deras lytiska och bakteriedödande egenskaper, kulminerar i fusion av phagosomes med lysosomer och biogenes av phagolysosomes som anses vara den sista och avgörande skede av mognad för phagosomes. I denna rapport beskriver vi en levande cell imaging baserad metod för kvalitativ och kvantitativ analys av den dynamiska processen för lysosom att phagosome innehållsleverans, vilket är ett kännetecken för phagolysosome biogenesis. Detta tillvägagångssätt använder IgG-belagda mikropärlor som en modell för phagocytosis och fluoroforen-konjugerade dextran molekyler som luminal lysosomala last sond, för att följa den dynamiska leverans av lysosmal innehåll till phagosomes i realtid i levande makrofager med hjälp av time-lapse avbildning och konfokal laserskanning mikroskopi. Här beskriver vi i detalj bakgrunden, de förberedande stegen och den steg-för-steg experimentuppställning för att möjliggöra enkel och exakt utplacering av denna metod i andra laboratorier. Vår beskrivna metoden är enkel, robust, och viktigast, kan lätt anpassas för att studera phagosomal interaktioner och mognad i olika system och under olika experimentella inställningar såsom användning av olika fagocytceller typer, förlust-av-funktion experiment, olika sonder, och fagocytiska partiklar.

Introduction

Professionella fagocyter, däribland makrofager, spelar en avgörande i immunsystemet. Förutom att vara den första försvarslinjen i det medfödda immunförsvaret, de också spela en avgörande roll i aktiveringen av den adaptiva immuniteten genom sin signalering och antigenpresenterande roll ^1-3. Medan funktionen av professionella fagocyter är mångfacetterad, är phagosome mognad den kritiska ryggraden i bakteriedödande och antigenprocess funktion av professionella fagocyter ^4,5. När receptorn medi omvälvning och upptag av en phagocytic mål, såsom bakterier, går den begynnande phagosome genom en komplex och väl iscensatt sekvens av interaktion och utbyten med fack i endocytic nätverket och flera andra cellulära organ ^6. Den typ av föreningar som utbyts med dessa cellulära enheter samt reglering och tidpunkten för fusionshändelser bestämmer luminala phagosomal miljön och de phagosOMAL membranets sammansättning och därmed ^7, öde mognande phagosome ^8.

Den fysiologiska betydelsen av phagosome mognad exemplifieras av de olika strategier som används av olika intracellulära patogener att fly från, arrestera eller gräva phagosome mognad ^9. De flesta av dessa strategier som direkt eller indirekt hindrar det sista och avgörande steget i phagosome mognadsprocess: fusion av phagosome med sena endosomala / lysosomala fack, som förser dem med den största delen av hydrolytiska enzymer och antibakteriella faktorer av mogen phagosome ^{7 , 8,10.} Analys av det sista och avgörande steget kan därför ge oss starka indikatorer om tillståndet i mognaden av phagosomes och om det naturliga fysiologiska tillstånd är att vara positivt eller negativt under de särskilda experimentella inställningar som tas i anspråk.

Den sena endosomala / lysosomala facks är i allmänhet anses vara terminal fack i endocytiska vägen, definierade och framstående från början endocytic facken genom förekomsten av olika, Scen specifika, markörmolekyler. Exempelvis hydrolytiska enzymer eller membrankomponenter såsom Lysosomal associerade membranproteiner (lampor) bland andra ^11. Terminalen endocytic fack-hädanefter bara kallad lysosomer-också fungera som den viktigaste platsen för slutskedet av rötning vid slutet av fagocytiska / endocytic väg ^12. På detta sätt kan icke-smältbara prober lastas genom endocytos och macropinocytosis från den extracellulära miljön och som transporteras genom den endocytiska banan till lysosomer, där det ackumuleras ^13,14 efter att ha följt en definierad cykel av upptag och chase. Fluorofor-konjugerade sönder för fluorescensmikroskopi såsom det organiska icke-smältbar polymer dextran används vanligen som endocyticprobes ^15-17.

14,18.

Efter beskrivning av vår metod, kan analoga experiment utformas med hjälp av modifierade inställningar och faktorer för att undersöka deras inverkan på phagosome mognad, praktiskt taget alla othennes typ av fastsittande primära eller cell-linjer fagocytiska celler, genetisk förlust av funktions experiment inklusive gen knock-out och knock-down, mutanter eller uttryck av fusionsproteiner, fagocytiska-mål, microbead beläggning föreningar, endosomala / lysosomala sonder och faktorer som en cytokiner, kemiska hämmare, eller siRNA bland andra är alla variabler som kan användas till grundidén i denna metod.

Vi definierar målet och de grundläggande kraven i denna metod på följande sätt:

• Mål av metoden: att möjliggöra direkt, kvantitativ och kvalitativ observation och analys av phagosome mognad med hög tidsupplösning i levande fagocytceller.
• Fagocytiska last: En lämpligt belagd mikropartikel eller biologiska mål. Här använder vi IgG-belagda 3 ìm sfäriska polystyren mikropartiklar som lätt intern via Fc-γ receptormedierad fagocytos. Alternativt någon mikroorganism eller bestruket microparticle för vilken en fagocytisk receptor är närvarande på celler kan användas.
• Fagocytceller: Adherenta fagocytiska celler som uttrycker lämpliga fagocytiska receptorer. Här använder vi mus primära BMMs som rikligt uttrycker Fc-γ receptorer. Alternativt kan dendritiska celler (DC), monocyter eller fagocytiska epitelceller eller deras genetiska mutanter eller knock-out-varianter användas.
• Lysosomala last: En fluorescerande lysosomala sond. Här är Texas Red-konjugerad 70.000 kilodalton dextran (Dex70kD) används som luminala last av lysosomer. Alternativt får alla fluorescerande detekterbar markör för ett cellulärt fack eller organell, eller en lämplig prob för phagosomal egenskaper såsom surhet eller nedbrytande kapaciteten, skulle kunna användas för att studera utvecklingen av phagosome mognad.
• Påverkande faktorer: till exempel signalmolekyler, kemiska föreningar, gen knock-down, eller övergående uttryck av muterade proteiner kunde. Här har vi FÖRGen användning av en sådan faktor för enkelhetens skull, men för ett aktuellt exempel med mutant proteinuttryck och knock-down påverkande faktorer vänligen se Kasmapour et al. ¹⁸ Varje faktor som kan påverka fagocytos eller omständigheterna och rörlighet phagosomes och / eller de utrymmen som interagerar med förfall phagosomes skulle kunna användas.

