Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Syntese af en Intein-medieret Kunstig Protein Hydrogel

Published: January 27, 2014 doi: 10.3791/51202
Automatic Translation
1, 1,2
1Artie McFerrin Department of Chemical Engineering, Texas A&M University, College Station, 2Department of Microbial and Molecular Pathogenesis, Texas A&M Health Science Center, Texas A&M University, College Station

Summary

Vi præsenterer syntesen af ​​en split-intein-medieret protein hydrogel. Byggeklodser denne hydrogel er to protein copolymerer hver indeholder en underenhed af et trimert protein, der fungerer som en tværbinder og den ene halvdel af en split intein. Blanding af de to protein copolymerer udløser en intein transsplejsning reaktion, hvilket giver et polypeptid enhed, der selv samler ind i en hydrogel. Denne hydrogel er meget pH-og temperatur-stabil, kompatibel med organiske opløsningsmidler, og let inkorporerer funktionelle kugleformede proteiner.

Abstract

Vi præsenterer syntese af et meget stabilt protein hydrogel medieret af en split-intein-katalyserede protein trans-splejsende reaktion. Byggeklodser denne hydrogel er to protein blok-copolymerer, som hver indeholder en underenhed af et trimert protein, der fungerer som en tværbinder og den ene halvdel af en split intein. En meget hydrofilt tilfældig spole er indsat i en af ​​blok-copolymerer til væskeophobning. Blanding af de to protein blokcopolymerer udløser en intein trans-splejsende reaktion, hvilket gav et polypeptid enhed med tværbindere ved hver ende, der hurtigt selv samler i en hydrogel. Denne hydrogel er meget stabilt under både sure og basiske betingelser, ved temperaturer op til 50 ° C og i organiske opløsningsmidler. Den hydrogel hurtigt reformer efter shear-induceret brud. Indarbejdelse af en "docking station peptid" i hydrogel byggesten muliggør praktisk inkorporering af "docking protein"-mærket target-proteiner.Hydrogelen er foreneligt med vækst vævskulturmedier støtter diffusionen af ​​20 kDa-molekyler og muliggør immobilisering af bioaktive kugleformede proteiner. Anvendelsen af ​​intein-medieret protein hydrogel som et organisk opløsningsmiddel-kompatibel biokatalysator blev påvist ved at indkapsle peberrodsperoxidaseenzym og understøttende dets aktivitet.

Introduction

Hydrogeler der udelukkende består af proteiner bære potentiale til markant at rykke så forskellige områder som tissue engineering, drug delivery og biofabrication 1. De tilbyder fordele i forhold til traditionelle syntetiske polymerhydrogeler herunder biokompatibilitet og potentiale til noninvasively støtte indarbejdelsen af ​​bioaktive kugleformede proteiner.

I dette arbejde, beskriver vi udviklingen af et nyt protein hydrogel dannes via en split-intein-medieret protein trans-splejsning reaktion og dens anvendelse som et protein immobilisering stillads (Figur 1). Byggestenene til denne hydrogel er to protein blok-copolymerer, der hver omfatter N-eller C-terminale fragment af en split intein (IN og IC) og en underenhed af et multimert tværbinder protein. Den DnaE intein fra Nostoc punctiforme (NPU) blev anvendt som split intein 2,3 og en lille trimer protein (12 kDa) CutA fra Pyrococcus horikoshii </ Em> blev anvendt som tværbindingsmiddel protein 4,5. Forskellige tværbindingsmidler er forbundet gennem intein katalyserede trans-splejsende reaktion, der fører til dannelse af et tværbundet protein netværk (hydrogel). NPU intein blev valgt på grund af dets hurtige reaktionskinetik (t 1/2 = 63 sek) og høj trans-splejsning udbytte (tæt på 80%) 2,3. Den CutA proteinet blev valgt som tværbinder grund af sin høje stabilitet. CutA trimerer har en denatureringstemperatur af nær 150 ° C og fastholde trimere kvaternære struktur i opløsninger, der indeholder så meget som 5 M guanidinhydrochlorid 4,6. Da subunit udveksling mellem forskellige tværbindere er en stor bidragyder af den fysiske hydrogel overflade erosion 7, skal den meget stærke inter subunit interaktion i CutA afskrække sådanne subunit udvekslinger, hvilket fører til en mere stabil hydrogel. En af disse byggesten indeholder også en meget hydrofilt peptid S-fragment som i midten af ​​blokken for at lette vandtilbageholdelse 8.

Blanding af de to hydrogel byggesten indleder en trans-splejsning reaktion mellem IN og IC intein fragmenter, der genererer en længere polypeptid kæde med crosslinkers på begge terminaler. Tværbindere fra flere sådanne molekylære enheder interagerer med hinanden, danner en tværbundet hydrogel netværket (figur 1A). En særlig "docking station peptid" (DSP) er inkorporeret i en af ​​hydrogel byggesten til at lette stabil immobilisering af en "docking protein" (DP)-mærkede målprotein i hydrogelen. Anvendelsen af ​​en split intein at mediere hydrogel samling ikke blot giver yderligere fleksibilitet for protein hydrogel syntese, men også giver en høj densitet, ensartet belastning af målproteinet hele hydrogel, som målproteinerne lastes før hydrogel formation.

