Innkapsling Serotypebestemmelse av Published: February 24, 2014 doi: 10.3791/51208

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Maha Habib¹, Barbara D. Porter¹, Catherine Satzke^1,2

¹Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, ²Department of Microbiology & Immunology, The University of Melbourne

Summary

Den Quellung reaksjonen er gullstandarden teknikk for Serotypebestemmelse Streptococcus pneumoniae. Denne teknikken benytter et mikroskop og bestemt pneumokokkantisera og er ofte brukt i referanse-og forskningslaboratorier verden over.

Abstract

Det finnes over 90 ulike kapsel serotyper av Streptococcus pneumoniae (den pneumococcus). I tillegg til å være et verktøy for å forstå pneumokokk epidemiologi, kan kapsel serotyping gi nyttig informasjon for vaksine effekt og konsekvensutredninger. Den Quellung reaksjonen er gullstandarden metode for pneumokokkkapsel serotyping. Fremgangsmåten omfatter å teste en pneumokokk cellesuspensjon med poolet og spesifikk antisera rettet mot kapsulært polysakkarid. Den antigen-antistoff-reaksjoner er observert mikroskopisk. Protokollen har tre hovedtrinn: 1) Fremstilling av en bakteriell cellesuspensjonen, 2) blanding av celler og antisera på et objektglass, og 3) å lese den Quellung reaksjon ved hjelp av et mikroskop. Den Quellung reaksjonen er forholdsvis enkel å utføre, og kan anvendes overalt hvor en egnet mikroskop og antisera er tilgjengelige.

Introduction

Streptococcus pneumoniae (den pneumococcus) er ansvarlig for drapet på anslagsvis 800 000 barn under fem år hvert år, med byrden av sykdommen faller hovedsakelig i ressursfattige land ^en. Pneumokokk-sykdommer varierer i alvorlighetsgrad fra lokaliserte infeksjoner som akutt mellomørebetennelse til alvorlige livstruende infeksjoner som blodforgiftning, hjernehinnebetennelse og lungebetennelse ^to. Over 90 kapsulære serotyper av pneumokokker, er beskrevet ^{3, 4.} Nåværende pneumokokkvaksiner gir beskyttelse mot serotyper som er ansvarlig for de fleste av invasiv sykdom ^{5, 6.} Imidlertid har utstrakt bruk av vaksiner vært forbundet med utskifting av serotypene som er inkludert i vaksinen etter nonvaccine serotyper, både in nasopharyngeal vognen og invasiv sykdom ^{7, 8.} Dette understreker viktigheten av serotyping for epidemiologiskovervåking og langsiktig vaksine konsekvensutredninger ^ni.

Gullet standardmetoden for pneumokokk skrive er det kapsulære reaksjons test, kjent som Quellung reaksjon, først beskrevet av Neufeld i 1902 (se østerriksk ^10). En høy grad av concordance ble funnet mellom laboratorier og mellom Quellung reaksjonen og andre serotyping metoder ^11-13. Det er flere variasjoner av Quellung reaksjons ^{10, 14-16.} Metoden som beskrives her ikke krever bruk av en teller flekk eller olje nedsenking linse, snarere er en dråpe og prøven blandet med skrivemaskin serum og umiddelbart undersøkt under 400X forstørrelse.