Protocol

Djuromsorg och alla förfaranden i detta protokoll följer de institutionella och nationella riktlinjer.

Förbered de förberedelser som indikeras av "Π-" på förhand.

1. Framställning av BMMs

1. Utför avlivning av mössen genom halshuggning.
2. Ta lårben och skenben ben, fria ben från vävnad och trimma båda ändar för tillgängligheten till benmärgen.
3. Håll ben i iskall PBS eller iskall DMEM-medium (kompletterat med 100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin, på is fram till nästa steg.
   Anmärkning: Utför följande steg i en klass II biosäkerhet skåp för att minimera risken för kontaminering.
4. Spola märghålan med kall PBS + penicillin / streptomycin med användning av en 26 G (0,45 mm) nål fäst till en 1 ml spruta.
5. Pelletera celler genom försiktig centrifugering vid 350 x g under 10 min, återsuspendera pelleten i BMM Medium och plåt i steril mikrobiologi noncoated petriskålar.
   1. Beredning av BMM mediet
      • Dulbeccos Modified Eagles Medium DMEM
      • 10% inaktiverat FCS
      • 20% mus-fibroblast L929-cellinjen odlingssupernatanten (källa för makrofag-kolonistimulerande faktor, M-CSF)
      • 5% hästserum
      • 2 mM glutamin
   2. Framställning av L929-cellinjen odlingsmedium;
      • RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 medium
      • 10% inaktiverat FCS
      • 2 mM glutamin
   3. Beredning av musfibroblast L929 cellinje odlingssupematant;
      • Konfluenta L929-cellerna delades 1:4, odlades i 175 cm ² flaskor för två dagar med användning av 20 ml L929 medium och odlingssupernatanten uppsamlades efter 48 h, filtrerades och sattes till BMM-mediet
6. Inkubera cellerna spolas frånlårbenet i en inkubator vid 37 ° C i 5% CO ₂ atmosfär.
7. Efter varje 48 timmar (max 72 timmar) av inkubation, aspirera mediet och ersätt med färskt BMM medium, i upp till 10 dagar. Mer än 95% av cellerna var positiva för CD14 som testats av flödescytometri. CD14 är en mönsterigenkänning receptor huvudsakligen uttrycks av makrofager. Genom att bestämma den procentuella andelen celler som var positiva för denna receptor, har genererat en ren kultur av adherenta BMMs.

OBS: förbereda och kultur cellerna därefter om andra celltyper används.

2. Beläggning av Microbeads som fagocyterande Cargo

1. För beredning av 1 ml pärlsuspension, 400 pl av 2,5% 3 um karboxylerade polystyren mikropartiklar, eller alternativa mikropartiklar.
2. Överför kulsuspensionen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör, tvätta 3x med PBS och tillsätt 100 | il av 500 mM 2 - (N-morfolino) etanerulfonic-natriumsalt, MES-buffert vid pH 6,7 till pärlan pelleten.
3. Lös 50 | j, g mus-IgG (polyklonal IgG-antikropp) i 50 | il sterilt DDH ₂ O och tillsätt till pärlsuspensionen.
4. Fyll suspensionen upp till 1 ml med sterilt DDH ₂ O (450 pl).
5. Inkubera lösningen under 15 min på ett roterande hjul vid RT.
6. Förbered EDAC tvärbindare, N-(3-dimetylaminopropyl)-N'-etylkarbodiimid-hydroklorid i en koncentration av 10 mg / ml och tillsätt 14 | il till pärlsuspensionen.
   Anm: EDAC tvärbindningar aminogrupperna hos IgG med karboxylgruppema på ytan av pärlorna och underlättar immobilisering av IgG på pärlytan. Detta är avgörande för pärla upptag och därmed lösningen skall beredas.
7. Inkubera suspensionen på ett roterande hjul under 1 h vid RT.
8. Addera 14 pl av EDAC tvärbindare och inkubera suspensionen på ett roterande hjul under 1 h vid RT.
9. Centrifugera suspensionen vid 10000 x g under 2 min i en mikrocentrifug.
10. Tvätta pärlorna 3 gånger i stoppbuffert (1% Triton-X-100 i 10 mM Tris, pH 9,4) för att stoppa tvärbindningsreaktionen, genom att återsuspendera pelleten i stoppbuffert och centrifugering av lösningen vid 10000 x g under 2 min.
11. Tvätta pärlor 3x i PBS och suspendera pelleten i 1 ml PBS.
    Tillval: Bered arbets portioner av 30-50 pl.
12. Förvara IgG-belagda pärlsuspension vid 4 ° C i högst 4 veckor och aldrig tillåta att upphävandet frysas.

Notera: Ett konserveringsmedel såsom natriumazid i en slutlig koncentration av 0,02% (vikt / volym) kan tillsättas till suspensionen för att förhindra bakterietillväxt och förorening. I detta fall har tvättning av pärlorna före dess användning som skall utföras för att undvika cytotoxiska effekterna av konserveringsmedel. Centrifugera en alikvot av suspensionen vid 10.000 x g under 2 min och tvätta pärlorna genom resuspendering av pelleten i PBS. Upprepa tvätt 3x.

