Summary
La reazione Quellung è la tecnica gold standard per sierotipizzazione Streptococcus pneumoniae. Questa tecnica utilizza un microscopio e specifico antisieri pneumococco ed è comunemente usato in riferimento e laboratori di ricerca in tutto il mondo.
Abstract
Ci sono oltre 90 diversi sierotipi capsulari di Streptococcus pneumoniae (pneumococco). Oltre ad essere uno strumento per comprendere l'epidemiologia pneumococcica, sierotipizzazione capsulare può fornire informazioni utili per studi di efficacia del vaccino e di impatto. La reazione Quellung è il metodo gold standard per lo pneumococco capsulare sierotipizzazione. Il metodo prevede saggiando una sospensione cellulare pneumococcica con antisieri pool e specifico diretto contro il polisaccaride capsulare. Le reazioni antigene-anticorpo sono osservate al microscopio. Il protocollo ha tre fasi: 1) preparazione di una sospensione cellulare batterica, 2) miscelazione delle cellule e antisieri su un vetrino, e 3) la lettura della reazione Quellung utilizzando un microscopio. La reazione Quellung è ragionevolmente semplice da eseguire e può essere applicata ovunque sono disponibili un microscopio adatto e antisieri.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (pneumococco) è responsabile della morte di circa 800.000 bambini sotto i cinque anni ogni anno, con il peso delle malattie che rientrano prevalentemente nei paesi poveri di risorse 1. Malattie da pneumococco variano in gravità da infezioni localizzate quali otite media acuta a gravi infezioni che minacciano la vita come sepsi, meningite e polmonite 2. Oltre 90 sierotipi capsulari di pneumococchi sono stati descritti 3, 4. Pneumococco attuali forniscono protezione contro i sierotipi che sono responsabili della maggior parte delle malattie invasive 5, 6. Tuttavia, l'uso diffuso di vaccini è stata associata con sostituzione di sierotipi inclusi nel vaccino da sierotipi non vaccinali, sia nel trasporto nasofaringeo e malattie invasive 7, 8. Questo evidenzia l'importanza di sierotipizzazione per epidemiologicala sorveglianza e l'impatto del vaccino studi a lungo termine 9.
Il metodo gold standard per la tipizzazione pneumococcica è la prova di reazione capsulare, nota come la reazione Quellung, descritta da Neufeld nel 1902 (vedi austriaco 10). Un alto grado di concordanza trovata tra laboratori, e tra la reazione Quellung e altri metodi sierotipizzazione 11-13. Ci sono diverse varianti della reazione Quellung 10, 14-16. Il metodo qui descritto non richiede l'uso di un colorante contatore o la lente immersione in olio, ma piuttosto una goccia di campione preparato viene miscelato con il siero di battitura e esaminato immediatamente sotto ingrandimento 400X.
La reazione Quellung viene di solito eseguita usando appositi antisieri. Il metodo qui descritto utilizza meno antisieri rispetto ad altri metodi 16, 17, rendendolo più conveniente. Una volta che un isolmangiato è identificato come pneumococco, è sequenzialmente testato con piscine sieri finché si osserva una reazione positiva. Ogni antisiero piscina contiene diverse miscele di sieri sollevate contro 91 sierotipi di pneumococco 18. Una volta che la piscina è stabilito, il tipo individuale e di gruppo antisieri che sono inclusi nel pool reattivi sono testati singolarmente in sequenza. Tipo antisieri generalmente reagiscono con un solo sierotipo (ad esempio di tipo 1 antisiero reagisce con sierotipo 1), mentre antisieri del gruppo reagiscono con tutti i sierotipi in un particolare gruppo (ad esempio Gruppo 22 antisiero reagisce con sierotipi 22F e 22A). Alcuni sierotipi all'interno dei gruppi sono ulteriormente differenziati con fattore di antisieri (ad es sierotipo 22F reagisce con fattore 22b, ma non 22c). In questo caso il test è proseguita con tutti fattore rilevante antisieri fino sierotipo è determinata 19, 20. La reazione Quellung è semplice e veloce 14 e può essere eseguita in qualsiasi laboratory che è dotato di un microscopio buona qualità e appropriato insieme di antisieri.
Protocol
1. Preparazione della sospensione cellulare per la tipizzazione
- Utilizzando un usa e getta loop 1 ml sterile, prendere una piccola distesa di pernottamento pura cultura fresca di pneumococchi cresciuto su un solido agar sangue di cavallo non selettivo e inoculare 100 ml Heart Infusion (HI) brodo. La sospensione dovrebbe apparire solo visibilmente torbido. Agitare delicatamente il tubo per emulsionare.
Nota: Altri media come Brain Heart Infusion brodo possono essere idonei. Aggiunta di siero (ad esempio una concentrazione finale di 10% (v / v) di siero di cavallo) ed incubazione a 37 ° C per circa 1 ora prima dell'uso può essere utilizzato per migliorare la reazione.
2. Controllo Densità di sospensione cellulare
La sospensione cellulare preparato al punto 1.1 sarà anche utilizzato come controllo negativo, e dovrebbe essere controllato per densità delle cellule prima di aggiungere i sieri digitazione.
