Summary
Bir bölünmüş intein aracılı protein hidrojel sentezini sunar. Bu hidrojel yapı blokları, her bir bölme intein bir çapraz bağlayıcı ve bir yarısı olarak görev yapan bir trimerik bir protein alt-birimini ihtiva eden iki protein kopolimerleridir. İki protein kopolimerlerinin Karıştırma bir hidrojel halinde kendi kendine birarada monte edilmiş bir polipeptit ünitesi, sonuçta bir intein trans-ekleme reaksiyonunu tetikler. Bu hidrojel yüksek pH ve sıcaklık-stabil, organik solventler ile uyumlu ve kolayca fonksiyonel küresel olan proteinleri içermektedir.
Abstract
Bir bölünmüş intein katalizli protein trans-ekleme reaksiyonu ile aracılık ettiği bir hidrojel oldukça dengeli bir protein sentezini sunar. Bu hidrojel yapı blokları, her bir bölme intein bir çapraz bağlayıcı ve bir yarısı olarak görev yapan bir trimerik bir protein alt-birimini ihtiva eden iki protein blok kopolimerleridir. Bir çok hidrofilik gelişigüzel kıvrımlı bir su tutma için blok-kopolimerlerin birine sokulur. İki protein blok kopolimerlerinin karıştırılması iki ucunda çapraz bağlayıcı ile bir polipeptit ünitesi, sonuçta bir intein trans-birleştirme reaksiyonu tetikleyen bir hidrojel içine hızlı bir şekilde kendi kendini toplanır. Bu hidrojel, 50 ° C 'ye kadar, ve organik çözücüler içinde sıcaklıklarda, hem asidik hem de bazik koşullar altında, çok kararlıdır. Kesme kaynaklı rüptür sonra hidrojel hızla reformlar. Hidrojel yapı bloğunun bir "bağlantı istasyonu peptid" dahil edilmesi "yerleştirme protein"-etiketli hedef proteinlerin uygun bir birleşme sağlar.Hidrojel, bir doku kültürü büyüme ortamı ile uyumlu olan 20 kDa moleküllerin difüzyon destekler ve küresel biyoaktif proteinlerin immobilizasyon sağlar. Organik bir çözücü ile uyumlu katalizör olarak intein aracılı protein hidrojelin uygulama yaban turpu peroksidaz enzimi içine alıcı ve destekleyici aktivitesi ile gösterilmiştir.
Introduction
Proteinlerin tamamen yapılmış Hydrogcls ölçüde doku mühendisliği, ilaç dağıtım ve biofabrication 1 gibi çeşitli alanları ilerlemek için potansiyeli taşımaktadır. Onlar biyouyumluluk ve noninvaziv biyoaktif küresel proteinlerin birleşmesiyle desteklemek için potansiyeli de dahil olmak üzere geleneksel sentetik polimer hidrojeller üzerinde avantajları sunuyoruz.
Bu çalışmada, bir protein immobilizasyon iskelesi olarak bölünmüş bir intein aracılı protein trans-birleştirme reaksiyonu ve uygulama (Şekil 1) ile oluşturulan yeni bir protein hidrojel gelişimini tarif eder. Bu hidrojel için yapı blokları her bir (IN ve IC) intein bir bölünme ve çapraz bağlayıcı bir multimerik proteinin bir alt birimin N-ya da C-terminali fragmanını ihtiva eden iki protein blok kopolimerleridir. Intein Nostoc punctiforme (NPU) gelen DnaE 2,3 intein bölünmüş ve küçük bir trimerik protein Pyrococcus (12 kDa) Cuta horikoshii <olarak kullanılmıştır/ Em> çapraz bağlayıcı protein, 4,5 olarak kullanılmıştır. Farklı çapraz bağlayıcı bir çok çapraz bağlanmış protein ağı (hidrojel) oluşumuna yol açan, intein katalize trans-birleştirme reaksiyonu yoluyla birleştirilmektedir. NPU intein nedeniyle hızlı reaksiyon kinetiği (t 1/2 = 63 sn) ve yüksek trans-yapıştırma verim (yakın% 80) 2,3 seçildi. Cuta protein yüksek stabilite nedeniyle çapraz bağlayıcı olarak seçildi. Cuta trimerleri 150 ° C civarındaki bir sıcaklığa sahip ve denatürasyon kadar 5 M kadar guanidin hidroklorür 4,6 ihtiva eden çözeltiler içinde trimerik kuaterner yapıyı muhafaza eder. Farklı çapraz bağlayıcı arasındaki alt birimi değişimi fiziksel hidrojel yüzey erozyonu 7 önemli bir etken olduğundan, Cuta de çok güçlü arası alt birimi etkileşim daha istikrarlı bir hidrojel lider, bu tür alt birimi alışverişi caydırıcı olmalıdır. Bu yapı taşlarından bir su da kolaylaştırmak üzere, orta blok olarak çok hidrofilik bir peptid S-fragmanını içerirtutma 8.
İki hidrojel yapı taşlarından karıştırılması her iki terminalinde de çapraz bağlayıcı ile daha uzun bir polipeptid zincirini üreten, fragmanları intein IN ve IC arasında bir trans-ekleme reaksiyonunu başlatır. Birden fazla bu tür moleküler birimlerden çapraz bağlayıcılar yüksek çapraz bağlanmış hidrojel ağ (Şekil 1A) oluşturan, birbirleri ile etkileşim. Belirli bir "bağlantı istasyonu peptit" (DSP), bir "bağlantı proteini" (DP) ile etiketlenmiş, hidrojel içine hedef proteini kararlı hareketsiz kılınmasını temin etmek için, hidrojel yapı taşlarından birine dahil edilir. Hidrojel montaj aracılık etmek intein bir bölünme kullanılması hedef proteinler önce hidrojel oluşumuna yüklü olarak, protein sentezi için hidrojel ek bir esneklik sağlar, ancak aynı zamanda tüm hidrojel boyunca hedef proteinin yüksek yoğunluklu, düzgün yüklenmesini sağlar sadece.
