Summary
膨張反応は肺炎球菌血清型のためのゴールドスタンダード技術です。この技術は、顕微鏡と、特定の肺炎球菌血清を利用し、一般的に世界的なリファレンス·研究所で使用されています。
Abstract
肺炎球菌 （肺炎球菌）の90の異なる莢膜血清型以上あります。だけでなく、肺炎球菌の疫学を理解するためのツールであるとして、莢膜血清型はワクチンの有効性と影響の研究のために有用な情報を提供することができます。膨張反応は肺炎球菌莢膜血清型のゴールドスタンダード法である。この方法は、莢膜多糖に対して向けプールされた抗血清と特異的に肺炎球菌の細胞懸濁液を試験することを含む。抗原抗体反応は、微視的に観察される。細菌細胞懸濁液の1）の調製、スライドガラス上の細胞及び抗血清の2）混合、および3）顕微鏡を用いて膨張反応を読み取る：プロトコルは、3つの主なステップを有している。膨張反応を行うことが合理的に簡単であり、適切な顕微鏡と抗血清が使用可能な場所に適用することができる。
Introduction
肺炎連鎖球菌 （肺炎球菌）は、病気の負担は資源の乏しい国1で主に落下して、毎年5歳未満の推定80万子供の死を担当しています。肺炎球菌疾患は、敗血症、髄膜炎や肺炎などの重篤な2生命を脅かす感染症に急性中耳炎などの局所的な感染症の重症度の範囲である。肺炎球菌の90莢膜血清型3,4に記載されている。現在の肺炎球菌ワクチンは、侵襲性疾患5、6の大部分の原因である血清型に対する保護を提供する。しかし、ワクチンの広範な使用は、鼻咽頭保菌および侵襲性疾患7,8の両方において、nonvaccine血清型によってワクチンに含まれる血清型の交換に関連している。これは疫学のための血清型の重要性を強調して監視と長期的なワクチン影響調査9。
肺炎球菌のタイピングのためのゴールドスタンダードメソッドは、まず1902年にニューフェルドで記述膨張反応として知られている莢膜反応試験、（オーストリアの10を参照）である。一致度の高い研究室間、及び膨張反応および他の血清型別法11-13の間に見出された。膨張反応10、14〜16のいくつかのバリエーションがあります。ここで説明する方法は、カウンタ汚れや油浸レンズの使用を必要としない、むしろ、調製された試料の低下がタイピング血清と混合し、400Xの倍率で直ちに調べた。
膨張反応は、通常、市販の抗血清を用いて行われる。ここで説明する方法は、より費用効果的にする、いくつかの他の方法を図16、図17と比較してより少ない抗血清を使用する。一度ISOL食べたが、肺炎球菌と同定される陽性反応が観察されるまで、それを順次抗血清プールでテストされています。各プールの抗血清は、91肺炎球菌血清型18に対して産生された抗血清の異なる混合物が含まれています。プールが確立されると、反応性のプールに含まれている個々のタイプ及びグループ抗血清を順次個別に試験する。グループ抗血清（ 例えば 、グループ22抗血清は血清型22Fと22Aと反応して）特定のグループ内の全ての血清型と反応するのに対し、タイプの抗血清は、一般的に、単一の血清型（ 例えば 1型抗血清は血清型1と反応する）と反応する。グループ内のいくつかの血清型はさらに因子抗血清（ 例えば血清型22Fが要因22bに反応するが、しない22C）を使用して区別されます。血清を19,20と判定されるまでこの場合、試験は、全ての関連する因子の抗血清を用いて継続される。膨張反応は、単純かつ迅速であり、14リットル任意で行うことができる良質顕微鏡と抗血清の適切なセットを搭載していaboratory。
Protocol
1。タイピングのための細胞懸濁液を準備
- 無菌使い捨て1μLループを使用して、固体の非選択的なウマ血液寒天培地上に成長させた肺炎球菌の新鮮な一夜純粋培養の小さなスイープを取り、100μlのハートインフュージョン（HI）の培養液に接種する。サスペンションは、単に目に見えて濁ったように見えるはずです。静かに乳化するチューブを攪拌。
注：そのようなブレインハートインフュージョンブロスのような他の媒体も適切であり得る。血清の添加（ 例えば 、最終濃度10％（v / v）のウマ血清）使用前に約1時間37℃でインキュベートして反応を増強するために使用され得る。
2。細胞懸濁液の密度をチェックする
ステップ1.1で調製した細胞懸濁液はまた、陰性対照として使用され、タイピング血清を添加する前に細胞密度をチェックすべきである。
- 1μlのループを用いて、ガラスヒーターの上に、ステップ1.1で調製した接種材料の液滴を転送するS顕微鏡スライド。
- ピンセットを使用して、サスペンションに小さな円形のカバーガラスを配置します。
- 位相コントラスト設定を使用して、サスペンション（ 図1A）の密度をチェックするために、400倍の倍率で顕微鏡的に準備を観察します。
- 接種物（ 図2A）が重すぎる場合は、それを希釈するためのステップ1.1で行われた細胞懸濁液に、よりスープを追加します。優しく再び混ぜる。
- 接種材料が軽すぎる場合には、例えば、顕微鏡視野（ 図2B）に表示<50セルがあると、ステップ1.1で行われた、穏やかに混合細胞懸濁液の準備に多くの細菌を追加します。