Den intein-medieret protein hydrogel er meget staBle i vandig opløsning med lidt-til-ingen påviselig nedbrydning efter 3 måneder ved stuetemperatur. Stabilitet tilbageholdes i en bred vifte af pH (6-10) og temperaturer (4-50 ° C), og hydrogelen er også kompatibel med organiske opløsningsmidler. Denne hydrogel anvendes til immobilisering af to kugleformede proteiner: det grønne fluorescerende protein (GFP) og peberrodsperoxidase (HRP). Hydrogel indeslutter sidstnævnte protein anvendes til at udføre biokatalyse i et organisk opløsningsmiddel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Plasmid Byggeri

BEMÆRK: Alle gener blev forstærket under standard PCR-reaktioner ved hjælp Phusion High-Fidelity DNA Polymerase pr producentens specifikationer. Primere anvendt til kloning er blevet beskrevet tidligere 9. Alle konstruktioner er anført i tabel 1.

  1. For at generere CutA-NpuN (N, tabel 1):
    1. PCR forstærke CutA og NpuN generne fra plasmider pET30-CutA-Tip1 10 og kanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11 henholdsvis anvendelse af passende primere.
    2. Fordøje disse fragmenter med de passende restriktionsenzymer og sekventielt indsætte disse fragmenter ind i pET26b vektoren mellem T7-promotoren og en C-terminal 6xHistidine tag til at generere N (figur 2A).
  2. For at generere NpuC-S-CutA (C, tabel 1):
    1. PCR Amplify NpuC, CutA og S fragmenteringt [AG 3 (PEG)] 10 fra plasmid kanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, pET30-CutA-Tip1 10 og pQE9 AC 10 Atrp 12 henholdsvis anvendelse af passende primere.
    2. Fordøje disse fragmenter med de passende restriktionsenzymer og sekventielt indsætte disse fragmenter ind i pET26b vektoren mellem T7-promotoren og en C-terminal 6xHistidine at generere C (figur 2B).
  3. For at generere NpuC-S-SH3 Lig-CutA (C-SH3 Lig, tabel 1):
    1. PCR Forstærk CutA anvendelse af primere, der indeholder en SH3 Lig (PPPALPPKRRR) og en fleksibel linker (GGGGS) 2 for at generere fragment SH3 Lig-CutA.
    2. Udskift CutA genet fra C med fragment SH3 Lig-CutA.
  4. For at generere SH3-GFP (tabel 1):
    1. Forstærk SH3-genet fra plasmid pJD757 13 ved hjælp afpassende primere.
    2. Stryg dette fragment til GFP-genet og indsætte det i pET26b vektor mellem T7-promotoren (figur 2C) og en C-terminal 6xHistidine mærke.

2. Proteinekspression

  1. Transform 50 pi kemisk kompetente Escherichia coli BL21 (DE3) med passende ekspressionsplasmid.
  2. Efter transformation, serielt fortynde disse celler, og pladen dem på Luria-Bertani (LB) / agarplader indeholdende 50 ug / ml kanamycin.
  3. Inkuber plader indeholdende transformerede celler ved 37 ° C i ~ 15 timer.
  4. Efter inkubation vælge en plade, der indeholder 50-100 kolonier og resuspender alle kolonier i 5 ml LB bouillon.
  5. Overfør suspensionen til 1 liter LB bouillon indeholdende kanamycin (50 ug / ml) og dyrke cellerne ved 37 ° C med rystning ved 250 rpm. Overvåge absorbansen ved 600 nm (OD 600). Grow kultur indtil OD600 ~ 0,8.
    1. For C-og C-SH3 Lig inducere proteinekspression ved tilsætning af isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) til kulturen (1 mM slutkoncentration) og inkuberes kulturen ved 37 ° C i 4 timer under omrystning ved 250 rpm.
    2. For N og SH3-GFP afkøles kultur til ~ 18 ° C ved at nedsænke dyrkningskolbe i et isvandbad for ~ 5 min. Inducere proteinekspression ved tilsætning af IPTG til kulturen (1 mM slutkoncentration) og inkuberes kulturen ved 18 ° C i 14 til 18 timer under omrystning ved 250 rpm.
  6. Efter proteinekspression centrifugeres kulturen ved 6.000 xg i 20 minutter ved 4 ° C til opsamling af pellet. Store cellepellet ved -80 ° C indtil anvendelse.