- Utilizzando un ciclo 1 ml, trasferire una goccia d'inoculo preparato nella fase 1.1 su un bicchieres vetrino da microscopio.
- Usando un paio di pinze, mettere un piccolo vetrino circolare sulla sospensione.
- Utilizzando l'impostazione a contrasto di fase, osservare la preparazione al microscopio sotto 400X ingrandimento, per verificare la densità della sospensione (Figura 1A).
- Se l'inoculo è troppo pesante (Figura 2A), aggiungere altro brodo alla sospensione cellulare fatta allo step 1.1 diluirlo. Mescolare ancora delicatamente.
- Se l'inoculo è troppo leggero, per esempio, ci sono <50 cellule visibile nel campo microscopico (Figura 2B), aggiungere più batteri alla preparazione sospensione cellulare fatta allo step 1.1 e mescolare delicatamente.
Nota: Con l'esperienza, la densità della sospensione cellulare può essere giudicata agitando e sollevando alla luce, dove dovrebbe apparire solo visibilmente torbido.
- Ripetere i passaggi 2,1-2,3 finché un adeguato numero di cellule è visibile nel campo microscopico.
Nota: vetrini e coverslips presentano un rischio taglienti. Dopo l'uso, diapositive e coprioggetto sono contaminati con materiale infetto e devono essere smaltite in un contenitore a rischio biologico taglienti.
3. Dattilografia
- Trasferire ~ 1 ml di inoculo preparato (per esempio utilizzando un ciclo 1 microlitri) sul vetrino per microscopio. Scartare il loop nel contenitore rischio biologico taglienti.
- Aggiungere un volume equivalente (1 ml un'ansata) di antisiero temperatura ambiente sul vetrino e mescolare entrambe gocce bene con il loop.
- Usando un paio di pinze, mettere un piccolo vetrino circolare sulla sospensione, facendo attenzione a non toccare la goccia. Posizionare il coprioggetto sulla sospensione immediatamente dopo l'aggiunta di antisieri per evitare che il liquido sul vetrino si secchi.
- Utilizzando un microscopio, osservare la sospensione sotto a contrasto di fase con ingrandimento 400X. Una reazione negativa Quellung si osserva quando poco o nessun 'gonfiore' delle cellule pneumococco può essere visto a 400X ingrandimento, simile a quello osservato nella sospensione cellulare pneumococcica senza antisieri aggiunto (controllo negativo). Una reazione positiva Quellung si osserva quando le cellule appaiono allargata o 'gonfio' e più visibili rispetto alle celle nel controllo negativo.
Nota: reazioni ambigui devono essere studiati ulteriormente, ad esempio esaminando la reazione dopo 5-10 minuti di incubazione a temperatura ambiente, o ripetendo la reazione con più antisiero. - Condurre sierotipizzazione pneumococcica con successiva prova di ogni pool sieri specifici, fino a quando si osserva una reazione positiva. In alternativa, piscine possono essere applicate in «round» a seconda della incidenza locale dei sierotipi.
Nota: I test a «turni» assicura che le piscine contenenti anticorpi per i sierotipi più comuni sono testati prima, riducendo al minimo lo sforzo e costo. Sperimentazione contemporanea di diverse piscine fornisce inoltre ulteriori controlli negativi, che può essere utile in interpretation. Se tutte le piscine in un particolare 'round' sono negativi, testare l'isolato con le successive serie di piscine. - Testare l'isolato utilizzando il tipo appropriato o gruppo antisiero contenuta all'interno del pool reattiva. Se del caso, utilizzare il fattore antisieri per differenziare ulteriormente il sierotipo.
Nota: Chiavi di sieri pneumococcica forniti dal costruttore sono utilizzati per la selezione del pool appropriato, tipo, di gruppo o fattore di sieri e l'interpretazione dei risultati (comprese le eventuali reazioni incrociate). - Se i risultati negativi si ottengono con tutte le piscine, testare l'isolato con Omniserum reagente (contiene anticorpi contro 91 sierotipi 21). Se una reazione positiva Quellung non viene ancora osservata nel test di un pneumococcica isolare con il reagente Omniserum, puo essere perché l'isolato esprime poca o nessuna capsula, o che gli anticorpi contro il sierotipo non sono rappresentati nella Omniserum. Quest'ultima categoria può includere nuovi sierotipi. </ Ol>
Representative Results
Una reazione positiva Quellung verifica quando anticorpo specifico del tipo lega alla capsula del pneumococco, portando ad una variazione del suo indice di rifrazione 10. Quando hanno visto al microscopio, i batteri appaiono 'gonfio' e più visibile 14. Figura 1A mostra cellule pneumococco in brodo HI. Quando antisiero specifico del tipo viene aggiunto alla sospensione batterica, pneumococchi appaiono 'gonfio', rifrazione e più arrotondato (Figura 1B).
Troppi cellule aggiunte al brodo batteriche possono causare aggregazione di cellule o una reazione falso negativo. Figura 2 mostra inoculi di cellule pneumococco in brodo HI pari 'troppo pesante' (Figura 2A) o 'troppo leggero' (Figura 2B).