注：経験により、細胞懸濁液の密度が揺れ、それだけで目に見えて濁っように見えるべき光にかざすことで判断することができる。
- 好適な数の細胞が顕微鏡視野内に表示されるまで繰り返して2.1から2.3を繰り返します。
注意：ガラススライドとcoverslIPSは、鋭利物危険が。使用後は、スライドとカバーガラスを感染性物質で汚染されており、バイオハザードシャープコンテナに配置しなければならない。
3。タイピング
- 顕微鏡スライドガラス上に（ 例えば 1μLループを使用して）準備された接種物〜1μLを転送します。バイオハザードシャープコンテナにループを捨てる。
- スライド上に室温抗血清を等量の（1μlの白金耳）を追加し、両方のループとよく下がる混ぜる。
- ピンセットを使用して、ドロップに触れないように注意しながら、サスペンション上に小さな円形のカバーガラスを配置します。乾燥からスライド上の流体を防止するために、すぐに抗血清を添加した後サスペンションにカバースリップを配置します。
- 顕微鏡を用いて、400倍の倍率で位相差の下でサスペンションを観察します。肺炎球菌細胞のほとんど又は全く「膨潤」は40で見ることができる場合、負の膨張反応が観察され無血清添加（陰性対照）を有する肺炎球菌細胞懸濁液において観察されるものに類似0X倍率。細胞は陰性対照中の細胞と比較した場合、拡大または「膨潤」と表示されたとき、より可視正の膨張反応が観察される。
注：曖昧反応は室温で5〜10分間のインキュベーション後、またはそれ以上の抗血清との反応を繰り返すことにより反応を検査することによって、例えば、さらに調査されるべきである。 - 陽性反応が観察されるまで、個々の抗血清プールの連続したテストに肺炎球菌血清型別を行っています。代わりに、プールは血清型のローカル発生率に応じて、「ラウンド」で適用することができる。
注：「ラウンド」でのテストでは、最も一般的な血清型に対する抗体を含むプールは労力とコストを最小限に抑え、最初にテストされていることを保証します。複数のプールを同時にテストもINTERPに役に立つ追加ネガティブコントロールを提供し、retation。特定の「ラウンド」内のすべてのプールが負の場合、プールのその後のラウンドでの分離株をテストします。 - 反応性プール内に含まれる適切な型またはグループ抗血清を用いて分離株をテストします。必要に応じて、さらに血清型を区別する因子抗血清を使用しています。
注意：メーカーから供給される肺炎球菌血清への鍵は、適切なプール、タイプ、グループ、または因子抗血清および（任意の交差反応を含む）の結果の解釈の選択に使用されている。 - 否定的な結果は、すべてのプールで得られている場合は、（91血清型21に対する抗体が含まれている）Omniserum試薬と分離株をテストします。肺炎球菌を試験するときに正の膨張反応が依然として観察されない場合Omniserum試薬と分離する分離株は、ほとんどまたは全くカプセルを発現する、又は血清型に対する抗体がOmniserumに示されていないことをしているため、これはあり得る。後者のカテゴリでは、新たな血清型を含むことができる。 </ OL>
Representative Results
型特異的抗体は、その屈折率の10の変化につながる、肺炎球菌のカプセルに結合するとき、正の膨張反応が起こる。顕微鏡で観察すると、細菌は「腫れ」と14より見やすく表示されます。 図1（a）は、ハワイブロス中で肺炎球菌細胞を示す。型特異的抗血清を細菌懸濁液に添加されると、肺炎球菌（ 図1B）、「膨潤」屈折率がより丸みを帯びた現れる。
ブロスに加え、あまりにも多くの細菌細胞は、細胞の凝集や偽陰性反応になることがあります。「重すぎる」（ 図2A）または「明るすぎる」（ 図2B）であるハワイブロス中肺炎球菌の細胞の接種物2に示す図 。
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図1。負と正の膨張反応。血清型9Vの肺炎球菌の準備がNO抗血清（1A）で、グループ9抗血清（1B）で分離し、400倍の倍率で観察した。後者は「腫れ」と一般的に肯定的な膨張反応で見られる細菌細胞の丸めを示しています。
図2。あまりにも重い肺炎球菌細胞懸濁液（2A）または明るすぎる（2B）の重すぎるし、あまりにも軽い接種材料。準備、400Xの倍率で観察した。
Discussion
この技術における重要なステップは、純粋培養物を培養液に細菌細胞の適切な数の加算と一緒に懸濁液を調製するために使用されたことを確認する。これは、寒天プレート上のコロニー増殖と形態が異なる肺炎球菌分離株の間で変動することに留意すべきである。中には、ループをピックオフし、培養液中でよく乳化していない困難な場合がガサガサコロニーを産生する。細胞懸濁液を調製する場合、この理由のため、細菌のより大きな掃引は必要とされ得る。いずれの場合も、それらの相対的な大きさは抗血清での細胞と比較することができるので、個々の細胞ではなく、凝集体は、陰性対照に加え明らかであることが肝要である。また、あまりにも多くの細菌細胞は、莢膜抗原の過剰膨張反応10を阻害する可能性が偽陰性反応をもたらすことがあります。このため、適切な細胞密度を有する細菌懸濁液（ 図1）を作成することが重要である。 SUS年金はホルマリン濃縮を数滴添加することによって、数ヶ月間保存することができる。これは簡単にバッチテストを可能にし、また、実験室院内感染のリスクを低減スープを殺菌するが、これは毒性、腐食性、発癌性、増感、及び可燃性であるホルマリンを扱うことが安全性リスク、比較検討しなければならないが。さらに、我々はいくつかの分離株は、ホルマリン（データは示さず）の存在下で弱い反応を示すことを観察した。
膨化反応は顕微鏡を用いて調べた。位相コントラストの使用は、カプセルの視認性を向上させます。いくつかの研究室では、反応1,000 Xの倍率14,16の油浸を使用して表示される。さらに、いくつかの研究室は、さらに、陽性反応10、16、22の視認性を向上させるためにカウンター染色（メチレンブルー）を使用する。ここで紹介する方法は、オイル-Iなしで見られるmmersionおよび400X倍率15、17アンダー。この方法は、迅速、簡単で23を読み取ることが比較的容易である。
それは、抗血清およびテスト手順が順番にあることを確認するために良好な内部品質管理手順を維持することが重要である。外部品質保証プログラムへの参加は、多くの場合、有益である。
肺炎球菌の血清型のための膨張反応の主な制限は、必要な抗血清のコストが高いことである。しかしながら、これは、それぞれの反応に用いた抗血清の少量に起因する上記のプロトコルに最小化される。いくつかの他の方法は、肺炎球菌23,24血清型について記載されている。しかし、膨化は金本位制のままと新たな方法の開発が膨張反応23に対して標準化を必要とします。適切な抗血清を用いて、膨張反応はまた、他のキャップを識別し、入力するために利用することができるULE細菌25を製造する。膨張反応は、現在および新興の肺炎球菌血清型の特性だけでなく、ワクチンの有効性とキャリッジと病気に対するワクチン接種の長期的な影響に関する情報を提供する上で役立つ。
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、ビル＆メリンダ·ゲイツ財団（PneuCarriageプロジェクト、グラント52099）とビクトリア州政府の運用インフラストラクチャのサポートプログラムによってサポートされていました。原稿の重要な読書のためのアイリーン·ダン、ジャネット·ストラッチャン、キム·ハレに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | http://www.ssi.dk/ssidiagnostica Bring all antisera to room temperature before use |
|
| Pneumococcus (Omni) antiserum | SSI Diagnostica | 2438 | Bring all antisera to room temperature before use |
| Optical Microscope | Leica Microsystems | Leica DML | |
| Calibrated Disposable Inoculating Loops 1 µl | Copan | CD175S01 | |
| Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | http://www.thermofisher.com.au/ Bring to room temperature before use |
| Heart Infusion (HI) broth | Media Preparation Unit (MPU), The University of Melbourne | 40HIN | Bring to room temperature before use |
| Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Lomb Scientific | 7101 | Sharps hazard: Dispose in a biohazard sharps container |
| Circular glass coverslips | NeuVitro | GG-5 | |
| *Excluding the antisera, all other materials can be purchased from alternative suppliers | |||
| *Plates prepared from defibranated sheep blood are suitable but blood plates prepared from citrated blood or human blood are not |
References
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