3. Proteinoprensning

  1. Oprensning af N (denaturerende betingelser)
    1. Resuspender cellepellets i puffer A (tabel 2) ved 10 ml / g våd pellet.
    2. Immerse pellet suspenderes i et is-vand-bad og forstyrre celler ved sonikering (Amp 10 med 1 sek puls og 6 sek pause i 1 min.)
    3. Centrifuger lysatet ved 16.000 x g i 20 min ved 4 ° C.
    4. Supernatanten. Pellet resuspenderes i puffer DA (indeholdende 8 M urinstof), og centrifugeres suspensionen ved 16.000 xg i 20 minutter ved 4 ° C.
    5. Pass supernatanten gennem en kolonne 5 ml Ni-nitrilotrieddikesyre (NTA), der tidligere var ækvilibreret med buffer DA.
    6. Vask søjlen med 30 ml puffer DA suppleret med 45 mM imidazol. Eluere oprensede protein under anvendelse af 20 ml buffer DA suppleret med 150 mM imidazol.
    7. Reducere koncentrationen urinstof i proteinet prøven til <1 mM ved enten en af ​​følgende metoderne i 3.1.7.1 eller 3.1.7.2:
      1. Dialysér protein i DPBS-buffer (tabel 2) ved 4 ° C natten over under anvendelse af rør med <20 kDa cutoff.
      2. Centrifuge oprenset protein i en 30 & #160; kDa ultra-filtrering spinsøjle ved 2.800 xg, 4 ° C indtil volumen er mindre end 1 ml. Tilføj 14 ml DPBS buffer til søjlen for at fortynde proteinet prøven. Gentag centrifugeringen / fortynding trin tre gange mere.
    8. Efter bufferudskiftning tilsættes dithiothreitol (DTT) til det oprensede protein (endelig 2 mM) og koncentrere protein til ~ 100 mg / ml ved centrifugering gennem en 30 kDa ultrafiltrering spinkolonne ved 2.800 xg, 4 ° C.
    9. Afmål koncentrerede protein og opbevares ved -80 ° C indtil brug.
  2. Oprensning af C og C, SH3 Lig (native tilstand)
    1. Resuspender cellepellets i puffer B (pH 6,0) (tabel 2) suppleret med 1x protease inhibitor cocktail på 10 ml / g våd pellet. Brug sur buffer for at minimere proteolytisk nedbrydning af målproteinet.
    2. Forstyrrer celle suspension ved lydbehandling som beskrevet i 3.1.2. Centrifuger Lysspiste ved 16.000 xg i 20 minutter ved 4 ° C og opbevares supernatanten.
    3. Pass opløselige lysat gennem et 5 ml Ni-NTA-søjle, der tidligere var ækvilibreret med buffer B.
    4. Vask søjlen med Buffer B suppleret med 45 mM imidazol, og der elueres målproteinet i 20 ml puffer B suppleret med 150 mM imidazol.
    5. For C, spring til trin 3.2.6. For C-SH3 Lig, udføre en supplerende ionbytning rensning skridt til at fjerne delvist nedbrudt protein som givet i trin 3.2.5.1 til 3.2.5.3
      1. Reducer NaCl-koncentrationen i C-SH3 Lig til <1 mM følge fremgangsmåden beskrevet i 3.1.7.
      2. Load målproteinet på en 5 ml anionbytter beaded agarosematrix søjle, der tidligere er ækvilibreret med natriumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,0).
      3. Elute målprotein fra søjlen ved at køre en gradient fra en opløsning indeholdende 10 mM Tris-HCI pH 8,0 buffer til en opløsning indeholdende den samme buffer suppleret med 1 M NaCl. Tag prøver under proteineluering og pool prøver med den højeste renhed baseret på natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE).
    6. Pufferudbytning det oprensede protein i DPBS-buffer, som beskrevet i 3.1.7.
    7. Læg DTT til det oprensede protein (slutkoncentration 2 mM) og koncentrere proteinet til ~ 100 mg / ml ved anvendelse af en 30 kDa ultrafiltrering spin-søjle som beskrevet i 3.1.8. Alikvot og opbevares koncentreret protein ved -80 ° C indtil brug.
  3. Oprensning af SH3-GFP
    1. Resuspender cellepellets ved hjælp af puffer A ved 10 ml / g våd pellet.
    2. Forstyrrer pellet suspension ved lydbehandling som beskrevet i 3.1.2.
    3. Centrifuger lysatet ved 16.000 xg i 20 minutter ved 4 ° C og opsamling af supernatanten.
    4. Pass supernatanten (opløselige lysat) gennem en 5 ml Ni-NTA-søjle ækvilibreret medBuffer A.
    5. Vask søjlen med 30 ml puffer A suppleret med 45 mM imidazol. Eluere oprensede protein under anvendelse af 20 ml puffer A suppleret med 150 mM imidazol.
    6. Pufferudbytning det oprensede protein i DPBS-buffer ved hjælp af en fremgangsmåde svarende til den, der er beskrevet i 3.1.7 og koncentrere proteinet til ~ 150 mg / ml ved anvendelse af en 30 kDa ultrafiltrering spin-søjle som beskrevet i 3.1.8.
    7. Alikvot og opbevares oprenset protein ved -80 ° C indtil anvendelse.
  4. SDS-PAGE-analyse af oprensede prøver indeholdende CutA
    1. Fortyndes renset protein i dobbelt-destilleret vand for at mindske koncentrationen af ​​NaCl til ~ 1 mM. På dette NaCl-koncentration, de fleste af CutA trimerer proteiner køre som monomerer på SDS-PAGE-geler.
    2. Bland prøver med 2x SDS-prøvebuffer (0,5 M Tris-HCI, pH 6,8, 20% glycerol, 10% vægt / vol SDS, 0,1% w / v brom-phenol blue, 2% β-mercaptoethanol), inkuberet ved 95 ° C i 5 min.
    3. Indlæse sampler på en 12% SDS-PAGE-gel. Udføre elektroforese ved en konstant spænding på 200 V for ~ 50 min.
    4. Observere protein i geler ved farvning med Coomassie brilliant blue R250 efter standardprotokoller (figur 1C).

4.. Hydrogel Dannelse

BEMÆRK: prøven hydrogeler fremstillet i denne undersøgelse indeholder 1,6 mM af hver hydrogel byggeklods medmindre andet er angivet. Dette protein koncentration giver et blødt og stabilt hydrogel. ADVARSEL: Natriumazid (NaN3) sættes til hydrogelen til en endelig koncentration på 0,5% w / v for at forhindre bakteriel forurening. NaN3 er meget giftigt og skal håndteres med ekstrem omhu som angivet i Material sikkerhedsdatablad.