3. Beredning av Dextran Probe stamlösning

1. Lös Texas Red 70.000 kilodalton Dextran (Dex70kD) i PBS vid 20 mg / ml och förvara vid -20 ° C, i enlighet med tillverkarens instruktioner.
   Obs: Håll lager vid -20 ° C i upp till flera månader, eller vid 4 ° C under några veckor, se tillverkarens dokumentation.
2. Förbered dextranlösning för experimentet från mälden genom utspädning i komplett DMEM cellodlingsmedium (DMEM, 10% FCS, 2 mM L-glutamin) vid cirka 1 mg / ml (flerfaldigt koncentrerad lösning som kommer att spädas ut till den slutliga arbetskoncentration av 20 | ig / ml före tillsats till cellerna).
3. Använd en ultraljud vattenbad att sonikera dextranet alikvot under 5 min för att homogenisera lösningen och lös upp aggregat som senare skulle kunna leda till artefakt generation under avbildning.
4. Centrifugera vid maximal gi 5 minuter i en mikrocentrifug för att ta bort eventuella olösta klumpar eller föroreningar från lösningen.
5. Flytta försiktigt supernatanten till ett nytt rör samtidigt som man undviker pelleten i botten av röret och späd ut lösningen till den slutliga arbetskoncentration av 20 ng / ml i komplett DMEM-cellkulturmedium.
6. Filter-sterila lösningen med en ìm spruta 0,2 monterade filter.

4. Dextran Förinstallerad

1. Seed celler i en levande cell imaging glas nedre skålen och inkubera under åtminstone 12 h (vid 37 ° C i 5% CO ₂ atmosfär) för att säkerställa vidhäftning och acklimatisering.
   OBS: Det finns segmente glas botten rätter tillgängliga som gör att utföra flera experiment (upp till fyra fack) per fat.
2. Förbered dextran i DMEM-lösning som beskrivs i protokoll 3. Värm upp framställes dextran i DMEM-lösning, med användning av ett vattenbad vid 37 ° C.
3. Aspirera medel and lägga dextranlösning till cellerna försiktigt och inkubera vid 37 ° C i 5% _{CO2-atmosfär} under 2-8 h för upptag.
   Obs: Planera och optimera protokoll baserat på sonden och celltyp som används och strikt hålla sig till denna varaktighet vid upprepade experiment. Detta är väsentligt för profilen av dextran-ackumulering i den endocytiska reaktionsvägen och således reproducerbarheten av experiment.
4. Tvätta cellerna 3x med förvärmt komplett DMEM medium; aspirera medium och skölj celler försiktigt med färskt medium.
5. Inkubera cellerna med komplett DMEM-medium under 4 till 12 h vid 37 ° C i 5% CO ₂ atmosfär.
6. Tvätta cellerna en gång med förvärmt komplett filtrerades fenolrött-fritt DMEM-medium.
7. För bästa resultat bildbehandling, byt till förvärmd komplett filtrerad fenolrött-fritt DMEM-medium minst 30 minuter innan avbildning. Fenolrött kan orsaka utsläckning av fluorescenssignaler, öka bakgrundsbruset ochdärmed minska bildens kontrast och skärpa.

OBS: Ställ in mikroskopet och avbildnings inställningar i förväg, enligt förplanerad och optimerat protokoll baserat på vilken typ av sond och celler som används.

5. Lägga till IgG-belagda pärlor

1. Jämvikta en alikvot av preprepared 1% pärlsuspension till RT och sonikera i en ultraljuds vattenbad under 2-3 min.
2. Lägg 1-6 | il av 1% pärlsuspension till fullständig filtrerades fenolrött-fritt DMEM-medium i en klass II biosäkerhet skåp för att minimera risken för kontaminering (en bra startkoncentrationen är 1 | il / 2 cm ² diskytan).
   Anmärkning: Här BMMs ympades vid 25000 celler / brunn och en 6 | il av 1% förråds kulsuspensionen tillsattes till mediet i skålen. Detta motsvarar ungefär en vulst / cellförhållande av 15:01. Förhållandet måste anpassas till den typ av celler som används och till pärla material, jag.e. latexpärlor har låg densitet och sjunker inte till botten snabbt, medan polystyrenpärlor handfat och komma i kontakt med de vidhäftande cellerna mycket snabbare och därmed i större antal.
   Obs: Beroende på försöket, kan det vara av fördel att välja den region som kommer att observeras i förväg. Bead fjädring kan sedan läggas bara till den specifika regionen av glaset nedre skålen, därför ökar sannolikheten att observera gynnsamma upptagshändelser.
3. Den täta moln av pärlor kan diffunderas genom att försiktigt pipettera suspensionen i glaset nedre skålen.
4. Vänta tills pärlorna sjunka till botten av glaset nedre skålen och är ungefär i samma plan med de vidhäftande fagocytiska celler.
5. Fokus på regionen av intresse (ROI) och starta time-lapse avbildning.

Obs: Det kan vara nödvändigt att finjustera fokus medan bildbehandling pågår, beroende på bildhanteringssystem som används, dess stahet och rörligheten av de observerade cellerna. Observera dock att detta kan göra det omöjligt, en korrekt analys av phagosomes som starkt avviker från planet i fokus till följd av omfokusering.

6. Imaging

Följ de allmänna riktlinjerna nedan för bästa möjliga bildkvalitet;