Intein aracılığında protein hidrojel oldukça sta olduğuile sulu bir çözelti içinde ble az-oda sıcaklığında 3 ay sonra tespit erozyon. Stabilite pH (6-10) ve sıcaklıklarda (4-50 ° C), geniş bir aralıkta muhafaza ve hidrojel aynı zamanda organik çözücüler ile uyumludur. Yeşil floresan protein (GFP) ve yaban turbu peroksidazı (HRP) Bu hidrojel, iki küresel proteinlerin immobilizasyonu için kullanılır. Ikinci protein tutulmasıyla Hidrojel, bir organik çözücü içinde, Biocatalysis gerçekleştirmek için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Plasmid Yapı
Not: tüm genler, üreticinin talimatına göre Phusion High Fidelity-DNA polimerazı kullanılarak PCR reaksiyonları, standart altında amplifiye edildi. Klonlama için kullanılan primerler, daha önce 9 tarif edilmiştir. Tüm yapılar, Tablo 1 'de listelenmiştir.
- Cuta-NpuN (N, Tablo 1) oluşturmak için:
- PCR, uygun primerler kullanılarak, sırasıyla, plazmidler pET30-Cuta-Tip1 10 ve KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, ikinci Cuta ve NpuN genleri amplifiye.
- Uygun kısıtlama enzimleri ile sindirilmesi, bu parçaları ve ardışık T7 promoteri ve N-(Şekil 2A) oluşturmak için bir C-terminal 6xHistidine etiketi arasındaki pET26b vektörüne bu parçaları yerleştirin.
- NpuC-S-Cuta (C, Tablo 1) oluşturmak için:
- PCR güçlendir NpuC, Cuta ve S parçalanmasınaUygun primerler kullanılarak plazmid KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, pET30-Cuta-Tip1 10 ve 10 pQE9 AC sırasıyla ATRP 12, ikinci t [3 AG (PEG)] 10,.
- Uygun kısıtlama enzimleri ile sindirilmesi, bu parçaları ve sırasıyla T7 promoteri ve C (Şekil 2B) oluşturmak için bir C-terminal 6xHistidine arasındaki pET26b vektörüne bu parçaları yerleştirin.
- : NpuC-S-SH3 lig Cuta-(Cı-SH3 lig, Tablo 1) oluşturmak için
- PCR yükseltin Cuta bir SH3 Lig (PPPALPPKRRR) ve fragman SH3 lig-Cuta oluşturmak için esnek bir bağlayıcı (GGGGS) 2 ihtiva eden primerler kullanılarak.
- Fragmanı SH3 lig-Cuta ile C Cuta geni değiştirin.
- SH3-GFP (Tablo 1) oluşturmak için:
- Kullanılarak plazmid pJD757 13 SH3 geni yükseltinUygun astarlar.
- GFP geni, bu sigorta fragmanı ve T7 promotörü (Şekil 2C) ve bir C-terminal 6xHistidine etiketi arasındaki pET26b vektörü içine yerleştirin.
2. Protein Expression
- Uygun ekspresyon plazmidi ile, kimyasal olarak kompetan Escherichia coli BL21 (DE3) 50 ul dönüşümü.
- Transformasyondan sonra, seri olarak, bu hücreler, seyreltik ve Luria-Bertani (LB) bunları plaka / 50 ug / ml kanamisin içeren agar plakaları.
- ~ 15 saat boyunca 37 ° C 'de, dönüştürülmüş hücreler içeren inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, koloniler 50-100 ihtiva eden bir levha almak ve LB suyu içinde 5 ml tüm koloniler tekrar süspansiyon.
- Aktarım 1 L kanamisin içeren LB suyu (50 ug / ml) süspansiyonu ve 250 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de hücreler büyür. 600 nm (OD 600) de emicilik izleyin. OD 600 ~ 0.8 kadar kültür büyütün.
- C ve C-SH3 lig için, kültür (1 mM nihai konsantrasyon), izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) eklenmesi ile protein sentezlenmesinin uyarılması ve 250 rpm ile çalkalanarak bir 4 saat boyunca 37 ° C 'de kültür inkübe edin.
- N ve SH3-GFP için, kültür soğutmak için ~ 5 dakika boyunca bir buzlu su banyosu içinde kültür şişesi içine daldırarak 18 ° C. Kültürü (1 mM nihai konsantrasyon) için IPTG eklenerek protein ifadesini uyarmak ve 250 rpm ile çalkalanarak bir 14-18 saat boyunca 18 ° C 'de kültür inkübe edin.
- Protein ekspresyonu sonrasında pelet toplamak için 4 ° C'de 20 dakika boyunca 6,000 x g de santrifüj kültür. -80 ° C'de kullanıma kadar saklayın hücre pelet.
3. Protein Saflaştırma
- N saflaştırılması (denatürasyon koşulları)
- Islak topak, 10 ml / g Tampon A (Tablo 2) içerisinde yeniden süspanse hücre topakları.
- ImmersBir buz-su banyosu içerisinde pelet süspansiyon e ve (1 sn darbe ve 1 dakika için 6 saniye ara ile Amp 10) sonikasyon ile hücrelerin bozulması.
- 4 ° C'de 20 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüje lizat
- Süpernatant atın. (8 M üre ihtiva eden) Tampon DA pelet yeniden süspanse edin ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca 16,000 xg'de santrifüj süspansiyon
- Daha önce tampon DA ile dengelenmiş bir 5 ml Ni-nitrilotriasetik asit (NTA) kolonundan süpernatant geçirir.
- 45 mM imidazol ile desteklenmiş Tampon DA 30 ml ile kolondan yıkanır. 150 mM imidazol ile takviye edilmiş tampon DA 20 ml kullanılarak arıtılmış proteininin elüt edilmesi.