  1. Beregn volumen for hver af de koncentrerede proteiner nødvendige for at opnå en endelig koncentration på 1,6 mM i et 100 ul prøve hydrogel. For eksempel:
    Koncentration af N:100 mg / ml
    Molekylvægt N: 26,3 kDa (se tabel 1)
    Ønsket Volume: 100 ul Ønsket Koncentration: 1,6 mm
  2. For at gøre en 100 ul hydrogel (1,6 mM), blandes K (x ul, volumen, beregnet i henhold til 4.1) med 5% NaN3 (10 ul), 100 mM DTT (5 ul) og N (y ul, volumen beregnes i henhold til 4.1) i et 2 ml hætteglas.
  3. Tilføj DPBS-buffer ((85 - x - y) ul) til hætteglasset for at opnå et slutvolumen på 100 ul og manuelt blande alle komponenter via en hvirvlende bevægelse ved hjælp af en pipettespids. Bemærk: Løsningen bliver meget tyktflydende ved blanding.
  4. Centrifuger blandingen i 2 minutter ved 8000 xg for at fjerne luftbobler.
  5. Inkuberes blandingen ved stuetemperaturtemperatur natten over for at tillade intein trans-splejsende reaktion at nå færdiggørelse. Bekræft hydrogel-dannelse ved at vende røret på hovedet. Proteinerne ikke vil flyde, hvis en hydrogel er dannet.
  6. Vurdere intein transsplejsning udbytte ved at kontrollere prøver (0,5 pi hver), der er indsamlet før trin 4.2 og efter trin 4.5 på en SDS-PAGE gel, som beskrevet i 3.4 (figur 1C).

5.. Immobilisering af GFP via Docking Protein (DP) og Docking Station Peptid (DSP) Interaktion

  1. For at gøre en 50 ul GFP-funktionaliserede hydrogel (1,2 mM), kombinere c-SH3 Lig (x pi, beregnet i henhold til 4.1) og SH3-GFP (y ul, beregnet i henhold til 4.1) ved molforhold på 1:1 i en 1,7 ml mikrocentrifugerør og inkuber blandingen ved stuetemperatur i 30 minutter.
  2. Tilsæt 5% NaN3 (5 ul), 100 mM DTT (2,5 ul), (42,5 - x - <em> y) ul DPBS til det samme rør. Add N (y ul, beregnet i henhold til 4.1) for at opnå et 1:1-molforhold mellem N og C-SH3 Lig. Prøven blandes ved hjælp af en pipettespids med en hvirvlende bevægelse.
  3. Centrifuger blandingen ved 8000 x g i 2 minutter og inkuberes blandingen natten over ved stuetemperatur i mørke. En hydrogel indkapsling SH3-GFP-former under inkubation.

6.. Anvendelse af 1,6 mM Hydrogel som Immobilisering stillads for enzymatisk reaktion i organisk opløsningsmiddel

  1. Brug HRP som model enzym. Forbered en stamopløsning af HRP (28 mg / ml eller 0,63 mM) i DPBS.
  2. For at gøre en 30 ul hydrogel (1,6 mM) indeslutter HRP, kombinere K (x ul, opgjort i henhold til 4.1) med HRP (2 ul), 5% NaN3 (3 ul) og DTT (1,5 pi 100 mM) i en 1,7 ml centrifugerør.
  3. Add N (y </ Em> ul, beregnet i henhold til 4.1) og DPBS (23,5 - x - y) gl. Bland med en pipettespids med en hvirvlende bevægelse.
  4. Centrifuger blandingen ved 8000 x g i 2 minutter og inkuberes ved stuetemperatur natten over.
    ADVARSEL: de regenter, der anvendes til følgende aktivitet assay er meget giftige. Brug bestemte sikkerhedsanbefalinger med de tilsvarende Materiale sikkerhedsdatablade.
  5. Enzymatisk reaktion nedsænkes hydrogelen i 1 ml reaktion cocktail indeholdende N, N-dimethyl-p-phenylendiamin (5,8 mM), phenol (5,8 mM) og tert-butylhydroperoxid (2,9 mM) i n-heptan 14. Manuelt forstyrre under anvendelse af en pipettespids for at øge kontakten overfladeareal af hydrogelen og opløsningsmidlet.
  6. Detect HRP produkt, en indofenol type farvestof, ved at måle den optiske absorbans af prøver udtaget på forskellige tidspunkter ved 546 nm i et pladelæser (figur 5).
    7. </ Ol>

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En skematisk for intein-medieret protein hydrogel dannelse er vist i figur 1A. Byggeklodser hydrogel er proteinet copolymerer CutA-NpuN (N) og NpuC-S-CutA (C) (figur 1A, tabel 1). NpuN / C er N-/C-fragments af det naturligt delt DnaE intein fra Nostoc punctiforme (NPU). CutA er en stabil trimert protein fra Pyrococcus horikoshii 4,5. Blanding af renset N og C i nærværelse af det reducerende middel DTT inducerer dannelsen af et tredje protein - det ligeret produkt (J: CutA-S-CutA) (figur 1A og 1C). Individuelt hydrogelen byggesten N og C eksistere som tyktflydende væsker (Figur 1B). Blanding af N og C giver en transparent halvfast materiale, der tilbageholdes på bunden af et hætteglas efter invertering, hvilket indikerer dannelsen af en hydrogel 15,16 (fig. 1B) 1.8,19.

Det intein-medieret protein hydrogel (1,6 mM) udviser høj opløsning stabilitet. Der er lidt-til-ingen tab af tværbundet hydrogel stillads efter 21 dage ved 22 ° C i DPBS buffer, som den totale mængde protein frigivet i DPBS buffer kun lidt større end det teoretiske beløb for splejset intein fra hydrogel (under forudsætning af 100 % intein trans-splejsningseffektivitet) (figur 3A). Densitometri viste, at i løbet af hydrogel formation var ~ 80% effektiv (figur 1C)-trans-splejsende reaktioner. SDS-PAGE-gel-analyse viste, at kun spormængder af det trans-splejsede produkt var til stede i hydrogel omkringliggende buffer (figur 3B, band J), bekræfter, at tab af krydsbundet hydrogel stillads til erosion er minimal. Det vigtigste protein til stede i hydrogelen er omgivende puffer er splejset ud intein. Ingen synlige tegn på nedbrydning blev observeret ien uforstyrret hydrogel nedsænket i vandig opløsning ved stuetemperatur i over 3 måneder (figur 3A indgang). Hydrogelen er også meget stabil ved 37 ° C (figur 3C) og i både sure og basiske puffere (figur 3D).

