Summary
Die Quellung Reaktion ist der Gold-Standard-Technik für Serotypisierung Streptococcus pneumoniae. Diese Technik nutzt ein Mikroskop und Pneumokokken-spezifische Antiseren und wird häufig in Referenz-und Forschungslaboren weltweit eingesetzt.
Abstract
Es gibt über 90 verschiedene Kapsel Serotypen von Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken). Abgesehen davon, dass ein Werkzeug für das Verständnis Pneumokokken-Epidemiologie, können Kapsel Serotypisierung nützliche Informationen für die Impfstoff-Wirksamkeit und Wirkungsstudien liefern. Die Quellung Reaktion ist der Goldstandard-Methode für Pneumokokken-Kapsel Serotypisierung. Das Verfahren beinhaltet das Testen einer Pneumokokken-Zellsuspension mit gepoolten und spezifische Antiseren gegen die Kapsel-Polysaccharid gerichtet. Die Antigen-Antikörper-Reaktionen werden mikroskopisch beobachtet. Das Protokoll besteht aus drei Schritten: 1) Herstellung einer Bakterienzellsuspension, 2) Mischen der Zellen und Antiseren auf einem Glasträger, und 3) das Lesen der Quellung Reaktion unter Verwendung eines Mikroskops. Die Quellung Reaktion ist relativ einfach durchzuführen und kann angewendet werden, wo ein geeignetes Mikroskop und Antiseren zur Verfügung.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) ist für den Tod von schätzungsweise 800.000 Kinder unter fünf Jahren pro Jahr verantwortlich, wobei die Last der Krankheit vor allem in ressourcenarmen Ländern 1 fällt. Pneumokokken-Erkrankungen reichen im Schweregrad von lokalisierten Infektionen wie akute Mittelohrentzündung zu schweren lebensbedrohlichen Infektionen wie Sepsis, Meningitis und Lungenentzündung 2. Über 90 Serotypen von Pneumokokken-Kapselpolysaccharid beschrieben worden, 3, 4. Strom Pneumokokken-Impfstoffe einen Schutz gegen die Serotypen, die für die Mehrzahl der invasiven Erkrankung 5, 6 verantwortlich sind. Allerdings hat weit verbreiteten Einsatz von Impfstoffen mit dem Ersatz der Serotypen, die im Impfstoff enthaltenen Serotypen von nonvaccine in Verbindung gebracht, sowohl im Nasen-Rachen-Wagen und invasive Erkrankungen 7, 8. Dies unterstreicht die Bedeutung der Serotypisierung für epidemiologischeÜberwachungs-und langfristigen Auswirkungen Impfstoffstudien 9.
Die Goldstandardmethode für die Pneumokokken-Typisierung ist der Kapselreaktionstest, da die Quellung Reaktion bekannt, die zuerst von Neufeld im Jahre 1902 beschrieben (siehe österreichischen 10). Ein hohes Maß an Übereinstimmung zwischen Laboratorien und zwischen der Quellung Reaktion und andere Methoden Serotypisierung 11-13 gefunden. Es gibt mehrere Varianten der Quellung Reaktion 10, 14-16. Das hier beschriebene Verfahren erfordert nicht die Verwendung einer Gegenfärbung oder der Ölimmersionslinse, sondern es wird ein Tropfen vorbereiteten Probe gemischt mit dem Eingabe-Serum untersucht und direkt unter 400-facher Vergrößerung.
Die Quellung Reaktion wird üblicherweise unter Verwendung von handelsüblichen Antisera. Das hier beschriebene Verfahren verwendet weniger Antiseren verglichen mit anderen Methoden, 16, 17, so dass es kostengünstiger. Sobald ein isol.gegessen wird als Pneumokokken identifiziert, wird es nacheinander mit Antiseren Pools getestet, bis eine positive Reaktion beobachtet wird. Jeder Pool Antiserum enthält verschiedene Mischungen von Antiseren gegen 91 Pneumokokken-Serotypen 18 angehoben. Sobald der Pool aufgebaut ist, werden die einzelnen Muster und Gruppen Antiseren, die im reaktiven Pool aufgenommen werden einzeln nacheinander getestet. Typ Antiseren reagieren in der Regel mit einem einzigen Serotyp (zB Typ-1-Antiserum mit Serotyp 1 reagiert), während die Gruppe Antiseren reagieren mit allen Serotypen, die in einer bestimmten Gruppe (zB Gruppe 22 Antiserum reagiert mit Serotypen 22F und 22A). Einige Serotypen innerhalb der Gruppen werden weiter mit Faktor Antiseren (zB Serotyp 22F reagiert mit Faktor 22b, aber nicht 22c) unterschieden. In diesem Fall ist die Prüfung erfolgt mit allen relevanten Faktor Antiseren fortgesetzt, bis Serotyp bestimmt 19, 20. Die Quellung Reaktion ist einfach und schnell 14 und kann in jeder l durchgeführt werdenabor ist, dass mit einer guten Qualität Mikroskop und entsprechenden Satz von Antiseren ausgestattet.