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Figura 1. Negativo e positivo reazione Quellung. Preparazioni di sierotipo 9V pneumococcica isolare senza antisiero (1A) e con il gruppo 9 antisiero (1B), sono stati visti sotto 400X. Quest'ultimo mostra il 'gonfiore' e l'arrotondamento delle cellule batteriche tipicamente osservati in una reazione positiva Quellung.
Figura 2. Inoculi troppo pesante e troppo leggero. Preparazioni di sospensioni pneumococco cellulari che sono troppo pesanti (2A) o troppo leggero (2B), se visto sotto 400X.
Discussion
Un punto critico in questa tecnica è garantire una coltura pura viene utilizzato per preparare la sospensione con l'aggiunta di un adeguato numero di cellule batteriche al brodo. Va notato che la crescita delle colonie e morfologia su piastre di agar varia tra diverse pneumococchi isolati. Alcuni producono colonie secche e ruvide, che possono essere difficili da far fuori con un ciclo e non emulsionare bene nel brodo. Per questo motivo, una grande spazzata di batteri può essere necessaria quando si prepara la sospensione cellulare. In ogni caso, è imperativo che le cellule individuali, e non aggregati, sono evidenti nel controllo negativo quindi la loro dimensione relativa può essere paragonato alle cellule con antisieri aggiunte. Inoltre, troppe cellule batteriche possono causare una falsa reazione negativa, dove un eccesso di antigene capsulare può inibire la reazione Quellung 10. Per questo motivo è importante creare una sospensione batterica con una densità cellulare adatto (Figura 1). Il suspensione può essere conservata per diversi mesi con l'aggiunta di qualche goccia di formalina concentrata. In questo modo le prove per lotto più facile e anche sterilizza il brodo di ridurre il rischio di infezioni acquisite in laboratorio, anche se ciò deve essere valutato rispetto al rischio la sicurezza del trattamento con formalina, che è tossico, corrosivo, cancerogeno, sensibilizzanti, e infiammabili. Inoltre, abbiamo osservato che alcuni isolati mostrano reazioni deboli in presenza di formalina (dati non mostrati).
Reazioni Quellung sono esaminati usando un microscopio. L'uso di contrasto di fase aumenta la visibilità della capsula. In alcuni laboratori, la reazione viene visualizzato utilizzando ad immersione in olio a 1000 ingrandimenti X 14, 16. Inoltre, alcuni laboratori hanno una macchia contatore (blu di metilene) per migliorare ulteriormente la visibilità di una reazione positiva 10, 16, 22. Il metodo qui presentato è visto senza olio-immersion e sotto 400X 15, 17. Questo metodo è veloce, semplice e relativamente facile da leggere 23.
E 'importante mantenere buoni procedure di controllo di qualità interno per garantire le procedure di sieri e di prova sono in ordine. La partecipazione a un programma di controllo esterno della qualità è spesso utile.
Una limitazione importante della reazione Quellung sierotipizzazione degli pneumococchi è il costo elevato degli antisieri richiesta. Tuttavia, questo è minimizzato nel protocollo sopra a causa della piccola quantità di antisiero utilizzato per ciascuna reazione. Diversi altri metodi sono stati descritti per la sierotipizzazione pneumococchi 23, 24. Tuttavia, Quellung rimane il gold standard e lo sviluppo di nuovi metodi richiede standardizzazione contro la reazione Quellung 23. Uso appropriato antisieri, la reazione Quellung può anche essere utilizzata per identificare e digitare altri tappiule batteri che producono 25. La reazione Quellung è strumentale nella caratterizzazione dei sierotipi di pneumococco attuali ed emergenti, oltre a fornire informazioni sulla efficacia del vaccino e l'impatto a lungo termine della vaccinazione sul carrello e la malattia.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Bill e Melinda (progetto PneuCarriage, Grant 52.099) e Operational Support Program infrastrutture del Governo del Victoria. Grazie a Eileen Dunne, Janet Strachan, e Kim Hare per la lettura critica del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | http://www.ssi.dk/ssidiagnostica Bring all antisera to room temperature before use |
|
| Pneumococcus (Omni) antiserum | SSI Diagnostica | 2438 | Bring all antisera to room temperature before use |
| Optical Microscope | Leica Microsystems | Leica DML | |
| Calibrated Disposable Inoculating Loops 1 µl | Copan | CD175S01 | |
| Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | http://www.thermofisher.com.au/ Bring to room temperature before use |
| Heart Infusion (HI) broth | Media Preparation Unit (MPU), The University of Melbourne | 40HIN | Bring to room temperature before use |
| Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Lomb Scientific | 7101 | Sharps hazard: Dispose in a biohazard sharps container |
| Circular glass coverslips | NeuVitro | GG-5 | |
| *Excluding the antisera, all other materials can be purchased from alternative suppliers | |||
| *Plates prepared from defibranated sheep blood are suitable but blood plates prepared from citrated blood or human blood are not |
References
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