Den Quellung reaksjonen utføres vanligvis ved hjelp av kommersielt tilgjengelig antisera. Metoden som beskrives her, bruker mindre antisera sammenlignet med noen andre metoder ^{for 16, 17,} noe som gjør det mer kostnadseffektivt. Når en isolspiste er identifisert som en pneumococcus, er det i rekkefølge testet med antisera bassengene frem til en positiv reaksjon blir observert. Hver pool antiserum inneholder ulike blandinger av antisera reist mot 91 pneumokokkserotypene ^18. Når bassenget er etablert, blir den enkelte type og gruppe-antisera som er inkludert i den reaktive bassenget testet individuelt i rekkefølge. Type antisera vanligvis reagere med en enkelt serotype (f.eks Type 1 antiserum reagerer med serotype 1), mens gruppe-antisera reagerer med alle serotypene i en bestemt gruppe (f.eks gruppe 22 antiserum reagerer med serotype 22F og 22A). Noen serotyper innenfor gruppene er videre differensiert ved hjelp av faktor antisera (som serotype 22F reagerer med faktor 22b, men ikke 22c). I dette tilfelle testing fortsettes med alle relevante faktor antisera til serotype bestemmes ^{19, 20..} Den Quellung reaksjonen er enkel og rask, og ¹⁴ kan utføres i en hvilken som helst laboratory som er utstyrt med en god kvalitet mikroskop og hensiktsmessig sett av antisera.

Protocol

En. Utarbeidelse av Cell suspensjon Typing

1. Ved hjelp av en steril engangs en ul loop, ta en liten sveip av frisk over natten renkultur av pneumokokker dyrket på solid selektive hesteblod agar og vaksinere 100 mL Hjerte Infusion (HI) kjøttkraft. Suspensjonen skal synes å være like synlig grumset. Forsiktig agitere røret å emulgere.
   Merk: Andre medier som Brain Hjerte Infusion buljong kan også være egnet. Tilsetning av serum (for eksempel en sluttkonsentrasjon på 10% (v / v) hesteserum) og inkubering ved 37 ° C i omlag 1 time før bruk kan brukes til å forsterke reaksjonen.

2. Kontroll Tetthet av Cell Suspension

Denne cellesuspensjonen fremstilt i trinn 1.1 vil også bli brukt som en negativ kontroll, og bør bli sjekket for celletetthet før tilsetning av skrive sera.

1. Ved hjelp av en 1 pl løkke, overføre en dråpe av inokulum fremstilt i trinn 1.1 til en glass objektglass.
2. Ved hjelp av en pinsett, plasserer en liten sirkulær dekkglass på suspensjon.
3. Ved hjelp av fasekontrastinnstillingen observere preparatet mikroskopisk henhold til 400X forstørrelse, for å kontrollere tettheten av suspensjonen (figur 1A).
   1. Hvis inokulatet er for tungt (figur 2A), tilsett mer kjøttkraft til cellesuspensjonen tatt opp i trinn 1.1 for å fortynne den. Bland forsiktig igjen.
   2. Hvis inokulatet er for lys, for eksempel, er det <50 celler synlige i det mikroskopiske feltet (figur 2B), legge til flere bakterier til cellesuspensjonen preparat laget i trinn 1.1, og bland forsiktig.
      Bemerk: Med erfaring, kan tettheten av cellesuspensjonen bli bedømt ved å riste og holder opp mot en lyskilde, hvor det skal vises å være bare synlig uklar.
4. Gjenta trinn 2,1 til 2,3 inntil et passende antall celler som er synlige i det mikroskopiske feltet.
   Merk: Glass lysbilder og coverslips presentere en sharps fare. Etter bruk blir lysbilder og Dekk forurenset med infisert materiale og må kastes inn i en biologisk kanylebøtte.