Protocol
1. Herstellung von Zellsuspension Typing
- Mit einer sterilen Einweg-1 ul-Schleife, einen kleinen Schwung der frischen Übernachtreinkultur von Pneumokokken auf festen nichtselektiven Pferdeblut-Agar und impfen 100 ul Heart Infusion (HALLO) Brühe. Die Suspension sollte zu sein scheinen nur sichtbar trüb. Rühren Sie vorsichtig das Rohr zu emulgieren.
Hinweis: Andere Medien, wie Hirn-Herz-Infusionsbrühe kann ebenfalls geeignet sein. Zugabe von Serum (z. B. eine Endkonzentration von 10% (v / v) Pferdeserum) und Inkubation bei 37 ° C für ungefähr 1 Stunde vor der Verwendung verwendet werden, um die Reaktion zu verbessern.
2. Überprüfen Dichte der Zellsuspension
Die Zellsuspension in Schritt 1.1 hergestellten auch als negative Kontrolle verwendet werden, und sollte für die Zelldichte überprüft werden, bevor die Eingabe Seren.
- Mit einem 1 ul Schleife übertragen einen Tropfen des Inokulums in Schritt 1.1 vorbereitet auf ein Glass Objektträger.
- Mit einer Pinzette, legen Sie einen kleinen kreisförmigen Deckglas auf der Suspension.
- Mit Phasenkontrasteinstellung, beobachten die Vorbereitung mikroskopisch unter 400-facher Vergrößerung, um die Dichte der Suspension (Abbildung 1A) zu überprüfen.
- Wenn der Impfstoff ist zu schwer (2A), fügen Sie mehr Brühe zu der Zellsuspension in Schritt 1.1 zu verdünnen gemacht. Vorsichtig wieder mischen.
- Wenn das Inokulum zu gering ist, gibt es beispielsweise bei <50 Zellen sichtbar im mikroskopischen Bereich (2B), fügen mehr Bakterien zur Herstellung der Zellsuspension in Schritt 1.1 hergestellt und vorsichtig mischen.
Hinweis: Mit der Erfahrung kann die Dichte der Zellsuspension durch Schütteln und hält sie gegen das Licht, wo es zu sein scheinen nur sichtbar trübe beurteilt werden.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.3, bis eine geeignete Anzahl von Zellen in der mikroskopischen Feld sichtbar sind.
Hinweis: Glasdias und coverslips präsentieren eine scharfe Gegenstände Gefahr. Nach Gebrauch werden die Objektträger und Deckgläser mit infektiösem Material kontaminiert und muss in ein Biohazard scharfen Container entsorgt werden.
3. Typing
- Übertragen ~ 1 ul der vorbereiteten Inokulums (zB mit einem 1 ul-Schleife) auf die Glasobjektträger. Entsorgen Sie die Schleife in den Biohazard-Behälter für scharfe Gegenstände.
- Gleiches Volumen (1 ul Öse) von Raumtemperatur-Antiserum auf den Objektträger und mischen beide fällt auch mit der Schleife.
- Mit einer Pinzette, legen Sie einen kleinen kreisförmigen Deckglas auf die Suspension, kümmert das Drop nicht zu berühren. Platzieren des Deckglases auf die Suspension unmittelbar nach der Zugabe von Antiseren, um die Flüssigkeit auf der Folie vor dem Austrocknen zu verhindern.
- Unter dem Mikroskop beobachten die Suspension unter Phasenkontrast mit 400-facher Vergrößerung. Eine negative Reaktion Quellung beobachtet wird, wenn wenig oder kein "Schwellung" der Pneumokokken-Zellen bei 40 gesehen werden0X Vergrößerung, ähnlich dem, was in der Pneumokokken-Zellsuspension ohne Antiseren beobachtet hinzugefügt (Negativkontrolle). Eine positive Reaktion Quellung wird beobachtet, wenn die Zellen im Vergleich zu den Zellen in der Negativkontrolle erscheint vergrößert oder "geschwollen" und mehr sichtbar.