For at lette proteinimmobilisering blev et par af protein og peptid-ligand anvendes til at forankre proteiner af interesse i hydrogelen stilladset. Vi valgte SH3 protein, et Src homologi 3 domæne fra adapteren protein CRK som docking protein (DP) til fusion til et protein af interesse og dens ligand (SH3 Lig) som dockingstation peptid (DSP) til inkorporering i hydrogel stilladset. Denne interaktion pair blev valgt på grund af den relativt lille molekylære størrelse (56 aa for SH3 og 11 aa for SH3 Lig) og høj affinitet (K d = 0,1 uM) 17,18. SH3 Lig blev indsat mellem NpuC og CutA at danne C-SH3 Lig(Tabel 1). SH3 protein blev fusioneret til den N-terminale ende af et model target kugleformet protein, grønt fluorescerende protein (GFP) til dannelse af SH3-GFP. Det er beskrevet i protokol (afsnit 5, figur 4A) processen giver en hydrogel indeholdende 1,2 mM trans-splejset hydrogel backbone byggesten og 1,2 mM GFP. GFP-hydrogel udviste en lignende stabilitet hydrogelen mangler GFP (figur 4B) med ~ 35% total protein tab efter 21 dage i DPBS-buffer. De fleste af de proteiner, der findes i erosion puffer blev de spaltede inteins. Frigivelseshastigheden af SH3-GFP fra en hydrogel, der indeholder SH3 Lig er ~ 30% efter 3 uger, hvilket er betydeligt mindre end den fra en hydrogel mangler SH3 Lig (> 70% protein tab i samme periode, figur 4C). Den immobiliserede SH3-GFP i hydrogelen lyser under UV-lys. Som det ses i figur 4D, hydrogel indeholdende dockingstationen peptide SH3 Lig bevarer det meste af GFP-fluorescens efter 3 uger, mens hydrogelen mangler SH3 Lig bliver det væsentlige ikke-fluorescerende. Det forventes, at anvendelsen af ​​en højere affinitet DP / DSP par yderligere kan reducere frigivelseshastigheden af ​​det immobiliserede protein.

I dette forsøg blev GFP som målproteinet, men kan nogen DP-tagget protein bekvemt immobiliseres i denne hydrogel. Således bør intein-medieret protein hydrogel en generel stillads for protein immobilisering. Tætheden af ​​immobiliseret GFP demonstrere i dette arbejde er ~ 33 mol-% af hydrogelen. En højere immobilisering tæthed kan potentielt opnås, når flere DSP inkorporeres i hydrogelen byggesten.

Dernæst blev HRP-enzym inkorporeret i protein hydrogel at demonstrere sin evne til at understøtte biokatalyse i organiske opløsningsmidler. Enzymaktivitet blev målt ved at overvåge den oxidative kobling af N, N-dimethyl-p-phenylendiamin og phenol med tert-butylhydroperoxid over tid 14. Hypotesen var, at den hydratiserede miljø af hydrogelen vil beskytte vedlagte enzymet fra den denaturerende virkning af det organiske opløsningsmiddel. Hydrogel indeholdende 0,042 mM HRP blev nedsænket i n-heptan indeholdende substraterne. Efter neddykning i et organisk opløsningsmiddel, blev HRP-hydrogel manuelt afbrudt i små klynger for at øge den hydrofile-hydrofobe grænseflade-området (figur 5B). Hydrogel inkorporeret HRP effektivt katalyseret hurtige oxidationsreaktion, hvilket giver anledning til et kolorimetrisk produkt (figur 5C trekanter). Ophobning Produktet følger en lineær hældning, hvilket indikerer ringe-til-intet enzym inaktivering under eksperimentet. Styringen reaktion med HRP opløst direkte i den organiske reaktion cocktail udviste ubetydelig katalytisk aktivitet på grund af enzym-denaturering (data ikke vist). HRP opløst i DPBS først efterfulgt af tilsætning til det organiske opløsningsmiddel var i stand til at katalysere omdannelsen, men på en meget reduceret reaktionshastighed (figur 5C cirkler). Den lav konverteringsfrekvens af enzymer opløst i DPBS skyldes sandsynligvis den lille grænsefladeareal mellem DPBS og det organiske opløsningsmiddel, som begrænser antallet af substrat / produkt diffusion. Inkorporering af stærkt hydrofile S fragment i hydrogel rygrad, som effektivt "låses" vandet i hydrogelen og forhindrer det organiske opløsningsmiddel for at få adgang hydrogelen indre, gør hydrogelen til at modstå denaturering effekten af organisk opløsningsmiddel. Disse resultater indikerer, at intein-medieret protein hydrogel kan være en effektiv stillads for enzymatiske reaktioner i organisk opløsningsmiddel.