1. Använd ett konfokalt avbildningssystem, såsom en laser-scanning eller snurrande skiva systemet.
   Anm: En Leica TCS SP5 AOB-bakterier Laserskanning konfokalmikroskop kontrolleras av Leica LAS AF programvara och utrustad med en miljöstyrkammare användes här för time-lapse video avbildning.
2. Optimera avbildnings inställningar såsom skanningshastighet, förstoring, upplösning, etc. på ett sätt för att tillåta en hastighet av en ram i varje 7-20 sek, beroende på systemet som används.
   Notera: Här, en 200 Hz scanningshastighet, 2x scanner zoom och en rad medelvärdesbildning av 2-3x med en upplösning på 512 x 512 pixlar resulted i en inspelningstiden mellan 3-5 sek / Rame. En hastighet av en ram i varje 10 sekunder användes för att spela in time-lapse filmer med löptider på minst 120 minuter.
3. Använd lämpliga inställningar excitation / emissions baserad på den använda bildsystem och sond (s).
   1. Optimera inställningarna för att förhindra överdriven foto-blekning.
      Obs: Här, den Texas Red Dextran 70 kd exciterades med användning av en DPSS (561 nm) laser och ljusemission detekterades genom ett Leica hybriddetektor (HYD) vid 600 till 650 nm med emissionstopp vid 610 nm. Laser intensitet måste anpassas till signalintensitet och hållas så låg som möjligt för att minimera fotoblekning av fluoroforen (er) och toxicitet effekt bild av laserljuset på cellerna. Generellt är det viktigt att balansera scanningshastighet, linjemedelvärdes, skanningsupplösning, bildintervall och varaktighet bildbehandling för att få korrekt och stabil signalintensitet och fånga hela varaktighet pärla upptag och phagosome mognad process.
4. Inkludera en ljusfält (BF) kanal för observation av pärlorna om de inte är konjugerad med en fluorofor.
   Anm: Förutom den Texas Red-kanal, var BF kanal som används för att visualisera pärlorna utfördes samma DPSS laser användes som ljuskälla och signalen detekteras med en fotomultiplikator (PMT)-detektor.
   OBS: Se till att tillämpa samma inspelningsinställningar vid förvärv av uppgifter som skall sammanställas. De viktigaste parametrarna är: excitation laser intensiteter, detektorinställning, förvärvsinställningar, förstoring och bildintervall. Inte använda samma ram intervall kommer att kräva en kurva-medelvärdessteg som observationsdatapunkter inte kommer att överlappa (t.ex. för att sammanställa en observation med ramar som förvärvats vid varje 7 sek med en annan uppsättning med ramar vid varje 12 sek). Detta skulle öka de steg som krävs för analysen av data och kräver ytterligare programvara med kurvan-medelvärdesfunktion, såsom OriginLab "s Origin Pro statistik programvara ( http://www.originlab.com/ ).
5. Helst, spara time-lapse video i det ursprungliga fil-format för den använda bildsystem och undvika att exportera i komprimerade format.

Observera: Här har tidsförlopp filmer sparas i det ursprungliga Leica LAS AF-format filer, som sedan importeras direkt att öppna i Fiji (LIF.). Fiji kan läsa originalformat från de flesta mikroskop tillverkare som använder den medföljande Bio formaten importör plug-in. Exportera time-lapse filmfilen i en bildserie med JPG eller TIFF eller som en videofil på en AVI container format är inte nödvändigt eller rekommenderas. Förutom att bevara bästa möjliga bildkvalitet från den ursprungliga observationen genom att undvika förstörande komprimeringsalgoritmer (t.ex. JPEG), med hjälp av infödda mikroskop filformatet försäkrar att filens metadata (tidsstämplar, förstoring, laser-och förvärvsintensitet, Detektorinställningar etc.) bevaras och tillgänglig för Fiji. Men om du av någon anledning, tidsförlopp videofiler måste exporteras i ett annat format för analys, se till att använda okomprimerade filformat som serie TIFF-bild och separata RGB-färg (röd, grön, blå) kanaler redan i detta steg, som Fiji kan ofta inte lyckas separera BF-kanalen från andra färgkanaler i exporterade filer. Se också till att bevara de ursprungliga objektfilerna som referens.

7. Analys av Time-lapse-filmer

1. Använd ImageJ, Fiji eller någon annan programvara som ger en analogsignal associationsanalys kapacitet.
   Notera: Här var Fiji användes för analys av time-lapse filmer. Fiji är en ImageJ distribution som innehåller ett bildbehandlingspaket med omorganiserade verktygsmenyer och ytterligare infödda plug-ins, finns för gratis nedladdning på http://fiji.sc . Den process som beskrivs i denna sektjon är avbildad i Figur 2.
2. Öppna filen i Fiji genom att klicka på "File", "Open" och välja filen, eller genom att dra och släppa filen till Fiji.
3. Välj följande alternativ;
   1. Stack visning: Visa stack med Hypers,
   2. Färgalternativ: Färgläge färglagd,
   3. Split kanaler i separata fönster: Split kanaler (för varje RGB-färg-kanal som spelades in ett separat fönster öppnas).
4. Om en bildserie ska användas, ladda serien till Fiji genom att gå till "File", "Importera", "Bildsekvens" och välja vilken bildfil i mappen med målbilden serien.
   1. Ange filter och villkor för lastning markerade bilder i serien, till exempel;
      1. Antal bilder: hur många bilder som ska laddas.
      2. Starta image: vilken bild är utgångsramen i serien.
      3. Ökning: ökningen mellanbildrutor som ska laddas (varje bildruta, varannan bildruta, osv.).
      4. Filnamn innehåller: filtrera efter specifik kanal med hjälp av filnamnet (till exempel genom att ställa "C001", vilket är hur normalt är bilderna från "kanal 1" är märkta efter färg-separation av en flerkanalig time-lapse video).
5. Ta skalning genom att gå till "Analyze", "Set skala ...", kryssa i rutan "Global" och klicka på "Klicka för att ta bort kalk".
   OBS: Detta steg tillåter pixelbaserad analys av bilderna i fall olika förstoringar har använts för de olika experimentella uppsättningar som ska utvärderas. Om förstoringsinställningarna har alltid hållits konstant och personen mikroskop filen direkt importerats till Fiji, kan du hoppa över steget, som Fiji kan förstå och använda förstoring och skal data från mikroskop filens metadata.
6. Konfigurera mätningsparameters genom att gå till "Analyze", "Set Measurements" och markera följande kryssrutor: "Area", "Standardavvikelse", "Integrerad täthet", "Display etikett" och "Mean grå värde".
7. Omdirigerings till färgkanal som innehåller signalen från sonden som skall mätas och bekräfta med "OK".
8. Gå till ramen där mätningarna ska startas och välj BF kanalfönstret genom att klicka på den övre kanten av fönstret.
9. Använd "ovala markeringsverktyg" för att välja ett område av intresse (ROI), dvs en cirkulär ROI på interna pärla. Se till att urvalet är inpassad tätt mot den yttre kanten av vulsten som är synlig i BF-kanalen.
   OBS: När du använder en dator, håller du ned Skift-tangenten medan du använder markeringsverktyget för att säkerställa en cirkulär ROI.
10. Starta mätningen optimalt några bildrutor innan den fullständiga omvälvning av pärlan är klar och noteraram i vilken en helt formad begynnande vulst-phagosome bildas och den fagocytiska koppen är sluten. Det bör vara relativt tydligt urskiljbar i BF-kanalen.
11. Gå till "Analysera" och klicka på "Measure" för att utföra mätningen, resultatet kommer att visas i ett separat fönster med titeln "Resultat".
12. Gå till nästa bildruta, justera läget för ROI i fallet pärlan har flyttat, och upprepa mätningen. Resultatet kommer att läggas till i listan i resultatfönstret, var och analyserade ram kan identifieras baserat på värdet i "Label"-kolumnen.
    Anm: Använda kortkommandon (t.ex. "M" för åtgärd) kan avsevärt påskynda utvärderingsprocessen, se listan över genvägar och tilldela kostym och kära under menyn "Plugins".
13. Efter avslutad mätning av alla relevanta ramar, kan resultatet kopieras till ett kalkylprogram som MS Excel. Kolumnen "IntDen" skildrar intensities av det markerade området i kanalen att mätningen omdirigerades till.