Hinweis: Nicht eindeutige Reaktionen sollten durch Untersuchen der Reaktion nach 5-10 min Inkubation bei Raumtemperatur, oder durch Wiederholen der Reaktion mit Antiserum, weiter untersucht werden, zum Beispiel. - Führen Pneumokokken Serotypisierung mit aufeinanderfolgenden Prüfung der einzelnen Antiseren Pools, bis eine positive Reaktion beobachtet. Alternativ können Pools in Abhängigkeit von lokalen Auftreten von Serotypen "Runden" angewendet werden.
Hinweis: Die Prüfung in "Runden" sorgt dafür, dass die Pools mit Antikörpern gegen die häufigsten Serotypen werden zunächst getestet, minimiert Aufwand und Kosten. Gleichzeitige Prüfung von mehreren Pools bietet auch zusätzliche Negativkontrollen, die in interp nützlich sein kann,retation. Wenn alle Pools in einem bestimmten "runde" negativ sind, testen Sie das Isolat mit folgenden Runden der Schwimmbäder. - Testen Sie das Isolat mit der entsprechenden Muster-oder Gruppenantiserum innerhalb des reaktiven Pool enthalten. Verwenden Sie gegebenenfalls Faktor Antiseren gegen den Serotyp weiter zu differenzieren.
Hinweis: Schlüssel zur Pneumokokken-Antiserum vom Hersteller geliefert werden, bei der Auswahl der entsprechenden Pool, Typ, Gruppe oder Faktor Antiseren und Interpretation der Ergebnisse (einschließlich Kreuzreaktionen) eingesetzt. - Wenn negative Ergebnisse werden mit allen Pools erhalten, testen Sie die Isolat mit Omniserum Reagenz (enthält Antikörper gegen 91 Serotypen 21). Wenn eine positive Reaktion Quellung noch nicht beobachtet, wenn die Prüfung ein Pneumokokken-Isolat mit der Omniserum Reagenz kann dies daran liegen, das Isolat exprimieren geringe oder keine Kapsel oder dass Antikörper gegen die Serotypen sind nicht im Omniserum dargestellt. Die letztere Kategorie können neue Serotypen enthalten. </ Ol>
Representative Results
Eine positive Reaktion tritt auf, wenn Quellung typspezifischen Antikörper bindet an die Kapsel der Pneumokokken, die zu einer Änderung seines Brechungsindex 10. Wenn unter einem Mikroskop betrachtet, erscheinen die Bakterien "geschwollen" und mehr sichtbar 14. 1A zeigt Pneumokokken-Zellen in HALLO Brühe. Bei Typ-spezifische Antiserum wird in die Bakteriensuspension hinzugefügt, Pneumokokken erscheinen "geschwollen", refraktive und mehr abgerundet (Abbildung 1B).
Zu viele Bakterienzellen in die Brühe zugegeben wird, kann in Aggregation von Zellen oder einem falsch-negativen Reaktion führen. Abbildung 2 zeigt Inokula der Pneumokokken-Zellen in HALLO Brühe, die "zu schwer" (2A) oder "zu leicht" (2B) sind.
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Fig. 1 ist. Negative und positive Quellung Reaktion. Zubereitungen von der Serotyp 9V Pneumokokken isolieren, ohne Antiserum (1A) und mit der Gruppe 9-Antiserum (1B), wurden unter 400-facher Vergrößerung betrachtet. Letzteres zeigt die "Schwellung" und Runden von Bakterienzellen in der Regel in einem positiven Quellung Reaktion gesehen.
2. Zu schwer und zu leicht Inokula. Zubereitungen von der Pneumokokken-Zellsuspensionen, die zu schwer (2A) oder zu hell (2B) sind, wenn sie unter 400-facher Vergrößerung betrachtet.