Tre. Typing

1. Overfør ~ 1 mL av den tilberedte pode (f.eks ved hjelp av en 1 mL sløyfe) på glass objektglass. Kast løkken inn i biohazard beholder for skarpe gjenstander.
2. Legg et tilsvarende volum (1 mL loopful) med romtemperert antiserum på lysbildet og bland begge faller godt med sløyfen.
3. Ved hjelp av en pinsett, plasserer en liten sirkulær dekkglass på suspensjon, tar seg ikke å berøre dråpe. Plasser dekkglass på suspensjonen umiddelbart etter tilsetning av antisera for å hindre at fluid på lysbildet fra å tørke ut.
4. Ved hjelp av et mikroskop, observere suspensjon under fase-kontrast med 400X forstørrelse. Et negativt Quellung reaksjon blir observert når liten eller ingen "svelling" av pneumokokk-celler kan sees ved 400X forstørrelse, i likhet med hva som er observert i pneumokokk celle suspensjon uten antisera lagt (negativ kontroll). En positiv Quellung reaksjon blir observert når cellene vises forstørret eller 'hoven' og mer synlig når sammenlignet med celler i den negative kontroll.
   Merk: Equivocal reaksjoner bør undersøkes nærmere, for eksempel ved å undersøke reaksjonen etter 5-10 min inkubering ved romtemperatur, eller ved å gjenta reaksjonen med flere antiserum.
5. Gjennomføre pneumokokk serotyping med påfølgende testing av enkelte antisera bassenger til en positiv reaksjon er observert. Alternativt kan bassenger brukes i 'runder' avhengig av lokal forekomst av serotyper.
   Merk: Testing i 'runder' sikrer at bassengene som inneholder antistoffer mot de vanligste serotyper er testet først, minimere innsats og kostnader. Samtidig testing av flere bassenger gir også flere negative kontroller, noe som kan være nyttig i interpretation. Hvis alle bassengene i en bestemt "runde" er negative, teste isolat med påfølgende runder med bassenger.
6. Test isolat ved hjelp av riktig type eller gruppe antiserum som finnes i den reaktive bassenget. Der det er hensiktsmessig, bruker faktor sera å ytterligere differensiere serotype.
   Merk: Nøkler til pneumokokksera levert av produsenten brukes i utvelgelsen av aktuelle bassenget, type, gruppe eller faktor antisera og tolkning av resultatene (inkludert eventuelle kryssreaksjoner).
7. Hvis negative resultater oppnås med alle bassenger, test isolatet med Omniserum reagens (inneholder antistoffer mot 91 serotyper ^21). Hvis en positiv Quellung reaksjon er fremdeles ikke observert når jeg tester en pneumokokk isolere med Omniserum reagens, kan dette være fordi isolatet uttrykker liten eller ingen kapsel, eller at antistoffer mot serotype er ikke representert i Omniserum. Den siste kategorien kan omfatte nye serotyper.
</ Ol>

Representative Results

En positiv Quellung reaksjon oppstår når typespesifikt antistoff binder seg til kapselen av pneumococcus, som fører til en endring i brytningsindeksen ^10.. Sett under et mikroskop, bakterier vises 'hoven' og mer synlig ^14. Figur 1a viser pneumokokk-celler i HI buljong. Når typespesifikt antiserum tilsettes til bakteriesuspensjonen, pneumokokker vises 'hoven', brytnings og mer avrundet (fig. 1B).

For mange bakterieceller tilsettes suppen kan føre til samling av celler eller en falsk negativ reaksjon. Figur 2 viser Inokula av pneumokokk-celler i HI kjøttkraft som er "for tung" (Figur 2A) eller "for lett" (figur 2B).

08fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51208/51208fig1.jpg "/>
Figur 1. Negative og positive Quellung reaksjon. Preparater av serotype 9V pneumokokk isolere uten antiserum (1A) og med gruppe 9 antiserum (1B), ble sett under 400X forstørrelse. Sistnevnte viser 'svelling "og avrunding av bakterieceller vanligvis sett på en positiv Quellung reaksjon.

Figur 2. For tung og for lys inokulater. Preparater av pneumokokk cellesuspensjoner som er for tung (2A) eller for lys (2B), sett under 400X forstørrelse.