8. Blekning Korrigering

Beroende på den använda proben och bildinställningar, kan foto-blekning inträffa. Beroende på dess omfattning, kan detta kraftigt påverka resultatet av utvärderingen. Emellertid kan denna effekt delvis korrigeras genom att en lika men motsatt förändringstakten för de uppmätta värdena. Om det finns, kan den fotoblekkoefficient beräknas genom att mäta tidsberoende signalintensitet minskning i hela ramen, eller specifikt beskurna delen av ramen, under den tidsperiod relevant för analys av varje phagosome. Denna process visas i fig 3 och 4.

1. Under "Plugins"-menyn i Fiji, använd "Time Series Analyzer" plug-in för att bestämma den allmänna minskningen i hela-frame, eller ROI specifik sond signalintensiteten över tiden (Figur 3).
   Anm: Time Series Analyzer plug-in finns tillgänglig för nedladdning på http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html , om inte redan finns i Plugins-menyn.
2. Rita mätningen mot tiden (i sekunder) i MS Excel, bara för de ramar som motsvarar ramarna för ett analyserat phagosome.
3. Applicera en linjär trendlinje (Figur 4A) till tomten, en negativ lutning för minskande signal indikerar närvaron av fotoblekningseffekten.
4. Applicera den omvända lutningen på värden från ett analyserat phagosome (figur 4B och 4C): rättad signalintensitet (SI) = rå SI + (tid i sekunder * vända lutning)

OBS: Varje enskild analyserade phagosome kommer att ha en specifik tidsperiod (från komplett upptag ram) under en inspelad time-lapse film, foto-bleaching måste räknas om för den specifika spännvidd och kommer att vara endast för att korrigera de uppmätta värdena från den specifika phagosome.

9. Data Evaluation

1. Sammanställa data och beräkna genomsnittet och statistiska fel av blek-korrigerade värden i lämplig mjukvara.
2. Plotta de utvärderade data i en lämplig form.

Notera: Här, de vetenskapliga statistik och plottning programvara GraphPad Prism ( http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ var) användes. Prism programvara kan generera och rita en genomsnittlig kurva med motsvarande indikatorer felet så länge alla data har samma bildhastighet (dvs. alla förvärvades med med samma intervall, till exempel en bild var 10: e sekund).

Obs: Stora variationer av de absoluta SI värden inom upprepningar av samma experiment set kommer att införa mycket stora statistiska fel och göra uppgifterna oanvändbar. Detta kan vara fallet om protokollet, t.ex. imaging inställningar, inte hålls helt identiska mellan olika experiment upprepningar som ska sammanställas.

Representative Results

Korrekt beredning av cellerna och pärlor för avbildning är kritisk. Figur 1 visar konturerna av sådd, sond-lastning och inledande bildbehandling steg i denna metod, som bygger på vår optimerat protokoll för BMMs. Det är därför väsentligt att de protokollparametrarna testas och optimeras beroende på typen av celler och prober som skall användas.

Efter tillsats av IgG-belagda pärlor till förladdade celler, är det viktigt att synfältet är vald på ett sätt för att tillhandahålla det största antalet potentiella upptags händelser i det största antalet celler som möjligt, samtidigt som att den fördefinierade förstoringsinställning av protokollet. Som visas i figur 2, kan denna metod ge ett större antal analyser phagosomes i varje time-lapse video. Förutom att öka datapunkterna per video Utbytet av varje experiment uppsättning minskar detta variationen införs genom varierande peripheRAL förhållanden och ökar robustheten i uppgifterna.

Det rekommenderas att förfarandet för signal-association mätning (figur 2) skall utföras av en och samma person och på ett blint sätt, om möjligt. Detta kan bidra till att minska felet genom att eliminera flera källor personlig-fel och minska fördomar, som ROI delas varje phagosome skall väljas och flyttas manuellt efter varje bildruta.

Medan naturligtvis regeln om "ju större urvalsstorlek, desto bättre" gäller även här, vi undviker att utvärdera mer än 5 pärla-phagosome per cell i området för att förhindra att ge för mycket tyngd på en enda cell som beteendet hos alla celler inom samma kultur inte nödvändigtvis homogen ^19. Dessa fagosomer bör väljas slumpmässigt så långt som möjligt. I detta sammanhang parametrar såsom phagosomes är fullt synlig i fokalplanet för hela den tid som avbildning och dessutom inte varapåverkas av överdriven fotoblekning är väsentliga. Dessutom kan uptaking ett stort antal stora partiklar av en enda cell påverkar fusionsdynamiken för phagosomes i den cellen, så att prioritet bör ges till de phagosomes som uptaken tidigare i processen med en relativt "tom cell". Som en allmän regel bör de genomsnittliga mätningar från minst fem celler från upp till fem oberoende försök (därav, upp till 25 phagosomes) sörja för god statistisk signifikans.