_upload/51202/51202fig1.jpg "/>
Figur 1. Intein-medieret protein hydrogel. (A) Skema af intein transsplejsning reaktion, der udløser dannelsen af en udvidet protein kæde (J) med tværbindingsmiddel proteiner både termini. Tværbinderen proteiner fra flere J proteinkæderne kovalent associeret, og efter intein-medieret protein ligatur, inducere dannelsen af en meget tværbundet protein netværk med hydrogel egenskaber. NpuN / C: intein N-/C-fragment. (B) blanding af oprenset N og C (8,3% w / v) fører til dannelsen af en tværbundet hydrogel netværket (1,6 mM J). (C) SDS-PAGE-analyse af oprensede N-og C-byggesten før og efter blanding. "N + C" svarer til en prøve taget direkte fra en 1,6 mM hydrogel. "*" Angiver en intein C-terminal spaltning side reaktionsprodukt. Intensitet af hvert bånd blev kvantificeret ved hjælp af 'spor modul i "Mængde One" software. Båndintensitet blev divideret med protein molekylvægt at opnå molækvivalent. Trans-splejsningseffektivitet (~ 80%) blev beregnet ud fra mængden af produktet J og uomsat N / C på samme bane. Gengivet med tilladelse fra Journal of American Chemical Society. (Doi: 10.1021/ja401075s) Klik her for at se større billede.

Figur 2
Figur 2. Plasmid kort af protein konstruktioner. (A) CutA-NpuN, (B) NpuC-S-CutA og (C) SH3-GFP (<strong> tabel 1) blev klonet ind pET26b vektor under kontrol af T7-promotoren. Klik her for at se større billede.

Figur 3
Figur 3. Stabilitet af intein-formidlede protein hydrogeler i DPBS. (A) Erosion profil af en 1,6 mM hydrogel ved 22 ° C. Stiplede linie repræsenterer den teoretiske masse af de spaltede inteins. Indløbet viser en uforstyrret hydrogel i DPBS efter 3 måneder ved stuetemperatur. (B) SDS-PAGE-analyse af hydrogel er omkring buffer. Alle prøver af pufferen, hvori hydrogelen blev nedsænket i (A) blev samlet (i alt 7,5 ml) og koncentreret 75-fold ved hjælp af ultrafiltrering gennem en 10 kDen membran før gelpåsætning J:. intein trans-splejset produkt N:.. uomsat CutA-NpuN NpuN: splejset ud N-intein fragment. Ureageret C og splejset ud NpuC er ikke synlige i gelen på grund af den lille mængde og lille størrelse (4 kDa), hhv. Stjernen angiver uidentificerede bands. (C) Erosion profil hydrogel inkuberet ved forskellige temperaturer. (D) Erosion profil hydrogeler inkuberet ved to forskellige pH-værdier. Gengivet med tilladelse fra Journal of American Chemical Society. (Doi: 10.1021/ja401075s) Klik her for at se større billede.

Figur 4
Figur 4.. Intein-medieret hydrogel støtter immobilisering af funktionelle kugleformede proteiner. (A) Skematisk af protein immobilisering ved hjælp af GFP som en model kugleformet protein. DSP hydrogel byggesten først blandes med DP-kondenseret målprotein for målprotein indlades byggesten. Den supplerende intein fragment hydrogel byggesten tilsættes til blandingen til opnåelse af en hydrogel med immobiliseret GFP. (B) Total protein erosion profil hydrogel indeholdende molforhold på 1:1 af SH3-GFP. Stiplede linie repræsenterer den teoretiske masse af de splejsede ud inteins. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen af ​​2 uafhængige eksperimenter. (C) Udvaskning profil SH3-GFP fra hydrogel med og uden DSP. (D) Billeder af GFP hydrogeler under UV-eksponering umiddelbart efter hydrogel dannelse og efter 21 dage. Gengivet med tilladelse fra Journal of American Chemical Society (doi:. 10.1021/ja401075s) Klik her for at se større billede.

Figur 5
Figur 5. Peberrodsperoxidase (HRP) indfanget intein-udløst protein hydrogel letter HRP-katalyserede reaktion i et organisk opløsningsmiddel n-heptan. (A) Model reaktion katalyseret af HRP i organiske opløsningsmidler. (B) Fotografi af hydrogeler indeholdende indkapslet HRP efter at være forstyrret i små stykker og inkuberet i en reaktion cocktail i 10 minutter og 30 minutter (til venstre) og kontrol eksperiment med den samme mængde af ikke-immobiliserede HRP i DPBS-buffer (til højre). (C) Produkt-dannelse blev overvåget ved absorbans ved 546 nm. Tilpasset med tilladelse fra Journal of Amerikan Chemical Society. (doi: 10.1021/ja401075s) Klik her for at se større billede.

Tabel 1. Protein-konstruktioner, der anvendes i denne undersøgelse.

Short Name Proteinsekvens MW (kDa)
CutA-NpuN (N) CutA-ØK-(GGGGS) 2-AS-NpuN-hhhhhh 26.3
NpuC-S-CutA (C) NpuC-CFNKLYRDPMG-[(AG) 3 PEG] 10 -ARMPYV-C UTA-
Hhhhhh 		26.1
NpuC-S-SH3 Lig -
CutA (C-SH3 LIG) 		NpuC-CFNKLYRDPMG-[(AG) 3 PEG] 10 -ARMPYVGS-
PPPALPPKRRR-(GGGGS) 2-AS-CutA-hhhhhh 		28.3
SH3-GFP SH3-KL-(GGGGS) 2-AS-GFP-hhhhhh 34.5

Gengivet med tilladelse fra Journal of American Chemical Society (doi: 10.1021/ja401075s).

Tabel 2. Puffersammensætninger.