Discussion

Et kritisk punkt i denne teknikken er å sikre en ren kultur brukes til å tilberede suspensjonen sammen med tilsetning av et egnet antall bakterieceller til vekstmediet. Det bør bemerkes at kolonivekst og morfologi på agarplater varierer fra pneumokokk isolater. Noen produserer tørr og ru kolonier, som kan være vanskelig å plukke ut med en løkke, og ikke bland godt i suppen. På grunn av dette kan et større sveip av bakterier være nødvendig ved fremstilling av cellesuspensjonen. I alle fall er det viktig at de enkelte celler, og ikke aggregater, er åpenbare i den negative kontrollen, slik at deres relative størrelse kan sammenlignes med celler med antisera tilsatt. I tillegg kan for mange bakteriecellene resultere i en falsk negativ reaksjon, hvor et overskudd av capsular antigen kan hemme Quellung reaksjonen ^10.. Av denne grunn er det viktig å skape en bakteriell suspensjon med en passende celletetthet (figur 1). Den suspensjon kan bli bevart i flere måneder ved tilsetning av flere dråper konsentrert formalin. Dette gjør det enklere å batch testing og også steriliserer suppen redusere risikoen for laboratorieinfeksjoner, selv om dette må veies opp mot risikoen sikkerhet for håndtering av formalin, som er giftig, etsende, kreftfremkallende, allergifremkallende, og brannfarlig. Videre har vi observert at noen isolater viser svakere reaksjoner i nærvær av formalin (data ikke vist).

Quellung reaksjoner er undersøkt ved hjelp av et mikroskop. Bruken av fasekontrast forbedrer synligheten av kapselen. I noen laboratorier blir reaksjonen vises ved hjelp av olje-neddykking ved 1000 X forstørrelse ^{14, 16.} I tillegg er noen laboratorier bruke en teller flekk (metylenblått) for ytterligere å øke synligheten av en positiv reaksjon ^{10, 16, 22.} Metoden som presenteres her er sett uten olje-immersion og under 400X forstørrelse ^{15, 17.} Denne metoden er rask, enkel og forholdsvis lett å lese ^23.

Det er viktig å opprettholde gode interne kvalitetskontroller for å sikre de immunsera og testprosedyrer er i orden. Deltakelse i et eksternt kvalitetssikringsprogram er ofte gunstig.

En viktig begrensning av Quellung reaksjon for serotyping av pneumokokker er den høye kostnaden av antisera nødvendig. Dette er imidlertid minimalisert i den ovennevnte protokoll på grunn av den lille mengden av antiserum brukes for hver reaksjon. Flere andre fremgangsmåter er blitt beskrevet for serotyping pneumokokker ^{23, 24.} Men fortsatt Quellung gullstandarden og utvikling av nye metoder krever standardisering mot Quellung reaksjon ^23. Ved å bruke passende antisera kan Quellung reaksjonen også bli anvendt for å identifisere og skriv andre hetterule produserende bakterier ^25. Den Quellung reaksjonen er instrumental i karakterisering av dagens og fremtidens pneumokokkserotypene, samt gi informasjon om vaksinens effekt og den langsiktige effekten av vaksinering på vogn og sykdom.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pneumococcus (Neufeld) antisera	SSI Diagnostica		http://www.ssi.dk/ssidiagnostica Bring all antisera to room temperature before use
Pneumococcus (Omni) antiserum	SSI Diagnostica	2438	Bring all antisera to room temperature before use
Optical Microscope	Leica Microsystems	Leica DML
Calibrated Disposable Inoculating Loops 1 µl	Copan	CD175S01
Horse Blood Agar (HBA) plates	Thermo Fisher Scientific	PP2001	http://www.thermofisher.com.au/ Bring to room temperature before use
Heart Infusion (HI) broth	Media Preparation Unit (MPU), The University of Melbourne	40HIN	Bring to room temperature before use
Glass microscope slides 76 mm x 26 mm	Lomb Scientific	7101	Sharps hazard: Dispose in a biohazard sharps container
Circular glass coverslips	NeuVitro	GG-5
*Excluding the antisera, all other materials can be purchased from alternative suppliers
*Plates prepared from defibranated sheep blood are suitable but blood plates prepared from citrated blood or human blood are not