Discussion
Ein kritischer Schritt in diesem Verfahren ist eine reine Kultur sicherzustellen, wird die Suspension zusammen mit dem Hinzufügen einer geeigneten Anzahl von Bakterienzellen, in die Brühe herzustellen. Es sei darauf hingewiesen, dass das Wachstum und Koloniemorphologie auf Agarplatten variiert zwischen verschiedenen Pneumokokken-Isolaten werden. Einige produzieren trockene und raue Kolonien, die schwierig sein kann, zu holen mit einer Schleife und nicht gut in der Brühe zu emulgieren. Aus diesem Grund kann eine größere Schleife der Bakterien benötigt werden bei der Herstellung der Zellsuspension. In jedem Fall ist es unerlässlich, dass die einzelnen Zellen und keine Aggregate sind in der Negativkontrolle offensichtlich so ihre relative Größe der Zellen mit Antiseren verglichen werden zugegeben. Zusätzlich können zu viele Bakterienzellen in einem falsch-negativen Reaktion, in dem ein Überschuss von Kapsel-Antigen kann die Quellung Reaktion 10 hemmen führen. Aus diesem Grund ist es wichtig, eine Bakteriensuspension mit geeigneter Zelldichte (Fig. 1) zu schaffen. Die susRente kann für mehrere Monate durch die Zugabe von einigen Tropfen konzentrierter Formalin konserviert werden. Dies ermöglicht eine einfachere Chargenprüfung und sterilisiert die Brühe reduziert das Risiko von Laborinfektionen, obwohl dies muss vor dem Sicherheitsrisiko im Umgang mit Formalin, die giftig, ätzend, krebserzeugend, sensibilisierend und entflammbar ist abgewogen werden. Außerdem haben wir beobachtet, dass einige Isolate zeigen schwächere Reaktionen in Gegenwart von Formalin (Daten nicht gezeigt).
Quellung Reaktionen werden unter Verwendung eines Mikroskops untersucht. Die Verwendung von Phasenkontrast verbessert die Sichtbarkeit der Kapsel. In einigen Labors wird die Reaktion unter Verwendung von Ölimmersions bei 1000-facher Vergrößerung 14, 16 betrachtet. Darüber hinaus sind einige Laboratorien eine Gegenfärbung (Methylenblau), um die Sichtbarkeit einer positiven Reaktion 10, 16, 22 weiter zu verbessern. Die hier vorgestellte Methode wird ohne Öl-i angesehenmmersion und unter 400-facher Vergrößerung 15, 17. Diese Methode ist schnell, einfach und relativ leicht zu lesen 23.
Es ist wichtig, gute interne Qualitätskontrolle zu halten, um sicherzustellen, dass die Antisera und Testverfahren sind in Ordnung. Die Teilnahme an einer externen Qualitätssicherungsprogramm ist oft von Vorteil.
Eine wesentliche Einschränkung der Quellung Reaktion zur Serotypisierung von Pneumokokken sind die hohen Kosten der benötigten Antiseren. Dies wird jedoch in dem obigen Protokoll aufgrund der geringen Menge von Antiserum für jede Reaktion verwendet wird, minimiert. Mehrere andere Verfahren wurden zur Serotypisierung Pneumokokken 23, 24 beschrieben. Allerdings bleibt Quellung der Goldstandard und die Entwicklung von neuen Methoden erfordert Standardisierung gegen die Quellung Reaktion 23. Mit entsprechenden Antiseren kann die Quellung Reaktion auch genutzt werden, um zu identifizieren, und geben Sie anderen Kappen werdenModul 25 produzierenden Bakterien. Die Quellung Reaktion ist maßgeblich an der Charakterisierung der aktuellen und zukünftigen Pneumokokken-Serotypen, sowie Bereitstellung von Informationen über die Wirksamkeit des Impfstoffes und die langfristigen Auswirkungen der Impfung auf Schlitten und Krankheit.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Bill-und-Melinda-Gates-Stiftung (PneuCarriage Projekt, Grant 52099) und operativen Infrastruktur-Support-Programm der Regierung von Victoria unterstützt. Dank Eileen Dunne, Janet Strachan, und Kim Hasen für die kritische Durchsicht des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | http://www.ssi.dk/ssidiagnostica Bring all antisera to room temperature before use |
|
| Pneumococcus (Omni) antiserum | SSI Diagnostica | 2438 | Bring all antisera to room temperature before use |
| Optical Microscope | Leica Microsystems | Leica DML | |
| Calibrated Disposable Inoculating Loops 1 µl | Copan | CD175S01 | |
| Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | http://www.thermofisher.com.au/ Bring to room temperature before use |
| Heart Infusion (HI) broth | Media Preparation Unit (MPU), The University of Melbourne | 40HIN | Bring to room temperature before use |
| Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Lomb Scientific | 7101 | Sharps hazard: Dispose in a biohazard sharps container |
| Circular glass coverslips | NeuVitro | GG-5 | |
| *Excluding the antisera, all other materials can be purchased from alternative suppliers | |||
| *Plates prepared from defibranated sheep blood are suitable but blood plates prepared from citrated blood or human blood are not |
References
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