Tillämpningen av tidsserieanalys eller en jämförbar metod för att upptäcka en eventuell fotoblekande effekt (Figur 3) är mycket viktigt, eftersom vissa sonder kommer att drabbas av kraftig blekning medan vissa är väldigt fotostabila. Den fotoblekningskorrigering steg (Figur 4) bör endast tillämpas om en stark blekande effekt observeras i alla experiment med samma prob. Det bör noteras att denna process kan bara delvis korrekteffekten av blekning. Viktigt kan överdriven blekning i endast ett fåtal fall vara ett tecken på icke-optimal villkor, såsom fel excitation eller avbildningsinställningar, fel medel pH, sjuka celler, eller nonfresh reagenser.

I fig. 5C, vulsten-phagosome indikeras med en pil i fig 5A och i fig 5B, analyseras och den Dex70kD signalintensitet (SI) associering till mognande phagosome under en tidsperiod på 90 min är uppritad. Den bullerkällan i kurvan är den ram till ram varianter av den uppmätta signalen på grund av faktorer som obstruktion av analyserade phagosome av andra phagosome och fokal planförändringar. Dock är den tidsmässiga utvecklingen av signal association till phagosome lätt klara. Efter genomsnitt analysen från 10 phagosomes från de två cellerna syns i Figur 5A, kan en genomsnittlig kurva ritas (Figur 5D) för vilken den statistiska error kan plottas som standardfelet för medelvärdet (SEM) eller standardavvikelsen (SD), beroende på provstorleken och experimentella förhållanden. Medan de absoluta SI värdena för medelvärdeskurvan vanligtvis skiljer sig från den för någon enskild analyse phagosome, är det tidsmässiga trend normalt mycket lika. Efter analysen kan man dra slutsatsen att leveransen av Dex70kD som lysosomala luminala last till bead-phagosomes i vildtyp BMMs nått en platå inom 35-40 minuter efter fagocytos.

Metoden kan därför användas för att undersöka den kvalitativa eller kvantitativa effekten av olika faktorer på phagosome mognadsprocess.

Figur 1. Beredning av celler för avbildning. Preprepared BMMs sås i ett glas botten maträtt minst 12 timmar före tillsatsav dextran, är lösningen av dextran i medium tillsätts vid 20 | ig / ml koncentration och inkuberades under 2-8 h (loading), cellerna tvättas, är färskt medium tillsätts och celler inkuberas under åtminstone 4 h (chase), celler är tvättas igen och pärlsuspension läggs strax före starten av bildbehandling. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2. Steg för steg instruktion för bildanalys. Efter att ha laddat den time-lapse video eller bildsekvens i olika kanaler i Fiji, följer utvärderingen i dessa steg (Notera att figuren visar en bild collage och inte alla fönster som visas här kommer att vara öppna samtidigt ). (A) Under "Analyze"-menyn, bildpunkt tillAvståndet skalning återställs i fall metadata i bilderna är inte tillgänglig för Fiji, har olika förstoringar använts tidigare i Fiji eller tidsförlopp inspelningar är vid olika förstoringar, genom att gå till (b) "Set Scale", ( c) att kryssa i "Global" låda som gäller återställningen till alla senare laddade bildserie och klicka på "Klicka för att ta bort Scale". (D) Se till att både den ljusa fält (BF) kanal bildserie (där pärla-phagosomes syns tydligt) och kanalen innehåller sondsignalen är laddade och har exakt samma ramar räknas och pixelmått, t ex. två serier om vardera 400 bilder med 450 x 450 pixelmått. (E) Under menyn "Analyze", parametrar för utvärderingen kan ställas in under "Set Measurements", där "Area", "Integrerad täthet" och "Display label" parametrar måste väljas. (F (G) Detta säkerställer mätning av den röda kanalen intensitet i samma region av intresse (ROI) som indikeras av den streckade linjen och den vita pilen i rött-kanal. Den cirkulära ROI väljs i BF kanal med "ovala" markeringsverktyg. (H) Starta mätningen under "Analyze", "Åtgärd" eller med kommandot genväg, och upprepa för varje bildruta av hela serien för den önskade varaktigheten av experiment (t.ex. 90 min). I varje ram, flytta och justera ROI plats till pärlan-phagosome av intresse och noterar att gå till nästa bildruta i BF-serien och ge den "Measure" kommandot automatiskt mäter ROI i motsvarande ramen för den röda kanalen. (i) Mätresultatvisas som en lista på "Resultat"-fönstret. Under "Label"-kolumnen, är den exakta ramen för varje linje tydligt identifierade, använda detta för att kontrollera om upprepade mätningar av en enda bildruta eller hoppas över bildrutor i långa bildserier. (J) "IntDen" kort för integrerad densitet är den kritiska output parameter, kopiera åtminstone etiketten och "IntDen" värden till en MS Excel-ark för att fortsätta med utvärderingen. Enheten för IntDen värdet är odefinierat och anges som godtyckliga enheter (AU), innebär detta inte skapar några problem så länge protokollen följs noga. Skala bar är 10 mikrometer. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3. Analys av foto-blekning.60: (a) Öppna bildserien i kanal av intresse och se till att vågen har tagits bort vid behov, (b) Under "Plugins"-menyn klicka (c) "Time Series Analyzer". (D) Att använda den rektangulära markeringsverktyget, rita en rektangulär ROI som täcker nästan hela ramen, eller åtminstone hela cellen av intresse för hela den tid av filmen, (e) lägga till det valda ROI, (f) Klicka på "Get Average "och (g) Resultaten kommer att visas i" Time Traces "bord och" Time Traces Average "tomt. Observera dock att endast en "genomsnittlig" (Mean intensitet) värde plottas mot ramnumret och inte värdet "IntDen". (H) Under "Analyze"-menyn, kör "Mät" utan att ändra några andra parametrar, för att mäta "IntDen" för exakt samma avkastning vid samma bildruta. Detta kommer att ge en motsvarighet till Meen intensitet i "IntDen", använda det här värdet för att beräkna omvandlingsfaktorn (lika med "Area") och plotta "IntDen" hela-frame ROI mot tiden i sekunder i MS Excel. (J) Klicka på "Lista", kopiera listan med värden till ett Excel-ark och konvertera alla "betyder" värden till "IntDen" värderingar. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 4. Korrigering av fotoblekning. Beroende på den använda proben och bildinställningar, kan foto-blekning inträffa. Detta kan kraftigt påverka resultatet av utvärderingen. A) Raw IntDen värden (i au) av sonden från hela ramen plottas mot tiden i sekunder i MS Excel. Lägg till en linjärtrendlinjen,.. en klart negativ lutning indikerar förekomst av foto blekning effekt B) Som ett exempel, tillämpa den omvända uppsamlingstankar på rå IntDen hjälp av korrektionsformel ger den korrigerade IntDen C) Korrigerade IntDen värden delvis kompenseras för effekten av fotoblekning. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 5. Presentation av representativa celler, kinetik och utjämning av den korrigerade signalen. A) BMMs laddad med dextran sond vid min 0 vid upptag av IgG-belagda pärlor som anges av pilen. Skala bar är 10 mikrometer. Motsvarar film 1 B) 2,5 X zoomat infoga från en time-lapse-film, som skildrar den angivna phagosome över en spännvidd på 85 minuter efter upptag, falsk-färgat för bättre synlighet med "thal" Look-up-tabell (LUT) i ImageJ. Den uppmätta phagosome ROI indikeras med den vita streckade linjen. De fall av dextran leverans och ackumulering i phagosome markeras med vita pilar. C) rättad fluorescenssignal av Texas Red 70kDa dextran levereras från lysosomer till angiven phagosome. D) Genomsnittlig fluorescens IntDen värden från 10 phagosomes inom de två indikerade cellerna ± SEM . Klicka här för att visa en större bild .