- 3.1.7.1 ve 3.1.7.2 'de verilen aşağıdaki yöntemlerden birini biri ile <1 mM protein numunedeki üre konsantrasyonunu azaltmak:
- <20 kDa kesme ile tüpler kullanılarak 4 ° C sıcaklıkta gece boyunca DPBS tamponu (Tablo 2) protein Dialyze.
- Santrifüj, 30 ve # protein saflaştınldı160, 2,800 xg kDa ultra-süzme spin kolon, 4 ° C hacme kadar az 1 ml'dir. Protein numunesinin seyreltilmesi için sütun 14 ml DPBS tamponu ekleyin. Santrifüj / seyreltme üç kez daha tekrarlayın adımları.
- Tampon değişimi sonra, saflaştırılmış protein (final 2 mM) ile ditiotreitol (DTT) ekleyin ve 2,800 x g'de, 30 kDa'lık bir ultra-süzme spin kolon, 4 ° C ile santrifüj ile ~ 100 mg / ml protein konsantre
- Kullanılana kadar -80 ° C'de konsantre edilmiş protein ve mağaza kısım.
- C ve C-SH3 lig saflaştırılması (yerli koşul)
- Tampon B 10 ıslak topağın ml / g 1x proteaz inhibitör kokteyli ile takviye edilmiş (pH 6.0) (Tablo 2) içerisinde yeniden süspanse hücre topakları. Hedef proteinin proteolitik bozulmasını en aza indirmek için asidik tampon kullanarak.
- 3.1.2 de tarif edildiği gibi, sonikasyon ile bir hücre süspansiyonu bozabilir. Lys santrifüj4 ° C'de 20 dakika boyunca 16,000 xg'de yedi ve süpernatant tutun.
- Daha önce tampon B ile dengelenmiş bir 5 ml'lik Ni-NTA sütunu üzerinden Çözünür lizat KATKISI
- Tampon B ile yıkayın kolon 45 mM imidazol ile takviye edilmiş ve 150 mM imidazol ile desteklenmiş Tampon B, 20 ml hedef proteininin elüt edilmesi.
- C, 3.2.6 adıma atlayın. C-SH3 lig için, adımda verildiği gibi kısmen bozulmuş protein çıkarmak için ek bir iyon değişimli arıtma adımı 3.2.5.3 için 3.2.5.1 gerçekleştirmek
- 3.1.7 'de tarif edilen prosedür takip edilerek <1 mM'ye kadar C-SH3 lig NaCl konsantrasyonunu azaltır.
- Daha önce sodyum fosfat tampon maddesi (50 mM, pH 7.0) ile dengelenmiş bir 5 ml anyon değiştirici boncuklu agaroz matrisi sütunu üzerine hedef proteini yerleştirin.
- 10 mM Tris-HCl pH 8.0 Buffe ihtiva eden bir çözeltiden bir gradyan çalıştırarak kolondan Elute hedef protein1 M NaCI ile takviye edilmiş aynı tampon ihtiva eden bir çözeltiye r. Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) göre en yüksek saflıkta protein yıkama ve havuz örnekleri sırasında numune alın.
- 3.1.7 'de tarif edildiği gibi, DPBS tamponu içine, saflaştırılmış proteini Tampon değişimi.
- Saflaştırılmış protein (nihai konsantrasyon 2 mM) ile DTT eklenir ve 3.1.8 tarif edildiği gibi ~ 100 mg / ml, 30 kDa'lık bir ultra-süzme spin kolon kullanarak protein konsantre edilir. Kısım ve mağaza -80 ° C'de kullanıma kadar protein konsantre.
- SH3-GFP saflaştırılması
- Islak topak, 10 ml / g Tampon A kullanılarak yeniden süspanse hücre topakları.
- 3.1.2 de tarif edildiği gibi, sonikasyon ile pelet süspansiyon bozabilir.
- 4 ° C'de 20 dakika boyunca 16,000 x g'de lizat santrifüj ve supernatant toplamak.
- Daha önceden dengelenmiş bir 5 ml'lik bir Ni-NTA sütunu üzerinden süpernatant (Çözünür lizat) geçmekA. Tampon
- Tampon A içinde 30 ml 'si ile yıkayınız sütun 45 mM imidazol ile takviye edilmiştir. Tampon A içinde 20 ml 150 mM imidazol ile desteklenmiş kullanılarak arıtılmış proteininin elüt edilmesi.
- Tampon 3.1.7 'de tarif edilene benzer bir yaklaşım kullanarak DPBS tamponu içine, saflaştırılmış protein değişimi ve protein konsantre ~ 150 mg / 3.1.8 de tarif edildiği gibi, 30 kDa'lık bir ultra-süzme spin kolon kullanılarak ml.
- Kısım ve mağaza -80 ° C'de kullanıma kadar protein saflaştırılmış.
- Cuta içeren saflaştırılmış numunelerin SDS-PAGE analizi
- NaCl ~ 1 mM'ye kadar konsantrasyonunu azaltmak için iki kere distile edilmiş su içinde her bir saflaştırılmış proteini seyreltin. Bu NaCl konsantrasyonda, Cuta trimer proteinlerin çoğu SDS-PAGE jelleri üzerinde monomerler olarak çalışır.
- 2x SDS numune tamponu (0.5 M Tris-HCI, pH 6.8, Gliserol,% 10 ağırlık / hacim SDS,% 0.1 v bromo-fenol kırmızı,% 2 β-merkaptoetanol / ağ% 20), 95 ° C'de inkübe örnekleri ile karıştırın 5 dakika boyunca.
- Sam'e yükleyinples bir% 12 SDS-PAGE jeli üzerine. ~ 50 dakika için 200 V sabit gerilimde elektroforez yapınız.
- Standart protokollere (Şekil 1 C), aşağıdaki Coomassie parlak mavisi R250 ile boyanmıştır jellerde protein dikkate alınmalıdır.