Buffer A 500 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI, pH 8,0
Buffer DA 500 mM NaCl, 8 M urea, 10 mM Tris-HCI, pH 8,0
Puffer B 500 mM NaCl, 50 mM NaPOi, pH 6,0
DPBS Dulbeccos PBS, 137,9 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 1,5 mM KH 2PO 4, 8,1 mM Na 2 HPO 4, pH 7,4

Gengivet med tilladelse fra Journal of American Chemical Society (doi: 10.1021/ja401075s).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette arbejde har vi demonstreret, syntesen af ​​en meget stabil intein-medieret protein hydrogel. Anvendelsen af ​​en split intein gør hydrogelen en betinget dannet som reaktion på en blanding af to flydende-fase-komponenter. Specifikt split intein covalent forbinder to væskefase-byggesten via et trans-splejsende reaktion, hvilket gav et polypeptid enhed flankeret ved tværbinding enheder, der selv igen samles i en hydrogel. Blandingen-induceret dannelse af hydrogelen omgår tekniske vanskeligheder i syntesen af ​​enkeltkomponent protein hydrogeler hvor gel-medieret tilstopning kromatografiske oprensningssøjlerne kan forekomme. Desuden hydrogel formularer under fysiologiske betingelser uden behov for nogen uvedkommende kemiske inducere og / eller fysiske udløser.

Den intein-medieret hydrogel bevarer høj stabilitet i både sure og basiske puffere og ved fysiologisk temperatur. Hydrogeler kan danne with Så lidt som 0,8 mM af hver enkelt byggeklods (data ikke vist), men højere protein-koncentrationer (~ 1,6 mm) udbytte hydrogeler med bedre mekanisk stabilitet. Hydrogelen høje stabilitet tilskrives anvendelsen af ​​1) en meget stabil trimer protein CutA som et tværbindingsmiddel, og 2) intein covalent sammenkædning af forskellige tværbindere. Densitometrisk analyse af SDS-PAGE-geler viste, at ~ 80% af input-proteiner held undergik split intein-katalyserede trans-splejsende reaktion.

For hydrogel formation, er enkelte byggesten først koncentreret til 100 mg / ml. Et reducerende middel, såsom DTT, skal være til stede under proteinkoncentration skridt til at forhindre dannelsen af ​​intermolekylære disulfidbindinger. I fravær af reduktionsmiddel kan koncentreret individuelle hydrogel byggesten undertiden danne hydrogel-materiale. Men dette gellignende materiale opløses hurtigt ved nedsænkning i en buffer og / eller i nærværreduktionsmiddel.

For at opnå en hydrogel med maksimal stabilitet, er det vigtigt at sikre, at det molære forhold mellem de to hydrogel byggesten er 1:1. Eventuelt overskydende byggesten vil ikke være tværbundet og kan påvirke hydrogel s mekaniske egenskaber. Koncentreret protein skal alikvoteres og opbevares individuelt at minimere gentagne fryse-tø-cykler.

Vi har også vist, at anvendelse af intein-medieret protein hydrogel som et organisk opløsningsmiddel-kompatibel biokatalysator. Specifikt blev hydrogeler inkorporerer enzymet HRP blev nedsænket i n-heptan indeholdende substratet og vellykket omdannelse af substrat til produkt observeret. Proteinet hydrogel fungerer som en effektiv stillads for biokatalyse i organisk opløsningsmiddel, sandsynligvis på grund af beskyttelsen fra organisk-opløsningsmiddel-medieret denaturering tilbydes af stærkt hydreret miljø hydrogelen.

En af de begrænsninger af ther enzymimmobilisering teknologi er behovet for at smelte målprotein med en docking peptid (DP). Denne modifikation kan påvirke aktiviteten og opløselighed af nogle målproteinet og kræver derfor sag til sag optimering af DP-mærkede protein konstruktioner. Hertil kommer en lille mængde af mærkede proteiner udvaskes dockingstationen peptid (DSP) hydrogel efter 1 uge. Stabiliteten af ​​det immobiliserede protein påvirkes af affiniteten af ​​DSP / DP par. For at opnå bedre immobilisering effektivitet, vil en højere affinitet DSP / DP par være nødvendig. Endelig er denne hydrogel udstiller relativt svage mekaniske egenskaber på grund af det lave plateau lagringsmodul (100-200 kPa) 9.. Plateauet lagringsmodul påvirkes af strukturerne af både tværbindingsmiddel og midterblokken 19. I den nuværende hydrogel blev en trimer protein, der anvendes som tværbindingsmiddel. Anvendelsen af ​​tværbinder proteinet med en højere multimere tilstand kan potentielt øge hydrogel plateau storage modulus og dens mekaniske egenskaber.

Sammenfattende rapporterer vi syntese og karakterisering af et nyt protein hydrogel, der konditionelt danner ved blanding af to flydende-fase-protein byggesten, der hver indeholder den ene halvdel af en split intein. Intein-medierede protein hydrogeler repræsenterer en lovende ny materiale med potentielle anvendelser i syntetiske enzymatiske reaktioner, organisk syntese, injicerbar drug delivery og tissue engineering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Der findes ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende Dr. David Tirrell (Caltech) for hans slags gave plasmidet pQE9 AC 10 Atrp 12, Dr. Tom Muir (Princeton University) for hans slags gave plasmidet KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, Dr. Takehisa Matsuda (Kanazawa Institute of Technology, Hakusan, Ishikawa, Japan) for hans slags gave plasmidet pET30-CutA-Tip1 10, og Dr. Jay D. Keasling (UC Berkley) for hans slags gave plasmidet pJD757 13 . Dette arbejde blev støttet delvist af National Science Foundation KARRIERE, US Air force YIP og Norman Hackman Advanced Research Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Phusion High Fidelity DNA polymerase