Discussion

I följande avsnitt kommer vi att diskutera kritiska steg i den presenterade metoden och dess begränsningar. Vidare kommer vi att ansluta några av de vanligaste problemen med sina lösningar, införa eventuella ändringar och överväga fördelarna med vår metod samt lämpliga kompletterande metoder för detta synsätt.

Framställningen av pärlorna, inklusive koppling av IgG till pärlytan, är av avgörande betydelse och användning av unfresh beredningar bör undvikas. I tillägg till detta, är det också viktigt att dextran framställs ur den frusna lager (utspätt och steriliserad) på nytt före varje experiment. Det är viktigt att lastningen av dextranet följer en exakt schema för att uppnå enhetlighet i cellulärt upptag och fördelning och ackumulering utrymmet. Dessutom är det viktigt att använda inte bara samma mikroskopi setup och mjukvaruinställningar, men också för att hålla de perifera förhållanden så konstant som möjligt (t.ex. temperature, _CO2, fukt, pärla-tillägg teknik, osv.). En annan kritisk punkt är valet av ett synfält eller cellen av intresse, bör provet Oscoutade innan start av avbildning för att välja celler som är representativa.

En av de viktigaste begränsningarna hos metoden är antalet försök som är nödvändiga för att ge signifikanta sampel storlekar. Den beskrivna metoden är relativt tid och arbetskrävande, eftersom antalet observer phagosomes på ett synfält, beroende på vald upplösning, är begränsad. Genom att samla resultaten av ett mycket lågt antal slumpmässigt valda phagosomes medför en risk att några extrema outliers kan ha en framträdande effekt på medelvärden. Större provstorlekar på andra sidan möjliggör maskering av phagosome-till-phagosome eller cell-till-cell variationer.

De vanligaste problemen som kan uppstå inkluderar föroreningar, brist på fagocytos och överdriven blekning och fototoxicitetseffekt på grund av laserljus.

Sterilitet, korrekt lagring och beredning av dextran är avgörande för att undvika föroreningar. Enligt vår erfarenhet, bör den köpta dextran inte betraktas som en steril lösning. Risken för kontamination kan minskas betydligt med omfattande centrifugering av beståndet och sterilfiltrering av utspädd dextranlösning. Å andra sidan, regelbundna framställningen av färska pärlsuspension, som innehåller proteiner och är känslig för kontamination kan också minska risken för föroreningar.

Brist på eller låga nivåer av fagocytos kan bero på att suboptimala IgG-beläggning av pärlorna. Därför är det viktigt att förbereda komponenter för IgG-koppling av pärlan (IgG-lösning, EDAC) nyligen och att inte använda kulor som är mer än 4 veckor gamla eller inte har hållits enbart vid 4 ° C. Eftersom pärlorna är kortfattat sonikeras före användning, rekommenderas att förberedaarbets portioner för att undvika upprepade ultraljudsbehandling av beståndet fjädring. En annan orsak till lägre än väntat fagocytisk prestanda kan vara ohälsosamt, suboptimalt odlade eller gamla celler, strikt följsamhet till rekommenderade odlingsbetingelserna för den använda celltypen är därför viktigt. Till exempel skulle driven trypsinization under skörden skada fagocytiska ytreceptorer och försämra fagocytisk kapacitet.

Överdriven fotoblekning kan vara ett stort problem med vissa fluoroforer. Justera mikroskopinställningar, dvs intensiteten hos exciteringsljuset och varaktigheten av provexponering, enligt bleknings mottaglighet av fluoroforen hjälper till att styra blekning. Med avseende på tidsintervallet mellan förvärv av på varandra följande ramar, en balans mellan ram-takt, vilket vid en högre frekvens ger högre tidsmässig upplösning och bättre uppenbarelse viktiga interaktionsdynamik, och blekningen av sonden har to vara drabbade. Den optimala balansen beror i första hand på de frågor som ska behandlas i den givna experiment. Justera skanningsupplösningen, svepfrekvens och linje eller ram medelvärdes representerar inställningar som kan ändras för att ytterligare optimera längden på prov exponering för excitation ljus. Tillgänglighet för vissa av dessa alternativ är dock bestäms av vilken typ av mikroskop system som används.

Samma allmänna riktlinjer bör följas för att minimera foto toxiska effekten av laser excitation ljus på cellerna. Denna effekt kan manifesteras som döden av celler som utsätts för laserljus under avbildning eller en markerad ökning av onaturliga morfologier ^20.

Här har vi presenterat en grundläggande och allmänna förfarande, som möjliggör ändringar och anpassning till olika experimentella inställningar. Som nämnts, kan denna metod användas för förlust-av-funktion studier liksom i knockout modeller,gen knockdown eller mutant proteinuttryck. Det möjliggör också för olika opsonisering strategier för att rikta specifika fagocytiska receptorer, användning av olika endosomal / lysosomala sonder samt studier av kemiska hämmare eller cytokiner.

Över expressionsstudier med olika fluorescerande fusionsproteiner och deras mutanter kan användas för att undersöka effekterna på avlämnandet av en lämplig sond till fagosomer. Dessutom kan analyseras kinetik och dynamik samspel av proteinet i sig med phagosomes. Det finns flera sonder tillgängliga som kan användas för dessa ändamål. Ett framträdande exempel på gemensam klass av sonder inkluderar Lysotracker grupp acidotropic färgämnen, som ofta används för att spåra proto lumen av endosomala fack samt phagosomal lumen. Beläggningen av pärlorna har en annan mängd av möjligheter. Ligander, inkluderande nukleinsyror såsom specifika CpG-ställena i bakterie-DNA ^21, bakteriellrial yta komponenter såsom LPS, proteiner såsom avidin, serumproteiner, inklusive komplementfaktorer (t.ex. C1q eller iC3b) alla kan passera kopplas till pärlor ^22-24. Detta möjliggör studier av rollen av dessa ligander i fagocytos och phagosome mognad. Med hjälp av signalmolekyler och immun mediatorer (t.ex. cytokiner) öppna en annan rad möjligheter.

Slutligen kan denna metod också byggas ut och anpassas för att genomföra direkta studier med mikroorganismer, till exempel genom att jämföra upptaget av levande vs dödats eller patogena kontra icke-patogena bakterier, även om den oregelbundna formen av bakterier innebär nya utmaningar under bildanalys.

Framtida tillämpningar av denna metod är så grenrör som de ändringar som kan tillämpas. Som ett nästa steg, kan ratio-metric analysmetoder anpassas. Kombination av pH-känsliga och pH-okänsliga fluorescerande färgämnen för bead-beläggning, eller att använda sig av enkla sonder till åtgärure phagosomal pH (t.ex. pHrodo, FluoProbes) såväl som föreningar som gör det möjligt att experimentellt följa kinetiken av protein och lipid nedbrytning inuti phagosome (t.ex. OVA, HRP, bovint serumalbumin och triglycerid lipassubstrat) finns tillgängliga ^{från 25 till 31.} Dessa tillsammans gör det möjligt att inrätta ett stort antal utrednings metoder baserade på den grundläggande metoden för levande cell imaging av phagosomes presenteras här.

Den beskrivna metoden kan uppnå mycket högre tids upplösningar jämfört med metoder som är baserade på phagosome isolering ^32. ELISA eller Western blot analyser av phagosomes kan representera ett mycket stort antal händelser på vissa tidpunkter, men data utgör en betydligt mer heterogen och potentiellt osynkroniserad befolkning av händelser. Flödescytometri baserade metoder teoretiskt möjligt för analysen ner till den enskilda cellnivå och på så sätt kan vara mindre benägna att heterogeneity of cellpopulationer men liknande problem med osäker synchronicity och behovet av mycket höga händelse räknas för tillförlitlig utvärdering härdar fortfarande. Ändå cytometry närmar sig med hög genomströmning, känslighet och reproducerbarhet av flödet ^33,34 gör dem ett optimalt komplement till den levande cell imaging tillvägagångssätt.

Sammantaget fördelen med vår metod ligger i noggrannhet och hög tidsupplösning med vilka enskilda phagosomes kan följas i sin mognadsprocess i levande celler. Jämfört med alla andra metoder som begränsar yttrande till färre tidpunkter, i icke-livsdugliga och förbehandlade celler, är det möjligt att här följa cellulära händelser dynamiskt och kontinuerligt under långa tidsperioder enligt lätt modifierbara fysiologiska förhållanden. Man skulle kunna beskriva i förhållande till upptaget av fagocyterande last, vilket möjliggör diskriminering av de stadier av fagocytos mer exakt. På så sätt gör det möjligt för synkronisering att inte ondast visualisera liknande beteende av phagosomes, utan gör det också möjligt att identifiera individuella skillnader på grund av t.ex. cell-till-cell variationer. Viktigast, kan dynamiken i interaktioner som kan vara nyckeln till att förstå komplexa interaktioner effektivt belysta i hög tidsupplösning genom att använda vår live-cell imaging strategi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM)	PAA, Austria	E15-009
Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM)	PAA, Austria	E15-047
Fetal Bovine Serum (FBS)	PAA, Austria	A15-151
L-Glutamine	PAA, Austria	M11-004
PBS	PAA, Austria	H15-002
Penicillin/Streptomycin	PAA, Austria	P11-010
WillCo-dish® Glass bottom dish (35 mm ∅, #1.5)	WillCo Wells, Netherlands	GWSt-3522
CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm	Greiner Bio one, Germany	627871	Alternative: Available as segmented
Carboxylated latex microspheres	Polysciences, USA	#09850	Available in different diameters, we used 3 μm
Polystyrene microparticles	Kisker Biotech, Germany	PPs-3.0COOH
Triton-X 100	ROTH, Germany	305.1.3
mouse whole IgG	Rockland, USA	010-0102
EDAC crosslinker	Sigma-Aldrich, USA	E6383-1g
10 mM Tris	Sigma-Aldrich,USA	T1503
1-ml syringe Omnifix -F	B.Braun, Germany	9161406V
26 G needle (0.45*25 mm)	B.Baun, Germany	4657683
RPMI 1640	PAA, Austria	E15-039
Horse Serum	Gibco, USA	16050-122
MES hydrate	Sigma-Aldrich, USA	M2933
0.2 μM syringe mounted filter	Sartorius, Germany	83.1826.001