4. Hidrojel Oluşumu
NOT: Aksi belirtilmedikçe, bu çalışmada yapılan örnek hidrojeller her bir hidrojel yapı bloğunun 1.6 mM içerir. Bu protein konsantrasyonu yumuşak ve dengeli bir hidrojel elde edilir. DİKKAT: sodyum azid (NaN3) bakteriyel kontaminasyonu önlemek için ağırlık / hacim olarak% 0.5 'lik bir nihai konsantrasyona kadar hidrojel eklenir. NaN 3 derece zehirli ve Malzeme Güvenlik Bilgi Formunda belirtildiği gibi aşırı bir dikkatle ele alınmalıdır.
- 100 ul numune hidrojel içinde 1.6 mM'lik bir son konsantrasyon elde etmek için gerekli olan konsantre edildi proteinlerin her biri için ses hesaplayın. Örneğin:
N konsantrasyonu:100 mg / ml
N, Molekül ağırlığı: 26.3 kDa (Tablo 1'e bakınız)
İstenen hacmi: 100 ul istenen konsantrasyonu: 1.6 mM
- 100 ul hidrojel (1.6 mM) yapmak için, C mix (x ul hacim 4.1 'e göre hesaplanmıştır),% 5 NaN3 (10 ul) ile, 100 mM DTT (5 ul) ve N-(y ul hacim göre hesaplanır 4.1), 2 ml bir cam şişe içinde.
- 100 ul'lik bir son hacim elde etmek için şişeye (y) ul - - x (85), ve manüel bir pipet kullanarak bir girdap hareketi ile tüm bileşenleri karıştırmak DPBS tamponu ekleyin. Not: Solüsyon karıştırma üzerine çok viskoz hale gelir.
- Hava kabarcıklarını çıkarmak için 8000 x g'de 2 dakika boyunca karışımın santrifüjleyin.
- Karışımı oda inkübeintein trans-yapıştırma reaksiyonun tamamlanması için bir gece sıcaklığı. Ters tüp çevirerek hidrojel oluşumunu onaylayın. Bir hidrojel oluşturulur ise, proteinler, akmayacaktır.
- 3.4 (Şekil 1C) de tarif edildiği gibi, daha önce adım 4.2 ve bir SDS-PAGE jeli üzerinde adım 4.5 sonra toplanan numuneleri (her biri 0.5 ul) kontrol ederek intein trans-birleştirme verimi tahmin.
5. Yerleştirme Protein (DP) ve Docking Station aracılığıyla GFP İmmobilizasyonu Peptit (DSP) Etkileşim
- 50 ul GFP-işlevselleştirilmiş hidrojel (1.2 mM) yapmak için bir 1.7 in 1:1 molar oranında (4.1 göre hesaplanan, x ul) C-SH3 LIG birleştirmek ve SH3-GFP (y ul, 4.1 'e göre hesaplanan) ml mikrosantrifüj tüpü ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışımı.
- X - - <5% 3, NaN (5 ul), 100 mM DTT (2.5 ul), (42.5 eklemeaynı tüp em> y) ul DPBS. N ve C-SH3 lig 1:1 'lik bir mol oranının elde edilmesi için N-(y ul, 4.1' e göre hesaplanan) eklenir. Bir girdap hareketi tarafından bir pipet kullanarak örnek karıştırın.
- 2 dakika boyunca 8000 x g'de santrifüj ve karışım karanlıkta oda sıcaklığında gece boyunca karışım inkübe edin. İnkübasyon sırasında SH3-GFP formları kapsül bir hidrojel.
6. Organik çözücü içinde, enzimatik bir reaksiyon için bir immobilizasyon iskelesi olarak 1.6 mM hidrojelin kullanımı
- Bir model enzim olarak HRP kullanın. DPBS HRP (28 mg / ml ya da 0.63 mM) bir stok çözelti hazırlayın.
- HRP tutulmasıyla, 30 ul hidrojel (1.6 mM) yapmak için, bir iç C HRP (2 ul),% 5 NaN3 (3 ul) ve DTT (100 mM, 1.5 ul) ile (x ul, 4.1 'e göre hesaplanan) kombine 1.7 ml santrifüj tüpü.
- N (y Ekle </ Em> 4.1 göre hesaplanan ul) ve DPBS (23.5 - x - y) ul. Bir girdap hareketi ile bir pipet ucu ile karıştırın.
- 2 dakika boyunca 8000 x g'de santrifüj ve karışım gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
DİKKAT: Aşağıdaki aktivite deneyi için kullanılan reajanlar oldukça zehirlidir. Ilgili Malzeme Güvenlik Bilgi Formları ile özel güvenlik tavsiyelerini kullanın. - Enzimatik reaksiyon için,, n-heptan 14 N, N-dimetil-p-fenilen diamin (5.8 mM), fenol (5.8 mM) ve tert-butil hidroperoksit (2.9 mM) içeren reaksiyon kokteyli 1 ml hidrojel daldırın. El ile hidrojel ve çözücünün temas yüzey alanını artırmak için bir pipet kullanarak jel bozabilir.
- Bir plaka okuyucusu (Şekil 5) 546 nm 'de farklı zamanlarda alınan örneklerin optik absorbans ölçülerek, HRP ürün, bir indofenol tipi boya algılar. </ Ol>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intein aracılığında protein hidrojel oluşturulması için bir şematik Şekil 1A 'de sunulmaktadır. Hidrojelin yapı blokları protein Cuta-NpuN (N) ve NpuC-S-Cuta (C) (Şekil 1A, Tablo 1) kopolimerleridir. NpuN / C Nostoc punctiforme (NPU) için intein doğal olarak bölünmüş DnaE en N-/C-fragments bulunmaktadır. Cuta Pyrococcus horikoshii 4,5 Bir kararlı trimerik proteindir. (Şekil 1 A ve 1 C) lige ürünü (Cuta-S-Cuta J) - indirgeyici madde DTT mevcudiyetinde saflaştırılmış N ve C karıştırılması, üçüncü bir protein oluşumunu uyarmaktadır. Bireysel olarak, hidrojel yapı blokları, N ve C gibi zor akışlı akışkanların (Şekil 1 B) mevcuttur. N ve C Karıştırma bir hidrojel 15,16 (Şekil 1B) oluşumunun göstergesidir ters sonra cam bir şişe dibinde üzerinde tutulan bir saydam, yarı katı madde, elde edilir 18,19.
Bu intein aracılı protein hidrojel (1.6 mM), yüksek çözelti stabilite sergiler. Az-to-no DPBS tamponu içinde 22 ° C'de 21 gün sonra, çapraz bağlanmış hidrojel iskele kaybı yoktur, DPBS tamponu salınan proteinin toplam miktarının sadece biraz 100 kabul edilerek eklenmiş intein hidrojelden teorik miktarının (aşarsa % intein trans-birleştirme verim) (Şekil 3A). Dansitometrisi hidrojel oluşumu sırasında, trans-birleştirme reaksiyonları (Şekil 1C) ~% 80 verimli, ortaya koymuştur. SDS-PAGE jel analizi, sadece az erozyona çapraz bağlanmış hidrojel skafoldun kaybının teyit trans-eklenmiş ürünün miktarda hidrojelin çevreleyen tampon maddesi ile (Şekil 3B, şerit J) mevcuttu iz olduğunu göstermiştir. Hidrojelin çevreleyen tampon maddesi içinde ana protein Mevcut intein üzerinden birleştirilir. Erozyonun görünür belirtileri gözlendi3 aydan fazla bir süre (Şekil 3A giriş) için, oda sıcaklığında, sulu çözelti içine batırılmış bir rahatsız bir hidrojel. Hidrojel 37 ° C'de (Şekil 3C) ve her iki asidik ve bazik tamponlar (Şekil 3D) 'de son derece stabildir.
Protein hareketsiz kılınmasını temin etmek için, protein ve peptid çift ligand hidrojel iskele içine ilgi proteinleri sabitlemek için kullanılmıştır. Biz, SH3 protein, bir adaptör protein CRK Bir Src homoloji 3 alanı, dahil edilmek için kenetlenme istasyonu peptid (DSP) gibi bir ilgi duyulan proteini ve onun ligand (SH3 lig) füzyon için yerleştirme protein (DP) halinde içine seçtik Hidrojel iskele. Bu etkileşim, bir çift nedeniyle nispeten küçük molekül boyutu (SH3 boyunca 56 aa ve SH3 lig boyunca 11 aa) ve yüksek afinite (Kd = 0.1 uM) 17,18 seçildi. SH3 lig C-SH3 LIG oluşturulması için NpuC ve Cuta arasına sokulmuştur(Tablo 1). SH3 protein SH3-GFP oluşturulması için bir model hedef proteinin küresel, yeşil floresan proteini (GFP) ve N-terminine kaynaştırılmıştır. Protokolü (Bölüm 5, Şekil 4A) 'de tanımlanan işlem 1.2 mM trans-eklenmiş hidrojel omurga yapı blokları ve 1.2 mM GFP içeren bir hidrojel elde edilir. GFP-ihtiva eden hidrojel DPBS tamponu içinde 21 gün sonra% 35 toplam protein kaybı ~ GFP ile (Şekil 4B) yoksun olan hidrojel benzer bir stabilite sergilemiştir. Erozyon tampon içinde mevcut olan proteinlerin çoğu yarılmış İnteinler edildi. SH3 LIG ihtiva eden bir hidrojelden SH3-GFP süzülme oranı,% 30 ~ 3 hafta sonra (zaman, Şekil 4C, aynı süre içinde>% 70 protein kaybı) SH3 LIG yoksun bir hidrojelden önemli ölçüde daha küçüktür. Hidrojel hareketsiz SH3-GFP UV ışığı altında yanar. Şekil 4D, yerleştirme istasyonu peptidleri içeren hidrojel görüldüğü gibiSH3 LIG eksik hidrojel esas nonfluorescent olurken de SH3 lig 3 hafta sonra GFP floresan çoğu korur. Bu, daha yüksek bir afinite DP / DSP çiftinin kullanımı, bundan başka, hareketsizleştirilmiş proteinin süzme oranını azaltabilir beklenmektedir.
Bu deneyde, GFP hedef protein olarak kullanılmıştır, ancak, herhangi bir DP-etiketli protein, uygun bir şekilde, hidrojel içine hareketsizleştirilebilir. Bu nedenle, intein aracılı protein hidrojel protein immobilizasyonu için genel bir iskele sağlamalıdır. Hareketsiz GFP yoğunluğu bu çalışmada ortaya ~ hidrojelin 33 mol% 'dir. Birden çok DSP hidrojel yapı bloğunun dahil olduğunda daha yüksek bir yoğunlukta hareketsiz kılma potansiyel olarak elde edilebilir.
Daha sonra, HRP enzimi organik çözücüler içinde Biocatalysis destekleme yeteneğini göstermek için, protein hidrojel içine dahil edilmiştir. Enzim etkinliği oksidatif bağlanmasını izlenmesi ile ölçülmüştür
_upload/51202/51202fig1.jpg "/>
Şekil 1. Intein aracılı protein bir hidrojel. Termini hem de çapraz bağlayıcı protein ile uzun bir protein zinciri (J) oluşumunu tetikleyen trans-birleştirme reaksiyonu intein (A) Şemalar. Intein aracılığında protein bağlanması üzerine kovalent olmayan bir şekilde protein birden J zincirleri ortak ve ikinci çapraz bağlayıcı proteinler, hidrojel özelliklere sahip, yüksek derecede çapraz bağlanmış protein ağının oluşumunu teşvik eder. NpuN / C: N-/C-fragment intein. (B) saf, N ve C karıştırılması, yüksek düzeyde çapraz bağlanmış hidrojel ağ (1.6 mM J) oluşumuna yol açar (% 8.3 w / v). Önce ve karıştırıldıktan sonra saflaştırılmış N ve C yapı bloklarının (C) SDS-PAGE analizi. "N + C", 1.6 mM hidrojel şirketinden alınan bir numuneye karşılık gelir. "*", Bir C-terminal intein bölünme si temsil ederde reaksiyon ürünü. Her bandın yoğunluğu "Miktar One" yazılımı 'iz modülü kullanılarak ölçüldü. Band yoğunluğu molar eşdeğeri. Trans-birleştirme verimi (~% 80), aynı şeritte J ürün ve reaksiyona girmemiş N / C miktarı hesaplandı elde etmek için protein molekül ağırlığı ile bölündü. American Chemical Society Journal izni ile yayımlanmaktadır. (Doi: 10.1021/ja401075s) büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Şekil 2. Protein yapıları plazmid haritalar. (A) Cuta-NpuN, (B) NpuC-S-Cuta ve (C) SH3-GFP (<strong> Tablo 1) T7 promotörünün kontrolü altında pET26b vektörüne klonlanmıştır. büyük resim görüntülemek için.
Şekil 3,. 22 ° C'de, bir 1.6 mM hidrojel DPBS intein aracılı protein hidrojellerin stabilitesi. (A) erozyon profile Noktalı çizgi klivaj İnteinler teorik kütlesi temsil eder. Giriş, oda sıcaklığında 3 ay sonra DPBS içinde kesintisiz bir hidrojel göstermektedir. Hidrojelin çevreleyen tampon maddesi (B) SDS-PAGE analizi. Hidrojel, (A) daldırıldı hangi tamponun tüm örnekler (toplam 7.5 mi) içinde bir araya getirilmiş ve bir 10 kD ile ultra-süzme ile 75-kat konsantre edildi;önce jel yükleme bir membran J:. intein trans-eklenmiş ürün N:.. girmemiş Cuta-NpuN NpuN: N-intein parçasını dışarı kısımlardır. Reaksiyona girmemiş C ve NpuC üzerinden eklenmiş sırasıyla bağlı olarak küçük bir miktar ve küçük boyut (4 kDa) için jel içinde görünmez. Yıldız işareti kimliği bantları gösterir. Farklı sıcaklıklarda kuluçkaya hidrojel bölgesinin (C) erozyon profili. Iki farklı pH'larda inkübe hidrojellerin (D) Erozyon profili. American Chemical Society Journal izni ile yayımlanmaktadır. (Doi: 10.1021/ja401075s) büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Şekil 4. Intein-aracılı hidrojel fonksiyonel küresel proteinlerinin hareketsiz hale destekler. bir model protein olarak küresel GFP kullanılarak protein hareketsizleştirme (A) şematik. DSP içeren hidrojel yapı bloku birinci yapı bloğunun üzerine hedef protein yükleme için DP-kaynaşık hedef protein ile karıştırılır. Fragmanı-ihtiva-eden hidrojel yapı bloğunun intein tamamlayıcı hareketsiz GFP ile bir hidrojel elde karışıma ilave edilir. SH3-GFP 1:1 molar oranını içeren hidrojel (B) Toplam protein erozyon profili. Noktalı çizgi üzerinden eklenmiş İnteinler teorik kütlesini temsil eder. Hata çubukları 2 bağımsız deneyin standart sapmasını temsil eder. Ve DSP olmadan hidrojelden SH3-GFP (C) Liç profili. Hemen hidrojel oluşumundan sonra ve 21 gün sonra UV ışınlarına maruz kalma altında hidrojeller içeren GFP (D) Görüntüler. American Chemical Society Journal izniyle (DOI ile yayımlanmaktadır:. 10.1021/ja401075s) büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Şekil 5,. Yabanturpu peroksidaz (HRP)-sıkışıp kalan intein tetiklenen protein hidrojel bir organik çözücü, n-heptan içinde HRP-katalize reaksiyonu kolaylaştırır. Organik çözücüler içinde HRP ile katalize edilmiş (A) Model reaksiyonu. (B) küçük parçalar halinde kesilmiş ve 10 dakika ve 30 dakika (sol) ve DPBS tamponu içinde sabitlenmemiş HRP aynı miktarda (sağ) kontrol deneyi için bir reaksiyon kokteyl olarak inkübe edildikten sonra kapsül içine HRP içeren hidroj fotoğrafı. (C) Ürün oluşumu, 546 nm'de soğurma ile izlenmiştir. Ameri Journal izniyle uyarlanmıştırKimya Derneği yapabilirsiniz. (doi: 10.1021/ja401075s) büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Tablo 1. Bu çalışmada kullanılan protein yapıları.
| Kısa Adı | Protein Dizi | MW (kDa) |
| Cuta-NpuN (N) | Cuta-EAC-(GGGGS) 2-AS-NpuN-HHHHHH | 26.3 |
| NpuC-S-Cuta (C) | NpuC-CFNKLYRDPMG-[(AG) 3 PEG] 10 -ARMPYV-C Uta- HHHHHH | 26.1 |
| NpuC-S-SH3 lig - Cuta (C-SH3 lig) | NpuC-CFNKLYRDPMG-[(AG) 3 PEG] 10 -ARMPYVGS- PPPALPPKRRR-(GGGGS) 2-AS-Cuta-HHHHHH | 28.3 |
| SH3-GFP | SH3-KL-(GGGGS) 2-AS-GFP-HHHHHH | 34.5 |
(: 10.1021/ja401075s DOI) American Chemical Society Journal izni ile yayımlanmaktadır.
Tablo 2. Tampon bileşimler.
| Tampon A | 500 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, pH 8.0 |
| Tampon DA | 500 mM NaCl, 8 M Üre, 10 mM Tris-HCI, pH 8.0 |
| Tampon B | 500 mM NaCl, 50 mM NaPOi, pH 6.0 |
| DPBS | Dulbecco PBS, 137.9 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 1.5 mM KH 2 PO 4, 8.1 mM Na 2 HPO 4, pH 7.4 |
(: 10.1021/ja401075s DOI) American Chemical Society Journal izni ile yayımlanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, oldukça dengeli bir intein aracılığında protein hidrojel sentezini ortaya koymuştur. Bir bölünme kullanılması intein koşullu iki sıvı faz bileşenlerinin karıştırılması tepki olarak şekillendirilecek olan hidrojel sağlar. Özel olarak, bölünmüş intein kovalent da kendi kendine bir hidrojel halinde birleşmektedir bu birimler çapraz bağlanması ile çevrili bir polipeptit ünitesi hasıl, bir trans-ekleme tepkimesi aracılığı ile, iki sıvı faz yapı taşlarını bağlar. Hidrojel karıştırılması ile indüklenen formasyon kromatografik saflaştırma sütun jel aracılı tıkanma oluşabilir tek bileşenli protein hidrojellerin sentezinde teknik zorluklar atlar. Bundan başka, herhangi bir yabancı kimyasal ön ve / veya fiziksel tetikleyiciler için gerek kalmadan, fizyolojik koşullar altında hidrojel oluşturur.
Intein aracılı hidrojel yüksek hem asidik hem bazik tamponlar içinde stabilite ve fizyolojik sıcaklıkta muhafaza eder. Hidrojeller wi oluşturabilirlerdaha iyi mekanik stabiliteye sahip inci gibi her yapı bloğunun 0.8 mM (veriler gösterilmemiştir) kadar az, ancak daha yüksek protein konsantrasyonunda (~ 1.6 mM) verim hidrojeller. Hidrojel yüksek stabilite, bir çapraz bağlayıcı olarak 1 'in kullanımı) çok stabil trimerik protein, Cuta, atfedilir ve 2) intein kovalent olarak farklı çapraz bağlayıcı maddeler katılmak için. SDS-PAGE jellerinin densitometrik analizi giriş proteinlerin% 80 başarılı bir şekilde bölünmüş intein katalize trans-birleştirme reaksiyonu uygulandı ~ gösterdi.
Hidrojel oluşumu için, ayrı yapı bloklarının birinci ~ 100 mg / ml 'ye konsantre edilmiştir. Örneğin DTT gibi bir indirgeme maddesi, moleküller arası disülfid bağlarının oluşumunu önlemek için protein konsantrasyonu aşaması esnasında mevcut olması gerekmektedir. Indirgeme maddesi yokluğunda, konsantre edilmiş hidrojel tek tek yapı bloku zaman hidrojel gibi malzeme oluşturabilir. , Bir tampon maddesi ve / veya varlığında, batırma Ancak, bu jel-benzeri malzeme hızlı bir şekilde çözünenbir indirgeme maddesi.
Maksimum stabilite ile bir hidrojel elde edilmesi için, bu iki hidrojel yapı taşları olan molar oranı 1:01 olduğundan emin olmak için önemlidir. Fazla herhangi bir yapı bloğu çapraz bağlanmış olmayacak ve hidrojel mekanik özelliklerini etkileyebilir. Konsantre protein, bölünmüştür ve tekrarlanan donma-erime döngülerinden en aza indirmek için tek tek tutulması gerekmektedir.
Ayrıca, organik bir çözücü ile uyumlu katalizör olarak intein aracılı protein hidrojel kullanımını göstermiştir. Özel olarak, HRP alt-tabakanın ürüne en alt tabaka ve başarılı dönüşüm içeren n-heptan içinde daldırılmıştır enzimi içeren hidrojeller gözlenmiştir. Protein hidrojel nedeniyle hidrojelin yüksek nem ortamı tarafından sunulan bir organik çözücü aracılı denatürasyondan korunması muhtemel organik çözücü içinde biyokataliz için etkili bir iskele olarak hizmet vermektedir.
Th sınırlamalar biribir enzim hareketsizleştirme teknolojisi, yerleştirme peptid (DP) ile bir hedef protein füzyon için ihtiyaç olmasıdır. Bu modifikasyon, bir hedef proteinin çözünürlüğünü ve etkinliğini etkileyebilir ve dolayısıyla DP-etiketli protein konstruktlarının durum-durum optimizasyon gerektirebilir. Ek olarak, işaretlenmiş olan proteinlerin küçük bir miktar kenetlenme istasyonu peptid (DSP) ihtiva eden 1 hafta sonra hidrojel sızarlar. Hareketsizleştirilmiş proteinin kararlılığı DSP / DP çiftinin afinite etkilenir. Daha iyi bir hareketsizleştirme verim elde etmek için, daha yüksek bir afinite DSP / DP çift gerekli olacaktır. Son olarak, düşük plato depolama modülü (100-200 kPa) nedeniyle bu hidrojel sergiler nispeten zayıf mekanik özellik 9. Plato depolama modülü çapraz bağlayıcı ve orta blok 19 hem de yapılar tarafından etkilenir. Mevcut hidrojel olarak, trimer protein çapraz bağlayıcı olarak kullanılmıştır. Yüksek Multimerik devlet ile çapraz bağlayıcı protein kullanımı potansiyel hidrojel plato st artırabilirOraj modülü ve mekanik özellik.
Özet olarak, koşullu iki sıvı faz protein yapı taşları, intein bir bölünme yarısını içeren her karıştırılması üzerine oluşturan yeni bir protein hidrojelin sentezi ve karakterizasyonu. Intein aracılığında protein hidrojeller sentetik enzimatik reaksiyonları, organik sentez, enjekte ilaç dağıtım ve doku mühendisliği olası uygulamaları ile umut vadeden yeni bir malzeme temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbir rakip mali çıkarları var.
Acknowledgments
Yazarlar, plazmid KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11 onun tür hediye için plazmid onun tür hediye pQE9 AC 10 ATRP'si 12, Dr Tom Muir (Princeton Üniversitesi), Dr David Tirrell (Caltech) kabul etmek istiyorum plazmid onun tür hediye pJD757 13 için plazmid pET30-Cuta-Tip1 10, ve Dr Jay D. Keasling (UC Berkley) onun tür hediye Dr Takehisa Matsuda (Teknoloji, Hakusan, Ishikawa, Japonya'da Kanazawa Enstitüsü) . Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı KARİYER, ABD Hava kuvvetleri Yip ve Norman Hackman İleri Araştırma Programı tarafından kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase |
New England BioLabs | M0530S |
|
| Competent Escherichia coli BL21 (DE3) |
New England BioLabs | C2527I |
|
| Luria Bertani |
VWR | 90003-350 |
|
| Bacto Agar Media |
VWR | ||
Kanamycin sulfate |
VWR | ||
| IPTG |
VWR | EM-5820 |
|
| Imidazole |
VWR | EM-5720 |
|
| Urea |
VWR | EM-9510 |
|
| Dithiothreitol (DTT) |
Fisher | BP172-5 |
|
| Protease Inhibitor cocktail |
Roche Applied Science | 11836153001 |
|
| DPBS |
VWR | 82020-066 |
|
| Brilliant Blue R |
Acros Organics | A0297990 |
|
| Sodium Azide |
Fisher | AC190380050 |
Caution, highly toxic |
| Horseradish peroxidase |
Sigma | P8125-5KU |
|
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine |
Fisher | AC408460250 |
Caution, highly toxic |
| phenol |
Fisher | AC149340500 |
Caution, highly toxic |
tert-butyl hydroperoxide |
Fisher | AC180340050 |
Caution, highly toxic |
| n-heptane |
Acros Organics | 120340010 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaker/Incubator |
Fisher Scientific | Max Q 6000 |
|
| Centrifuge |
Sorvall | RC 6 |
|
| Sonicator |
QSonica | Misonix 200 |
|
| Ultrafiltration Tubes |
Amicon Ultra | UFC903024 |
|
| Ni Sepharose High Performance HisTrap column |
GE Healthcare Life Sciences | 17-5248-01 |
|
| HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column |
GE Healthcare Life Sciences | 17-5156-01 |
|
| Plate reader |
Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM |
References
- Banta, S., Wheeldon, I. R., Blenner, M. Protein Engineering in the Development of Functional Hydrogels. Ann. Rev. Biomed. Eng. 12, 167-186 (2010).
- Iwai, H., Zuger, S., Jin, J., Tam, P. H. Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostoc punctiforme. FEBS Lett. 580, 1853-1858 (2006).
- Zettler, J., Schutz, V., Mootz, H. D. The naturally split Npu DnaE intein exhibits an extraordinarily high rate in the protein trans-splicing reaction. FEBS Lett. 583, 909-914 (2009).
- Tanaka, Y., et al. Structural implications for heavy metal-induced reversible assembly and aggregation of a protein: the case of Pyrococcus horikoshii CutA. FEBS Lett. 556, 167-174 (2004).
- Sawano, M., et al. Thermodynamic basis for the stabilities of three CutA1s from Pyrococcus horikoshii,Thermus thermophilus, and Oryza sativa, with unusually high denaturation temperatures. Biochemistry. 47, 721-730 (2008).
- Tanaka, T., et al. Hyper-thermostability of CutA1 protein, with a denaturation temperature of nearly 150 degrees C. FEBS Lett. 580, 4224-4230 (2006).
- Shen, W., Zhang, K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Tuning the erosion rate of artificial protein hydrogels through control of network topology. Nat. Mater. 5, 153-158 (2006).
- McGrath, K. P., Fournier, M. J., Mason, T. L., Tirrell, D. A. Genetically directed syntheses of new polymeric materials. Expression of artificial genes encoding proteins with repeating -(AlaGly)3ProGluGly- elements. J. Am. Chem. Soc. 114, 727-733 (1992).
- Ramirez, M., Guan, D., Ugaz, V., Chen, Z. Intein-triggered artificial protein hydrogels that support the immobilization of bioactive proteins. J. Am. Chem. Soc. 135, 5290-5293 (2013).
- Ito, F., et al. Reversible hydrogel formation driven by protein-peptide-specific interaction and chondrocyte entrapment. Biomaterials. 31, 58-66 (2010).
- Lockless, S. W., Muir, T. W. Traceless protein splicing utilizing evolved split inteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10999-11004 (2009).
- Shen, W., Lammertink, R. G. H., Sakata, J. K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Assembly of an artificial protein hydrogel through leucine zipper aggregation and disulfide bond formation. Macromolecules. 38, 3909-3916 (2005).
- Dueber, J. E., et al. Synthetic protein scaffolds provide modular control over metabolic flux. Nat. Biotechnol. 27, (2009).
- Bruns, N., Tiller, J. C. Amphiphilic network as nanoreactor for enzymes in organic solvents. Nano Lett. 5, 45-48 (2005).
- Das, D., et al. Water gelation of an amino acid-based amphiphile. Chem. Eur. J. 12, 5068-5074 (2006).
- Cao, Y., Li, H. Engineering tandem modular protein based reversible hydrogels. Chem. Commun. , 4144-4146 (2008).
- Wu, X., et al. Structural basis for the specific interaction of lysine-containing proline-rich peptides with the N-terminal SH3 domain of c-Crk. Structure. 3, 215-226 (1995).
- Nguyen, J. T., Turck, C. W., Cohen, F. E., Zuckermann, R. N., Lim, W. A. Exploiting the basis of proline recognition by SH3 and WW domains: Design of n-substituted inhibitors. Science. 282, 2088-2092 (1998).
- Olsen, B. D., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Yielding Behavior in Injectable Hydrogels from Telechelic Proteins. Macromolecules. 43, 9094-9099 (2010).