 New England BioLabs

M0530S

Competent Escherichia coli BL21 (DE3)

 New England BioLabs

C2527I

Luria Bertani

 VWR

90003-350

Bacto Agar Media

 VWR

Kanamycin sulfate

 VWR

IPTG

 VWR

EM-5820

Imidazole

 VWR

EM-5720

Urea

 VWR

EM-9510

Dithiothreitol (DTT)

 Fisher

BP172-5

Protease Inhibitor cocktail

 Roche Applied Science

11836153001

DPBS

 VWR

82020-066

Brilliant Blue R

 Acros Organics

A0297990

Sodium Azide

 Fisher

AC190380050

Caution, highly toxic

Horseradish peroxidase

 Sigma

P8125-5KU

N,N-dimethyl-p-phenylene diamine

 Fisher

AC408460250

Caution, highly toxic

phenol

 Fisher

AC149340500

Caution, highly toxic

tert-butyl hydroperoxide

 Fisher

AC180340050

Caution, highly toxic

n-heptane

 Acros Organics

120340010

Name Company Catalog Number Comments

Shaker/Incubator

 Fisher Scientific

Max Q 6000

Centrifuge

 Sorvall

RC 6

Sonicator

 QSonica

Misonix 200

Ultrafiltration Tubes

 Amicon Ultra

UFC903024

 Ni Sepharose High Performance HisTrap column

 GE Healthcare Life Sciences

17-5248-01

HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column

 GE Healthcare Life Sciences

17-5156-01

Plate reader

 Molecular Devices

SpectraMax Gemini EM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Banta, S., Wheeldon, I. R., Blenner, M. Protein Engineering in the Development of Functional Hydrogels. Ann. Rev. Biomed. Eng. 12, 167-186 (2010).
  2. Iwai, H., Zuger, S., Jin, J., Tam, P. H. Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostoc punctiforme. FEBS Lett. 580, 1853-1858 (2006).
  3. Zettler, J., Schutz, V., Mootz, H. D. The naturally split Npu DnaE intein exhibits an extraordinarily high rate in the protein trans-splicing reaction. FEBS Lett. 583, 909-914 (2009).
  4. Tanaka, Y., et al. Structural implications for heavy metal-induced reversible assembly and aggregation of a protein: the case of Pyrococcus horikoshii CutA. FEBS Lett. 556, 167-174 (2004).
  5. Sawano, M., et al. Thermodynamic basis for the stabilities of three CutA1s from Pyrococcus horikoshii,Thermus thermophilus, and Oryza sativa, with unusually high denaturation temperatures. Biochemistry. 47, 721-730 (2008).
  6. Tanaka, T., et al. Hyper-thermostability of CutA1 protein, with a denaturation temperature of nearly 150 degrees C. FEBS Lett. 580, 4224-4230 (2006).
  7. Shen, W., Zhang, K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Tuning the erosion rate of artificial protein hydrogels through control of network topology. Nat. Mater. 5, 153-158 (2006).
  8. McGrath, K. P., Fournier, M. J., Mason, T. L., Tirrell, D. A. Genetically directed syntheses of new polymeric materials. Expression of artificial genes encoding proteins with repeating -(AlaGly)3ProGluGly- elements. J. Am. Chem. Soc. 114, 727-733 (1992).
  9. Ramirez, M., Guan, D., Ugaz, V., Chen, Z. Intein-triggered artificial protein hydrogels that support the immobilization of bioactive proteins. J. Am. Chem. Soc. 135, 5290-5293 (2013).
  10. Ito, F., et al. Reversible hydrogel formation driven by protein-peptide-specific interaction and chondrocyte entrapment. Biomaterials. 31, 58-66 (2010).
  11. Lockless, S. W., Muir, T. W. Traceless protein splicing utilizing evolved split inteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10999-11004 (2009).
  12. Shen, W., Lammertink, R. G. H., Sakata, J. K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Assembly of an artificial protein hydrogel through leucine zipper aggregation and disulfide bond formation. Macromolecules. 38, 3909-3916 (2005).
  13. Dueber, J. E., et al. Synthetic protein scaffolds provide modular control over metabolic flux. Nat. Biotechnol. 27, (2009).
  14. Bruns, N., Tiller, J. C. Amphiphilic network as nanoreactor for enzymes in organic solvents. Nano Lett. 5, 45-48 (2005).
  15. Das, D., et al. Water gelation of an amino acid-based amphiphile. Chem. Eur. J. 12, 5068-5074 (2006).
  16. Cao, Y., Li, H. Engineering tandem modular protein based reversible hydrogels. Chem. Commun. , 4144-4146 (2008).
  17. Wu, X., et al. Structural basis for the specific interaction of lysine-containing proline-rich peptides with the N-terminal SH3 domain of c-Crk. Structure. 3, 215-226 (1995).
  18. Nguyen, J. T., Turck, C. W., Cohen, F. E., Zuckermann, R. N., Lim, W. A. Exploiting the basis of proline recognition by SH3 and WW domains: Design of n-substituted inhibitors. Science. 282, 2088-2092 (1998).
  19. Olsen, B. D., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Yielding Behavior in Injectable Hydrogels from Telechelic Proteins. Macromolecules. 43, 9094-9099 (2010).

Tags

Bioteknik split-intein selv-samling forskydningsfortyndende enzym immobilisering organisk syntese
Syntese af en Intein-medieret Kunstig Protein Hydrogel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ramirez, M. A., Chen, Z. Synthesis… More

Ramirez, M. A., Chen, Z. Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel. J. Vis. Exp. (83), e51202, doi:10.3791/51202 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter