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Bioengineering

एक Intein की मध्यस्थता कृत्रिम प्रोटीन hydrogel के संश्लेषण

Published: January 27, 2014 doi: 10.3791/51202
Automatic Translation
1, 1,2
1Artie McFerrin Department of Chemical Engineering, Texas A&M University, College Station, 2Department of Microbial and Molecular Pathogenesis, Texas A&M Health Science Center, Texas A&M University, College Station

Summary

हम एक विभाजन intein की मध्यस्थता प्रोटीन हाइड्रोजेल का संश्लेषण प्रस्तुत करते हैं. इस हाइड्रोजेल की इमारत ब्लॉकों प्रत्येक एक विभाजन intein की एक crosslinker और एक आधे के रूप में कार्य करता है कि एक Trimeric प्रोटीन की एक सबयूनिट युक्त दो प्रोटीन सहपॉलिमरों हैं. दो प्रोटीन सहपॉलिमरों का मिश्रण हाइड्रोजेल में है कि स्वयं assembles एक पॉलीपेप्टाइड इकाई उपज, एक intein पार splicing प्रतिक्रिया से चलाता है. यह हाइड्रोजेल अत्यधिक पीएच और तापमान स्थिर, कार्बनिक सॉल्वैंट्स के साथ संगत है, और आसानी से कार्यात्मक गोलाकार प्रोटीन को शामिल किया गया है.

Abstract

हम एक विभाजन intein उत्प्रेरित प्रोटीन पार splicing प्रतिक्रिया द्वारा मध्यस्थता एक अत्यधिक स्थिर प्रोटीन हाइड्रोजेल का संश्लेषण प्रस्तुत करते हैं. इस हाइड्रोजेल की इमारत ब्लॉकों प्रत्येक एक विभाजन intein की एक crosslinker और एक आधे के रूप में कार्य करता है कि एक Trimeric प्रोटीन की एक सबयूनिट युक्त दो प्रोटीन ब्लॉक सहपॉलिमरों हैं. एक अत्यधिक हाइड्रोफिलिक यादृच्छिक कुंडल पानी बनाए रखने के लिए ब्लॉक सहपॉलिमरों में से एक में डाला जाता है. दो प्रोटीन ब्लॉक copolymers का मिश्रण दोनों छोर पर crosslinkers साथ एक पॉलीपेप्टाइड इकाई उपज, एक intein पार splicing प्रतिक्रिया से चलाता है कि एक हाइड्रोजेल में तेजी से स्वयं assembles. यह हाइड्रोजेल 50 डिग्री सेल्सियस तक, और कार्बनिक विलायकों में तापमान पर, दोनों अम्लीय और बुनियादी परिस्थितियों में बहुत ही स्थिर है. कतरनी प्रेरित टूटना के बाद हाइड्रोजेल तेजी से सुधारों. हाइड्रोजेल निर्माण खंड में एक "डॉकिंग स्टेशन पेप्टाइड" का समावेश "डॉकिंग प्रोटीन" टैग लक्ष्य प्रोटीन की सुविधाजनक समावेश सक्षम बनाता है.हाइड्रोजेल, टिशू कल्चर विकास मीडिया के साथ संगत है 20 केडीए अणुओं के प्रसार का समर्थन करता है, और bioactive गोलाकार प्रोटीन की स्थिरीकरण में सक्षम बनाता है. एक कार्बनिक विलायक संगत biocatalyst रूप intein की मध्यस्थता प्रोटीन हाइड्रोजेल का आवेदन हॉर्सरैडिश peroxidase एंजाइम encapsulating और अपनी गतिविधि corroborating द्वारा प्रदर्शन किया गया.

Introduction

प्रोटीन की पूरी तरह से बनाया hydrogels काफी ऊतक इंजीनियरिंग, दवा वितरण और biofabrication 1 के रूप में विविध क्षेत्रों अग्रिम करने की क्षमता ले. वे biocompatibility और noninvasively bioactive गोलाकार प्रोटीन का समावेश का समर्थन करने की क्षमता सहित पारंपरिक सिंथेटिक बहुलक हाइड्रोजेल अधिक लाभ प्रदान करते हैं.

इस काम में, हम एक प्रोटीन स्थिरीकरण पाड़ के रूप में एक विभाजन intein की मध्यस्थता प्रोटीन पार splicing प्रतिक्रिया और अपने आवेदन (चित्रा 1) के माध्यम से गठित एक उपन्यास प्रोटीन hydrogel के विकास का वर्णन. इस हाइड्रोजेल के लिए इमारत ब्लॉकों प्रत्येक (और आईसी) intein एक विभाजन और एक multimeric crosslinker प्रोटीन की एक सबयूनिट के एन या सी टर्मिनल टुकड़ा जिसमें दो प्रोटीन ब्लॉक सहपॉलिमरों हैं. Intein नोस्टॉक punctiforme (NPU) से DnaE 2,3 intein विभाजन और एक छोटे प्रोटीन trimeric Pyrococcus से (12 केडीए) CutA horikoshii <रूप में इस्तेमाल किया गया था/ उन्हें> crosslinker प्रोटीन 4,5 के रूप में इस्तेमाल किया गया था. विभिन्न crosslinkers एक अत्यधिक Crosslinked प्रोटीन नेटवर्क (हाइड्रोजेल) के गठन के लिए अग्रणी intein उत्प्रेरित पार splicing प्रतिक्रिया के माध्यम से शामिल हो गए हैं. NPU intein क्योंकि अपनी तेजी से प्रतिक्रिया कैनेटीक्स (टी 1/2 = 63 सेकंड) और उच्च पार splicing उपज (करीब 80%) 2,3 के लिए चुना गया था. CutA प्रोटीन इसकी उच्च स्थिरता की वजह से crosslinker के रूप में चुना गया था. CutA trimers के पास 150 डिग्री सेल्सियस के विकृतीकरण तापमान है और जितना एम 5 के रूप में guanidine हाइड्रोक्लोराइड 4,6 युक्त समाधान में trimeric चतुर्धातुक संरचना बरकरार रहती है. विभिन्न crosslinkers के बीच सबयूनिट विनिमय शारीरिक हाइड्रोजेल सतह कटाव 7 के एक प्रमुख योगदानकर्ता है, CutA में बहुत मजबूत इंटर सबयूनिट बातचीत के लिए एक अधिक स्थिर हाइड्रोजेल के लिए अग्रणी, ऐसे सबयूनिट एक्सचेंजों को हतोत्साहित करना चाहिए. इन इमारत ब्लॉकों में से एक भी पानी की सुविधा के लिए मध्य ब्लॉक के रूप में एक अत्यधिक हाइड्रोफिलिक पेप्टाइड एस टुकड़ा होता हैअवधारण 8.

दो हाइड्रोजेल इमारत ब्लॉकों का मिश्रण दोनों टर्मिनलों पर crosslinkers साथ एक लंबे समय तक पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला पैदा करने, टुकड़े intein में और आईसी के बीच एक पार splicing प्रतिक्रिया आरंभ करता है. कई ऐसे आणविक इकाइयों से crosslinkers एक अत्यधिक Crosslinked हाइड्रोजेल नेटवर्क (चित्रा 1 ए) के गठन, एक दूसरे के साथ बातचीत. एक विशिष्ट "डॉकिंग स्टेशन पेप्टाइड" (डीएसपी) एक "डॉकिंग प्रोटीन" (डीपी) टैग हाइड्रोजेल में लक्ष्य प्रोटीन की स्थिर स्थिरीकरण की सुविधा के लिए हाइड्रोजेल इमारत ब्लॉकों में से एक में शामिल किया है. हाइड्रोजेल विधानसभा मध्यस्थता intein एक विभाजन का उपयोग लक्ष्य प्रोटीन पूर्व हाइड्रोजेल गठन के लिए लोड कर रहे हैं, के रूप में प्रोटीन हाइड्रोजेल संश्लेषण के लिए अतिरिक्त लचीलापन प्रदान करता है, लेकिन यह भी पूरी हाइड्रोजेल भर में लक्ष्य प्रोटीन की उच्च घनत्व, वर्दी लदान के लिए सक्षम बनाता ही नहीं.

intein की मध्यस्थता प्रोटीन हाइड्रोजेल अत्यधिक स्टेशन हैसाथ जलीय घोल में ble छोटे से कोई कमरे के तापमान पर 3 महीने के बाद detectable कटाव. स्थिरता PHS (6-10) और तापमान (4-50 डिग्री सेल्सियस) की एक विस्तृत श्रृंखला में बनाए रखा, और हाइड्रोजेल भी कार्बनिक विलायकों के साथ संगत है. हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) और हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी): यह हाइड्रोजेल दो गोलाकार प्रोटीन का स्थिरीकरण के लिए प्रयोग किया जाता है. उत्तरार्द्ध प्रोटीन entrapping हाइड्रोजेल एक कार्बनिक विलायक में Biocatalysis प्रदर्शन करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

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Protocol

1. प्लाज्मिड निर्माण

नोट: सभी जीनों निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार Phusion उच्च फिडेलिटी डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग कर मानक पीसीआर प्रतिक्रियाओं के तहत परिलक्षित किया गया. क्लोनिंग के लिए इस्तेमाल किया प्राइमर पहले 9 वर्णित किया गया है. सभी निर्माणों 1 टेबल में सूचीबद्ध हैं.

  1. CutA-NpuN (एन, 1 टेबल) उत्पन्न करने के लिए:
    1. पीसीआर उपयुक्त प्राइमरों का उपयोग कर, क्रमशः plasmids pET30-CutA-Tip1 10 और KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11 से CutA और NpuN जीन बढ़ाना.
    2. उचित प्रतिबंध एंजाइमों के साथ इन टुकड़ों को पचाने और क्रमिक रूप से T7 प्रमोटर और एन (2A चित्रा) उत्पन्न करने के लिए एक सी टर्मिनल 6xHistidine टैग के बीच pET26b वेक्टर में इन टुकड़ों को सम्मिलित करें.
  2. NpuC-S-CutA (सी, 1 टेबल) उत्पन्न करने के लिए:
    1. पीसीआर बढ़ाना NpuC, CutA और एस fragmenउपयुक्त प्राइमरों का उपयोग प्लाज्मिड KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, pET30-CutA-Tip1 10 और pQE9 एसी 10 क्रमशः ATRP 12, से टी [एजी 3 (खूंटी) 10],.
    2. उचित प्रतिबंध एंजाइमों के साथ इन टुकड़ों को पचाने और क्रमिक रूप से T7 प्रमोटर और सी (चित्रा 2B) उत्पन्न करने के लिए एक सी टर्मिनल 6xHistidine के बीच pET26b वेक्टर में इन टुकड़ों को सम्मिलित करें.
  3. : NpuC-S-SH3 lig-CutA (सी SH3 lig, 1 टेबल) उत्पन्न करने के लिए
    1. पीसीआर बढ़ाना CutA एक SH3 lig (PPPALPPKRRR) और टुकड़ा SH3 lig-CutA उत्पन्न करने के लिए एक लचीला linker (GGGGS) 2 युक्त प्राइमरों का उपयोग.
    2. टुकड़ा SH3 lig-CutA साथ सी से CutA जीन बदलें.
  4. SH3-GFP (1 टेबल) उत्पन्न करने के लिए:
    1. का उपयोग प्लाज्मिड pJD757 13 से SH3 जीन बढ़ानाउपयुक्त प्राइमरों.
    2. GFP जीन को इस टुकड़ा फ्यूज और T7 प्रमोटर (चित्रा -2) और एक सी टर्मिनल 6xHistidine टैग के बीच pET26b वेक्टर में डालें.

2. प्रोटीन अभिव्यक्ति

  1. उपयुक्त प्लाज्मिड अभिव्यक्ति के साथ रासायनिक सक्षम Escherichia कोलाई BL21 (DE3) का 50 μl रूपांतरण.
  2. परिवर्तन के बाद, क्रमानुसार इन कोशिकाओं को कमजोर, और Luria-Bertani (पौंड) पर उन्हें थाली / 50 माइक्रोग्राम / एमएल kanamycin युक्त अगर प्लेटों.
  3. ~ 15 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर तब्दील कोशिकाओं से युक्त प्लेटें सेते हैं.
  4. ऊष्मायन के बाद, 50-100 कालोनियों होता है कि एक थाली लेने और लेग शोरबा के 5 मिलीलीटर में सभी कालोनियों resuspend.
  5. स्थानांतरण 1 एल लेग शोरबा युक्त केनामाइसिन (50 माइक्रोग्राम / एमएल) के लिए निलंबन और 250 rpm पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को विकसित. 600 एनएम (600 आयुध डिपो) पर absorbance मॉनिटर. आयुध डिपो 600 ~ 0.8 जब तक संस्कृति के लिए आगे बढ़ें.
    1. सी और सी SH3 lig के लिए, संस्कृति (1 मिमी अंतिम एकाग्रता) isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) जोड़कर प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित और 250 rpm पर मिलाते हुए, जबकि 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति सेते हैं.
    2. एन और SH3-GFP के लिए, संस्कृति शांत करने के लिए ~ ~ 5 मिनट के लिए एक बर्फ के पानी के स्नान में संस्कृति फ्लास्क डुबो कर 18 डिग्री सेल्सियस. संस्कृति (1mm अंतिम एकाग्रता) IPTG जोड़कर प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित और 250 rpm पर मिलाते हुए, जबकि 14-18 घंटे के लिए 18 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति सेते हैं.
  6. प्रोटीन अभिव्यक्ति के बाद गोली इकट्ठा करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 6000 XG पर संस्कृति अपकेंद्रित्र. -80 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक पर स्टोर सेल गोली.

3. प्रोटीन शुद्धीकरण

  1. एन के शोधन (स्थितियों denaturing)
    1. 10 गीला गोली की मिलीग्राम / छ बफर (तालिका 2) में Resuspend सेल छर्रों.
    2. Immersएक बर्फ का पानी स्नान में गोली निलंबन ई और (1 सेकंड नाड़ी और 1 मिनट के लिए 6 सेकंड ठहराव के साथ एम्प 10,) sonication द्वारा कोशिकाओं को बाधित.
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 16,000 XG पर lysate अपकेंद्रित्र
    4. सतह पर तैरनेवाला त्यागें. (8 एम यूरिया युक्त) बफर महंगाई भत्ते में गोली Resuspend और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 16,000 XG पर निलंबन अपकेंद्रित्र
    5. पहले बफर डीए के साथ equilibrated एक 5 मिलीलीटर नी nitrilotriacetic एसिड (NTA) स्तंभ के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला गुजरती हैं.
    6. 45 मिमी imidazole के साथ पूरक बफर डीए की 30 मिलीलीटर के साथ स्तंभ धो लें. 150 मिमी imidazole के साथ पूरक बफर डीए का 20 मिलीलीटर का उपयोग कर शुद्ध प्रोटीन Elute.
    7. 3.1.7.1 या 3.1.7.2 में दिए गए निम्न विधियों में से किसी एक के द्वारा <1 मिमी के लिए प्रोटीन के नमूने में यूरिया एकाग्रता में कमी:
      1. <20 केडीए कटऑफ साथ ट्यूब का उपयोग 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर DPBS बफर (तालिका 2) में प्रोटीन Dialyze.
      2. अपकेंद्रित्र एक 30 और # में प्रोटीन शुद्ध किया160, 2800 XG पर केडीए अल्ट्रा निस्पंदन स्पिन स्तंभ, 4 डिग्री सेल्सियस मात्रा तक कम से कम 1 मिलीलीटर है. प्रोटीन नमूना पतला करने के लिए स्तंभ के लिए 14 मिलीलीटर DPBS बफर जोड़ें. Centrifugation / कमजोर पड़ने तीन गुना अधिक चरणों को दोहराएँ.
    8. बफर विनिमय के बाद, शुद्ध प्रोटीन (अंतिम 2 मिमी) dithiothreitol (डीटीटी) जोड़ने के लिए और 2,800 XG पर एक 30 केडीए अल्ट्रा निस्पंदन स्पिन स्तंभ, 4 डिग्री सेल्सियस के माध्यम से centrifugation द्वारा ~ 100 मिलीग्राम / एमएल के लिए प्रोटीन ध्यान
    9. उपयोग करें जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रित प्रोटीन और दुकान विभाज्य.
  2. सी और सी SH3 lig का शोधन (देशी हालत)
    1. बफर बी 10 गीला गोली की मिलीग्राम / छ 1x protease अवरोध कॉकटेल के साथ पूरक (पीएच 6.0) (2 तालिका) में Resuspend सेल छर्रों. लक्ष्य प्रोटीन के proteolytic गिरावट को कम करने के लिए अम्लीय बफर का प्रयोग करें.
    2. 3.1.2 में वर्णित के रूप में sonication द्वारा सेल निलंबन बाधित. LYS अपकेंद्रित्र4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 16,000 XG पर खाया और सतह पर तैरनेवाला रखना.
    3. पहले बफर बी के साथ equilibrated एक 5 मिलीलीटर नी NTA स्तंभ के माध्यम से घुलनशील lysate दर्रा
    4. बफर बी के साथ धो स्तंभ 45 मिमी imidazole के साथ पूरक, और 150 मिमी imidazole के साथ पूरक बफर बी की 20 मिलीलीटर में लक्ष्य प्रोटीन elute.
    5. सी के लिए, 3.2.6 कदम को छोड़. सी SH3 lig के लिए, कदम के रूप में दी आंशिक रूप से अपमानित प्रोटीन को हटाने के लिए एक अतिरिक्त आयन एक्सचेंज शुद्धि कदम 3.2.5.3 करने के लिए 3.2.5.1 बाहर ले
      1. 3.1.7 में वर्णित प्रक्रिया के बाद <1 मिमी सी SH3 lig में NaCl एकाग्रता में कमी.
      2. पहले से सोडियम फास्फेट बफर (50 मिमी, 7.0 पीएच) के साथ equilibrated एक 5 मिलीलीटर आयनों एक्सचेंजर मनके agarose मैट्रिक्स स्तंभ पर लक्ष्य प्रोटीन लोड.
      3. 10 मिमी Tris-एचसीएल 8.0 पीएच buffe युक्त समाधान से एक ढाल चलाकर स्तंभ से Elute लक्ष्य प्रोटीन1 एम NaCl के साथ पूरक ही बफर युक्त समाधान के लिए आर. सोडियम सल्फेट dodecyl polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) के आधार पर सबसे अधिक शुद्धता के साथ प्रोटीन क्षालन और पूल के नमूने के दौरान नमूने ले लो.
    6. 3.1.7 में वर्णित है, DPBS बफर में शुद्ध प्रोटीन का आदान बफर.
    7. शुद्ध प्रोटीन (अंतिम एकाग्रता 2 मिमी) डीटीटी जोड़ें और 3.1.8 में वर्णित के रूप में ~ 100 मिलीग्राम / एमएल एक 30 केडीए अल्ट्रा निस्पंदन स्पिन स्तंभ का उपयोग करने के लिए प्रोटीन ध्यान. विभाज्य और दुकान -80 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक पर प्रोटीन ध्यान केंद्रित किया.
  3. SH3-GFP की शुद्धि
    1. 10 गीला गोली की मिलीग्राम / छ बफर का उपयोग Resuspend सेल छर्रों.
    2. 3.1.2 में वर्णित के रूप में sonication द्वारा गोली निलंबन बाधित.
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 16,000 XG पर lysate अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा.
    4. पहले से साथ equilibrated एक 5 मिलीलीटर नी NTA स्तंभ के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला (घुलनशील lysate) पासबफर ए
    5. बफर के 30 मिलीलीटर के साथ स्तंभ धो 45 मिमी imidazole के साथ पूरक. बफर के 20 मिलीलीटर 150 मिमी imidazole के साथ पूरक का उपयोग कर शुद्ध प्रोटीन Elute.
    6. बफर 3.1.7 में वर्णित है कि इसी तरह के एक दृष्टिकोण का उपयोग DPBS बफर में शुद्ध प्रोटीन का आदान प्रदान करने के लिए और प्रोटीन ध्यान ~ 150 मिलीग्राम / 3.1.8 में वर्णित के रूप में एक 30 केडीए अल्ट्रा निस्पंदन स्पिन स्तंभ का उपयोग एमएल.
    7. विभाज्य और दुकान -80 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक पर प्रोटीन शुद्ध किया.
  4. CutA युक्त शुद्ध नमूने के एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण
    1. NaCl ~ 1 मिमी की एकाग्रता कम करने के लिए डबल आसुत जल में प्रत्येक शुद्ध प्रोटीन पतला. इस NaCl एकाग्रता में, CutA trimer प्रोटीन का सबसे एसडीएस पृष्ठ जैल पर monomers के रूप में चला रहे हैं.
    2. 2x एसडीएस नमूना बफर (0.5 एम Tris-एचसीएल, 6.8 पीएच, ग्लिसरॉल, 10% डब्ल्यू एसडीएस वी /, 0.1% V ब्रोमो फिनोल नीले, 2% β-mercaptoethanol / डब्ल्यू 20%), 95 डिग्री सेल्सियस पर incubated साथ नमूने मिक्स 5 मिनट के लिए.
    3. सैम लोडमंदिरों में एक 12% एसडीएस पृष्ठ जेल पर. 50 मिनट ~ के लिए 200 वी के एक निरंतर वोल्टेज में वैद्युतकणसंचलन बाहर ले.
    4. मानक प्रोटोकॉल (चित्रा 1C) निम्नलिखित Coomassie शानदार नीले R250 के साथ धुंधला करके जैल में प्रोटीन का निरीक्षण करें.

4. Hydrogel गठन

नोट: जब तक अन्यथा नोट इस अध्ययन में किए गए नमूना हाइड्रोजेल प्रत्येक हाइड्रोजेल निर्माण खंड के 1.6 मिमी होती है. इस प्रोटीन एकाग्रता एक नरम और स्थिर हाइड्रोजेल पैदावार. चेतावनी: सोडियम azide (नेन 3) जीवाणु संक्रमण को रोकने के लिए वी / डब्ल्यू 0.5% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए हाइड्रोजेल में जोड़ा जाता है. NaN 3 बेहद जहरीला है और सामग्री सुरक्षा डाटा शीट में संकेत के रूप में अत्यधिक सावधानी से नियंत्रित किया जाना चाहिए.

  1. एक 100 μl नमूना हाइड्रोजेल में 1.6 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने की आवश्यकता केंद्रित प्रोटीन में से प्रत्येक के लिए मात्रा की गणना. उदाहरण के लिए:
    एन की एकाग्रता:100 मिलीग्राम / मिलीलीटर
    एन के आण्विक वजन: 26.3 केडीए (1 टेबल देखें)
    वांछित मात्रा: 100 μl वांछित एकाग्रता: 1.6 मिमी
  2. एक 100 μl हाइड्रोजेल (1.6 मिमी) बनाने के लिए, सी मिक्स (एक्स μl, मात्रा 4.1 के अनुसार गणना) 5% NaN 3 (10 μl) के साथ, 100 मिमी डीटीटी (5 μl) और एन (वाई μl, मात्रा के अनुसार गणना 4.1) एक 2 मिलीलीटर कांच की शीशी के अंदर.
  3. 100 μl के अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए शीशी (वाई) μl - - ​​एक्स (85), और स्वयं एक विंदुक टिप का उपयोग कर एक घूमता प्रस्ताव के माध्यम से सभी घटकों मिश्रण DPBS बफर जोड़ें. नोट: समाधान मिश्रण पर बहुत चिपचिपा हो जाता है.
  4. हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए 8000 XG पर 2 मिनट के लिए मिश्रण अपकेंद्रित्र.
  5. कमरे में मिश्रण सेतेintein पार splicing प्रतिक्रिया पूरा होने तक पहुँचने के लिए अनुमति देने के लिए रातोंरात तापमान. उल्टा ट्यूब बदल कर हाइड्रोजेल गठन की पुष्टि करें. एक हाइड्रोजेल बनाई है, तो प्रोटीन नहीं बहेगा.
  6. 3.4 (चित्रा 1C) में वर्णित के रूप में, 4.2 कदम से पहले और एक एसडीएस पृष्ठ जेल पर 4.5 कदम के बाद एकत्र नमूनों (0.5 μl प्रत्येक) की जाँच करके intein पार splicing उपज का अनुमान है.

5. डॉकिंग प्रोटीन (डीपी) और डॉकिंग स्टेशन के माध्यम से GFP का स्थिरीकरण पेप्टाइड (डीएसपी) इंटरेक्शन

  1. एक 50 μl GFP-क्रियाशील हाइड्रोजेल (1.2 मिमी) बनाने के लिए एक 1.7 में 01:01 दाढ़ अनुपात में, (4.1 के अनुसार गणना, एक्स μl) सी SH3 lig गठबंधन और SH3-GFP (वाई μl, 4.1 के अनुसार गणना) एमएल microcentrifuge ट्यूब और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण सेते हैं.
  2. एक्स - - <5% NaN 3 (5 μl), 100 मिमी डीटीटी (2.5 μl), (42.5 जोड़ेंएक ही ट्यूब के लिए उन्हें> वाई) μl DPBS. एन सी SH3 lig की एक 1:1 दाढ़ अनुपात को प्राप्त करने के लिए एन (वाई μl, 4.1 के अनुसार गणना) जोड़ें. एक घूमता प्रस्ताव द्वारा एक विंदुक टिप का उपयोग करके नमूना मिलाएं.
  3. 2 मिनट के लिए 8000 XG पर मिश्रण अपकेंद्रित्र और अंधेरे में रात भर कमरे के तापमान पर मिश्रण सेते हैं. ऊष्मायन के दौरान SH3-GFP रूपों encapsulating एक हाइड्रोजेल.

6. कार्बनिक विलायक में enzymatic प्रतिक्रिया के लिए एक स्थिरीकरण पाड़ के रूप में 1.6 मिमी hydrogel के इस्तेमाल की

  1. एक मॉडल एंजाइम के रूप में एचआरपी का प्रयोग करें. DPBS में एचआरपी (28 मिलीग्राम / एमएल या 0.63 मिमी) के एक शेयर समाधान तैयार करें.
  2. एचआरपी entrapping एक 30 μl हाइड्रोजेल (1.6 मिमी) बनाने के लिए, सी एक अंदर एचआरपी (2 μl), 5% NaN 3 (3 μl) और डीटीटी (100 मिमी के 1.5 μl) के साथ (एक्स μl, 4.1 के अनुसार गणना) गठबंधन 1.7 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब.
  3. एन (वाई जोड़ें </ उन्हें> 4.1 के अनुसार गणना μl,) और DPBS (23.5 - X - वाई) μl. एक घूमता प्रस्ताव के साथ एक विंदुक टिप के साथ मिलाएं.
  4. 2 मिनट के लिए 8000 XG पर मिश्रण अपकेंद्रित्र और रात भर कमरे के तापमान पर सेते हैं.
    चेतावनी: निम्नलिखित गतिविधि परख के लिए इस्तेमाल प्रतिनिधियों अत्यधिक विषाक्त कर रहे हैं. इसी सामग्री सुरक्षा डाटा शीट से विशिष्ट सुरक्षा सिफारिशों का प्रयोग करें.
  5. Enzymatic प्रतिक्रिया के लिए, एन हेपटैन 14 में एन, एन डाइमिथाइल-P-phenylene Diamine (5.8 मिमी), फिनोल (5.8 मिमी) और tert-butyl hydroperoxide (2.9 मिमी) युक्त प्रतिक्रिया कॉकटेल के 1 मिलीलीटर में हाइड्रोजेल डूब. मैन्युअल हाइड्रोजेल और विलायक के संपर्क सतह क्षेत्र को बढ़ाने के लिए एक विंदुक टिप का उपयोग कर जेल बाधित.
  6. एक प्लेट रीडर (चित्रा 5) में 546 एनएम पर अलग अलग समय पर लिए गए नमूनों की ऑप्टिकल absorbance को मापने के द्वारा, एचआरपी उत्पाद, एक indophenol प्रकार डाई का पता लगाने.
    7. </ राजभाषा>

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Representative Results

Intein की मध्यस्थता प्रोटीन हाइड्रोजेल गठन के लिए एक योजनाबद्ध चित्रा 1 ए में प्रस्तुत किया है. हाइड्रोजेल की इमारत ब्लॉकों प्रोटीन CutA-NpuN (एन) और NpuC-S-CutA (सी) (चित्रा 1 ए, 1 टेबल) सहपॉलिमरों हैं. NpuN / सी नोस्टॉक punctiforme (NPU) से intein स्वाभाविक रूप से विभाजित DnaE की N-/C-fragments हैं. CutA Pyrococcus horikoshii 4,5 से एक स्थिर Trimeric प्रोटीन है. (आंकड़े 1 ए और 1 सी): ligated उत्पाद (CutA-S-CutA जम्मू) - कम एजेंट डीटीटी की उपस्थिति में शुद्ध और एन सी के मिश्रण का एक तिहाई प्रोटीन के गठन को प्रेरित करता है. व्यक्तिगत रूप से, हाइड्रोजेल इमारत ब्लॉकों एन और सी के रूप में चिपचिपा तरल पदार्थ (चित्रा 1 बी) में मौजूद हैं. एन और सी का मिश्रण हाइड्रोजेल 15,16 (चित्रा 1 बी) के गठन का संकेत उलटा के बाद एक गिलास शीशी के तल पर बनाए रखा है कि एक पारदर्शी अर्द्ध ठोस सामग्री, पैदावार 18,19.

इस intein की मध्यस्थता प्रोटीन हाइड्रोजेल (1.6 मिमी) उच्च समाधान स्थिरता दर्शाती है. छोटे से कोई DPBS बफर में 22 डिग्री सेल्सियस पर 21 दिनों के बाद Crosslinked हाइड्रोजेल पाड़ की कमी हो जाती है, DPBS बफर में जारी प्रोटीन की कुल राशि केवल थोड़ा 100 संभालने spliced ​​intein हाइड्रोजेल से की सैद्धांतिक राशि (से अधिक है % intein पार splicing दक्षता) (चित्रा 3). Densitometry हाइड्रोजेल गठन के दौरान, ट्रांस splicing प्रतिक्रियाओं (चित्रा 1C) ~ 80% कुशल थे, कि पता चला. एसडीएस पृष्ठ जेल विश्लेषण केवल न्यूनतम है कटाव को Crosslinked हाइड्रोजेल पाड़ की है कि नुकसान की पुष्टि पार spliced ​​उत्पाद की मात्रा हाइड्रोजेल के आसपास बफर (चित्रा 3 बी, बैंड जे) में मौजूद थे ट्रेस दिखाया. हाइड्रोजेल के आसपास बफर में मुख्य प्रोटीन मौजूद intein बाहर spliced ​​है. कटाव का कोई स्पष्ट संकेत में मनाया गया3 महीने (चित्रा 3A इनलेट) के लिए कमरे के तापमान पर जलीय घोल में डूबे एक undisturbed हाइड्रोजेल. हाइड्रोजेल 37 डिग्री सेल्सियस (चित्रा -3 सी) पर और दोनों अम्लीय और बुनियादी बफ़र्स (चित्रा 3 डी) में भी अत्यधिक स्थिर है.

प्रोटीन स्थिरीकरण की सुविधा के लिए, एक प्रोटीन की जोड़ी और इसके पेप्टाइड ligand हाइड्रोजेल पाड़ में ब्याज की प्रोटीन गोदी करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. हम SH3 प्रोटीन, अनुकूलक प्रोटीन CRK से एक एसआरसी अनुरूपता 3 डोमेन, समावेश के लिए डॉकिंग स्टेशन पेप्टाइड (डीएसपी) के रूप में एक ब्याज की प्रोटीन, और अपने ligand (SH3 एलआईजी) को विलय के लिए डॉकिंग प्रोटीन (डीपी) के रूप में चुना हाइड्रोजेल पाड़. इस बातचीत जोड़ी क्योंकि अपेक्षाकृत छोटे आणविक आकार (SH3 के लिए 56 ए.ए. और SH3 lig के लिए 11 एए) और उच्च आत्मीयता (कश्मीर डी = 0.1 माइक्रोन) 17,18 के लिए चुना गया था. SH3 lig सी SH3 lig के लिए फार्म NpuC और CutA के बीच डाला गया था(1 टेबल). SH3 प्रोटीन SH3-GFP के लिए फार्म का एक मॉडल लक्ष्य गोलाकार प्रोटीन, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के एन टर्मिनस से इनकार किया गया था. प्रोटोकॉल (धारा 5, चित्रा -4 ए) में वर्णित प्रक्रिया 1.2 मिमी पार spliced ​​हाइड्रोजेल रीढ़ इमारत ब्लॉकों और 1.2 मिमी GFP युक्त हाइड्रोजेल पैदावार. GFP युक्त हाइड्रोजेल DPBS बफर में 21 दिनों के बाद 35% कुल प्रोटीन नुकसान ~ साथ GFP (चित्रा 4 बी) की कमी हाइड्रोजेल के लिए एक समान स्थिरता का प्रदर्शन किया. कटाव बफर में मौजूद प्रोटीन के अधिकांश cleaved inteins थे. SH3 lig युक्त हाइड्रोजेल से SH3-GFP के leaching दर, 30% 3 सप्ताह के बाद ~ (समय, चित्रा 4C की इसी अवधि में> 70% प्रोटीन हानि) SH3 lig कमी एक हाइड्रोजेल से उस की तुलना में काफी छोटा होता है. हाइड्रोजेल में स्थिर SH3-GFP पराबैंगनी प्रकाश के तहत चमक रहा है. चित्रा 4D, डॉकिंग स्टेशन pepti युक्त हाइड्रोजेल में देखाSH3 lig कमी हाइड्रोजेल अनिवार्य रूप से nonfluorescent हो जाता है, जबकि डी SH3 lig 3 सप्ताह के बाद GFP प्रतिदीप्ति की सबसे बरकरार रखती है. यह एक उच्च आत्मीयता डी पी / डीएसपी जोड़ी का उपयोग आगे immobilized प्रोटीन की leaching दर को कम कर सकते हैं कि उम्मीद है.

इस प्रयोग में, GFP लक्ष्य प्रोटीन के रूप में इस्तेमाल किया गया था, लेकिन, किसी भी डीपी टैग प्रोटीन आसानी से इस हाइड्रोजेल में स्थिर हो सकता है. इस प्रकार, intein की मध्यस्थता प्रोटीन हाइड्रोजेल प्रोटीन स्थिरीकरण के लिए एक सामान्य पाड़ प्रदान करना चाहिए. immobilized GFP के घनत्व इस काम में प्रदर्शित ~ हाइड्रोजेल का 33% mol है. कई डीएसपी हाइड्रोजेल निर्माण खंड में शामिल कर रहे हैं जब एक उच्च स्थिरीकरण घनत्व संभवतः प्राप्त किया जा सकता है.

अगला, एचआरपी एंजाइम कार्बनिक विलायकों में Biocatalysis समर्थन करने की क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए प्रोटीन हाइड्रोजेल में शामिल किया गया था. एंजाइम गतिविधि की ऑक्सीडेटिव युग्मन की निगरानी के द्वारा मापा गया था 14 tert-butyl hydroperoxide साथ एन डाइमिथाइल-P-phenylene Diamine और फिनोल. परिकल्पना हाइड्रोजेल का हाइड्रेटेड पर्यावरण कार्बनिक विलायक के denaturing प्रभाव से जुड़ी एंजाइम की रक्षा करेगा कि था. 0.042 मिमी एचआरपी युक्त hydrogel substrates युक्त एन हेपटैन में डूब गया था. कार्बनिक विलायक में डुबो के बाद, एचआरपी युक्त हाइड्रोजेल मैन्युअल रूप हाइड्रोफिलिक हाइड्रोफोबिक इंटरफेस क्षेत्र (चित्रा 5 ब) को बढ़ाने के लिए छोटे समूहों में ठप हो गई थी. Hydrogel-शामिल एचआरपी प्रभावी रूप से एक वर्णमिति उत्पाद (चित्रा 5C, त्रिकोण) को जन्म दे रही है, तेजी से ऑक्सीकरण प्रतिक्रिया उत्प्रेरित. उत्पाद संचय प्रयोग के दौरान थोड़ा करने वाली कोई एंजाइम निष्क्रियता का संकेत एक रैखिक ढाल इस प्रकार है. जैविक प्रतिक्रिया कॉकटेल में सीधे भंग एचआरपी साथ नियंत्रण प्रतिक्रिया (डेटा विकृतीकरण नहीं एंजाइम को नगण्य उत्प्रेरक गतिविधि के कारण का प्रदर्शन ) दिखाया. एचआरपी पहली कार्बनिक विलायक के अलावा द्वारा पीछा DPBS में भंग रूपांतरण को उत्प्रेरित करने में सक्षम था, लेकिन एक बहुत कम प्रतिक्रिया दर (चित्रा 5C, हलकों) में. DPBS में भंग एंजाइमों की कम रूपांतरण दर के कारण DPBS और सब्सट्रेट / उत्पाद प्रसार की दर को सीमित करता है जो कार्बनिक विलायक के बीच छोटे interfacial क्षेत्र होने की संभावना है. प्रभावी ढंग से हाइड्रोजेल अंदर 'ताले' पानी और कार्बनिक विलायक रोकता हाइड्रोजेल आंतरिक उपयोग करने के लिए जो हाइड्रोजेल रीढ़ की हड्डी में अत्यधिक हाइड्रोफिलिक एस टुकड़ा, के निगमन कार्बनिक विलायक के अप्राकृतिकरण प्रभाव का सामना करने के हाइड्रोजेल सक्षम बनाता है. इन परिणामों intein की मध्यस्थता प्रोटीन हाइड्रोजेल कार्बनिक विलायक में एंजाइमी प्रतिक्रियाओं के लिए एक प्रभावी पाड़ हो सकता है कि संकेत मिलता है.

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चित्रा 1. Intein की मध्यस्थता प्रोटीन हाइड्रोजेल. टर्मिनी दोनों पर crosslinker प्रोटीन के साथ एक विस्तारित प्रोटीन श्रृंखला (जे) का गठन हो सके कि ट्रांस splicing प्रतिक्रिया intein (ए) Schematics. Intein की मध्यस्थता प्रोटीन बंधाव पर एकाधिक जम्मू प्रोटीन noncovalently चेन सहयोगी और, से crosslinker प्रोटीन, हाइड्रोजेल गुणों के साथ एक उच्च पार से जुड़े प्रोटीन नेटवर्क के गठन को प्रेरित. NpuN / सी: N-/C-fragment intein. (बी) के शुद्ध और एन सी का मिश्रण एक अत्यधिक Crosslinked हाइड्रोजेल नेटवर्क (1.6 मिमी जे) के गठन की ओर जाता है (8.3% w / v). पहले और मिश्रण के बाद शुद्ध और एन सी ब्लॉक का निर्माण (सी) एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण. "एन सी" एक 1.6 मिमी हाइड्रोजेल से लिया गया एक नमूना से मेल खाती है. "*" एक intein सी टर्मिनल दरार सी अर्थडे प्रतिक्रिया उत्पाद. प्रत्येक बैंड की तीव्रता "मात्रा एक" सॉफ्टवेयर में 'ट्रेस मॉड्यूल का उपयोग मात्रा था. बैंड तीव्रता दाढ़ बराबर. ट्रांस splicing दक्षता (~ 80%) एक ही लेन में उत्पाद जम्मू और unreacted एन / सी की मात्रा से गणना की गई प्राप्त करने के लिए प्रोटीन आणविक वजन से विभाजित किया गया था. अमेरिकन केमिकल सोसायटी के जर्नल से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित. (DOI: 10.1021/ja401075s) बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. प्रोटीन निर्माणों के प्लाज्मिड नक्शे. (ए) CutA-NpuN, (बी) NpuC-S-CutA और (सी) SH3-GFP (<मजबूत> 1 टेबल) T7 प्रमोटर के नियंत्रण में pET26b वेक्टर में क्लोन किया गया. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. 22 डिग्री सेल्सियस पर एक 1.6 मिमी हाइड्रोजेल की DPBS में intein की मध्यस्थता प्रोटीन हाइड्रोजेल की स्थिरता. (ए) कटाव प्रोफाइल बिंदीदार रेखा cleaved inteins की सैद्धांतिक जन प्रतिनिधित्व करता है. इनलेट कमरे के तापमान पर 3 महीने के बाद DPBS में एक undisturbed हाइड्रोजेल से पता चलता है. हाइड्रोजेल के आसपास बफर (बी) एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण. हाइड्रोजेल (ए) में डूब गया था जिसमें बफर के सभी नमूने (कुल 7.5 मिलीलीटर) जमा और एक 10 केडी के माध्यम से ultrafiltration के माध्यम से 75 गुना केंद्रित कर रहे थेपूर्व जेल लोड करने के लिए एक झिल्ली जम्मू:. intein पार spliced ​​उत्पाद N:.. unreacted CutA-NpuN NpuN: एन intein टुकड़ा बाहर spliced. Unreacted सी और NpuC बाहर spliced ​​क्रमशः, की वजह से छोटी मात्रा में और छोटे आकार (4 केडीए) के लिए जेल में दिखाई नहीं देते हैं. तारांकन अज्ञात बैंड अर्थ. अलग तापमान पर incubated हाइड्रोजेल (सी) कटाव प्रोफाइल. दो अलग PHS पर incubated हाइड्रोजेल (डी) कटाव प्रोफाइल. अमेरिकन केमिकल सोसायटी के जर्नल से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित. (DOI: 10.1021/ja401075s) बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. Intein-मध्यस्थता हाइड्रोजेल कार्यात्मक गोलाकार प्रोटीन का स्थिरीकरण का समर्थन करता है. एक मॉडल गोलाकार प्रोटीन के रूप में GFP का उपयोग प्रोटीन स्थिरीकरण के (ए) योजनाबद्ध. डीएसपी युक्त हाइड्रोजेल निर्माण खंड प्रथम के निर्माण खंड पर लक्ष्य प्रोटीन लोड करने के लिए डी पी इनकार लक्ष्य प्रोटीन के साथ मिलाया जाता है. टुकड़ा युक्त हाइड्रोजेल निर्माण खंड intein पूरक immobilized GFP के साथ एक हाइड्रोजेल उपज मिश्रण में जोड़ा जाता है. SH3-GFP के 1:1 दाढ़ अनुपात युक्त हाइड्रोजेल का (बी) के कुल प्रोटीन कटाव प्रोफाइल. बिंदीदार रेखा से बाहर spliced ​​inteins की सैद्धांतिक जन प्रतिनिधित्व करता है. त्रुटि सलाखों 2 स्वतंत्र प्रयोगों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. साथ और डीएसपी के बिना हाइड्रोजेल से SH3-GFP (सी) Leaching प्रोफाइल. तुरंत हाइड्रोजेल गठन के बाद और 21 दिनों के बाद यूवी जोखिम के तहत हाइड्रोजेल युक्त GFP (डी) छवियों. अमेरिकन केमिकल सोसायटी के जर्नल से अनुमति (दोई के साथ पुनर्प्रकाशित:. 10.1021/ja401075s) बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5. हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) फँस intein ट्रिगर प्रोटीन हाइड्रोजेल कार्बनिक विलायक एन हेपटैन में एचआरपी उत्प्रेरित प्रतिक्रिया की सुविधा. कार्बनिक विलायकों में एचआरपी द्वारा उत्प्रेरित (ए) मॉडल की प्रतिक्रिया. (बी) के छोटे टुकड़ों में खलल डाल दिया और 10 मिनट और 30 मिनट (बाएं) और DPBS बफर में nonimmobilized एचआरपी का एक ही राशि (दाएं) के साथ नियंत्रण प्रयोग के लिए एक प्रतिक्रिया कॉकटेल में incubated होने के बाद समझाया एचआरपी युक्त हाइड्रोजेल की तस्वीर. (सी) उत्पाद गठन 546 एनएम पर absorbance द्वारा नजर रखी थी. अमेरिकी के जर्नल से अनुमति के साथ अनुकूलितकेमिकल सोसायटी सकते हैं. (DOI: 10.1021/ja401075s) बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

तालिका 1. इस अध्ययन में इस्तेमाल प्रोटीन निर्माणों.

लघु नाम प्रोटीन अनुक्रम मेगावाट (केडीए)
CutA-NpuN (एन) CutA-ईएसी-(GGGGS) 2 के रूप में NpuN-hhhhhh 26.3
NpuC-S-CutA (सी) NpuC-CFNKLYRDPMG-[(एजी) 3 खूंटी] 10 -ARMPYV-C UTA-
Hhhhhh 		26.1
NpuC-S-SH3 lig -
CutA (सी SH3 एलआईजी) 		NpuC-CFNKLYRDPMG-[(एजी) 3 खूंटी] 10 -ARMPYVGS-
PPPALPPKRRR-(GGGGS) 2 के रूप में CutA-hhhhhh 		28.3
SH3-GFP SH3-के.एल. (GGGGS) 2के रूप में GFP-hhhhhh 34.5

(: 10.1021/ja401075s दोई) अमेरिकन केमिकल सोसायटी के जर्नल से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित.

तालिका 2. बफर रचनाओं.

बफर 500 मिमी NaCl, 10 मिमी Tris-एचसीएल, 8.0 पीएच
बफर डीए 500 मिमी NaCl, 8 एम यूरिया, 10 मिमी Tris-एचसीएल, 8.0 पीएच
बफर बी 500 मिमी NaCl, 50 मिमी NaPOi, पीएच 6.0
DPBS है Dulbecco पीबीएस, 137.9 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 1.5 मिमी के.एच. 2 पीओ 4, 8.1 मिमी ना 2 4 HPO, 7.4 पीएच

(: 10.1021/ja401075s दोई) अमेरिकन केमिकल सोसायटी के जर्नल से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित.

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Discussion

इस काम में, हम एक अत्यधिक स्थिर intein की मध्यस्थता प्रोटीन हाइड्रोजेल का संश्लेषण का प्रदर्शन किया. एक विभाजन का उपयोग intein सशर्त दो तरल चरण घटकों के मिश्रण के जवाब में गठन किया जाना हाइड्रोजेल सक्षम बनाता है. विशेष रूप से, विभाजन intein covalently बदले में स्वयं एक हाइड्रोजेल में assembles कि इकाइयों crosslinking से घिरे एक पॉलीपेप्टाइड इकाई उपज, एक पार splicing प्रतिक्रिया के माध्यम से दो तरल चरण इमारत ब्लॉकों लिंक. हाइड्रोजेल का मिश्रण प्रेरित गठन chromatographic शुद्धि स्तंभों की जेल की मध्यस्थता clogging हो सकता है जहां एकल घटक प्रोटीन hydrogels के संश्लेषण में तकनीकी कठिनाइयों नजरअंदाज. इसके अलावा, किसी भी बाहरी रासायनिक inducers और / या शारीरिक ट्रिगर्स के लिए आवश्यकता के बिना शारीरिक शर्तों के तहत हाइड्रोजेल रूपों.

intein की मध्यस्थता हाइड्रोजेल उच्च अम्लीय और बुनियादी दोनों बफ़र्स में स्थिरता, और शारीरिक तापमान पर बरकरार रखती है. Hydrogels वाई फार्म कर सकते हैंबेहतर यांत्रिक स्थिरता के साथ वें के रूप में प्रत्येक व्यक्ति के निर्माण खंड के 0.8 मिमी (नहीं दिखाया डेटा) के रूप में छोटा है, लेकिन उच्च प्रोटीन सांद्रता (~ 1.6 मिमी) उपज हाइड्रोजेल. हाइड्रोजेल के उच्च स्थिरता एक crosslinker 1 के रूप में उपयोग) एक बहुत ही स्थिर Trimeric प्रोटीन, CutA को जिम्मेदार ठहराया है, और 2) intein covalently अलग crosslinkers शामिल होने के लिए. एसडीएस पृष्ठ जैल की densitometric विश्लेषण इनपुट प्रोटीन का 80% सफलतापूर्वक विभाजन intein उत्प्रेरित पार splicing प्रतिक्रिया कराना पड़ा ~ दिखाया.

हाइड्रोजेल गठन के लिए, व्यक्तिगत इमारत ब्लॉकों पहले ~ 100 मिलीग्राम / मिलीलीटर केंद्रित कर रहे हैं. ऐसे डीटीटी के रूप में एक एजेंट को कम करने, intermolecular डाइसल्फ़ाइड बांड के गठन को रोकने के लिए प्रोटीन एकाग्रता चरण के दौरान उपस्थित रहने की जरूरत है. एजेंट को कम करने के अभाव में केंद्रित व्यक्ति हाइड्रोजेल निर्माण खंड कभी कभी हाइड्रोजेल सामग्री की तरह बना सकते हैं. एक बफर में और / या उपस्थिति में डूबे हालांकि, जब इस जेल की तरह सामग्री तेजी से घुलके एजेंट को कम.

अधिकतम स्थिरता के साथ एक हाइड्रोजेल प्राप्त करने के लिए, यह दो हाइड्रोजेल इमारत ब्लॉकों की दाढ़ अनुपात 1:1 है कि यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है. कोई अतिरिक्त निर्माण खंड Crosslinked नहीं होगा और हाइड्रोजेल के यांत्रिक गुणों को प्रभावित कर सकते हैं. केंद्रित प्रोटीन aliquoted और दोहराया फ्रीज पिघलना चक्र को कम करने के लिए व्यक्तिगत रूप से संग्रहीत किया जाना चाहिए.

हम भी एक कार्बनिक विलायक संगत biocatalyst रूप intein की मध्यस्थता प्रोटीन हाइड्रोजेल के उपयोग का प्रदर्शन किया. विशेष रूप से, एचआरपी उत्पाद के लिए सब्सट्रेट सब्सट्रेट और सफल रूपांतरण युक्त एन हेपटैन में डूब गया एंजाइम को शामिल हाइड्रोजेल मनाया गया. प्रोटीन हाइड्रोजेल कारण हाइड्रोजेल का अत्यधिक हाइड्रेटेड वातावरण द्वारा की पेशकश कार्बनिक विलायक मध्यस्थता विकृतीकरण से संरक्षण की संभावना कार्बनिक विलायक में Biocatalysis के लिए एक प्रभावी पाड़ के रूप में कार्य करता है.

वीं की सीमाओं में से एकएंजाइम स्थिरीकरण प्रौद्योगिकी एक डॉकिंग पेप्टाइड (डीपी) के साथ लक्ष्य प्रोटीन फ्यूज करने की आवश्यकता है. इस संशोधन के कुछ लक्ष्य प्रोटीन की गतिविधि और घुलनशीलता प्रभावित करते हैं और इस प्रकार डीपी टैग प्रोटीन निर्माणों के मामले दर मामले के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है. इसके अलावा, टैग प्रोटीन की एक छोटी राशि डॉकिंग स्टेशन पेप्टाइड (डीएसपी) युक्त 1 सप्ताह के बाद हाइड्रोजेल से बाहर leached. immobilized प्रोटीन की स्थिरता डीएसपी / डी पी जोड़ी की आत्मीयता से प्रभावित है. बेहतर स्थिरीकरण दक्षता प्राप्त करने के लिए, एक उच्च संबंध डीएसपी / डी पी जोड़ी की जरूरत होगी. अंत में, कम पठार भंडारण मापांक (100-200 किलो पास्कल) की वजह से इस हाइड्रोजेल प्रदर्शन अपेक्षाकृत कमजोर यांत्रिक संपत्ति 9. पठार भंडारण मापांक crosslinker और midblock 19 दोनों के ढांचे से प्रभावित है. वर्तमान hydrogel में, एक trimer प्रोटीन crosslinker के रूप में इस्तेमाल किया गया था. एक उच्च multimeric राज्य के साथ crosslinker प्रोटीन का उपयोग संभावित हाइड्रोजेल पठार सेंट बढ़ा सकते हैंorage मापांक और अपने यांत्रिक संपत्ति.

संक्षेप में, हम सशर्त दो तरल चरण प्रोटीन इमारत ब्लॉकों, intein एक विभाजन में से एक आधा युक्त प्रत्येक के मिश्रण पर कि रूपों एक नए प्रोटीन हाइड्रोजेल का संश्लेषण और लक्षण वर्णन की रिपोर्ट. Intein की मध्यस्थता प्रोटीन हाइड्रोजेल सिंथेटिक एंजाइमी प्रतिक्रियाओं, कार्बनिक संश्लेषण, इंजेक्शन दवा वितरण, और ऊतक इंजीनियरिंग में संभावित अनुप्रयोगों के साथ एक आशाजनक नई सामग्री का प्रतिनिधित्व करते हैं.

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Disclosures

कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों मौजूद हैं.

Acknowledgments

लेखकों, प्लाज्मिड KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11 के अपने तरह का उपहार के लिए प्लाज्मिड की अपनी तरह का उपहार pQE9 एसी 10 ATRP 12, डा. टॉम मुइर (प्रिंसटन विश्वविद्यालय) के लिए डॉ. डेविड Tirrell (कैलटेक) स्वीकार करना चाहते हैं प्लाज्मिड की अपनी तरह का उपहार pJD757 13 के लिए प्लाज्मिड pET30-CutA-Tip1 10, और डॉ. जे डी Keasling (यूसी बर्कली) के अपने तरह का उपहार के लिए डा. तकेहिसा मत्सुदा (प्रौद्योगिकी, Hakusan, इशिकावा, जापान के कानाज़ावा संस्थान) . यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन कैरियर, अमेरिकी वायु सेना भौंकना और नॉर्मन हैकमैन एडवांस्ड रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Phusion High Fidelity DNA polymerase

 New England BioLabs

M0530S

Competent Escherichia coli BL21 (DE3)

 New England BioLabs

C2527I

Luria Bertani

 VWR

90003-350

Bacto Agar Media

 VWR

Kanamycin sulfate

 VWR

IPTG

 VWR

EM-5820

Imidazole

 VWR

EM-5720

Urea

 VWR

EM-9510

Dithiothreitol (DTT)

 Fisher

BP172-5

Protease Inhibitor cocktail

 Roche Applied Science

11836153001

DPBS

 VWR

82020-066

Brilliant Blue R

 Acros Organics

A0297990

Sodium Azide

 Fisher

AC190380050

Caution, highly toxic

Horseradish peroxidase

 Sigma

P8125-5KU

N,N-dimethyl-p-phenylene diamine

 Fisher

AC408460250

Caution, highly toxic

phenol

 Fisher

AC149340500

Caution, highly toxic

tert-butyl hydroperoxide

 Fisher

AC180340050

Caution, highly toxic

n-heptane

 Acros Organics

120340010

Name Company Catalog Number Comments

Shaker/Incubator

 Fisher Scientific

Max Q 6000

Centrifuge

 Sorvall

RC 6

Sonicator

 QSonica

Misonix 200

Ultrafiltration Tubes

 Amicon Ultra

UFC903024

 Ni Sepharose High Performance HisTrap column

 GE Healthcare Life Sciences

17-5248-01

HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column

 GE Healthcare Life Sciences

17-5156-01

Plate reader

 Molecular Devices

SpectraMax Gemini EM

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References

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एक Intein की मध्यस्थता कृत्रिम प्रोटीन hydrogel के संश्लेषण
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Ramirez, M. A., Chen, Z. Synthesis… More

Ramirez, M. A., Chen, Z. Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel. J. Vis. Exp. (83), e51202, doi:10.3791/51202 (2014).

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