Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Капсульная серотипирования Published: February 24, 2014 doi: 10.3791/51208
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, 2Department of Microbiology & Immunology, The University of Melbourne

Summary

Реакция реакция набухания капсулы является золотым стандартом техника для серотипирование Пневмококк. Эта техника использует микроскоп и конкретный пневмококковой антисыворотки и обычно используется в отношении и научно-исследовательских лабораторий по всему миру.

Abstract

Есть более чем 90 различных капсульных серотипов пневмококк (пневмококка). Помимо того, что это инструмент для понимания пневмококковой эпидемиологии, капсульный серотипирование может дать полезную информацию для эффективности и воздействия вакцины исследований. Реакция реакция набухания капсулы является метод золотым стандартом для пневмококковой капсульного серотипирования. Способ включает испытания пневмококковой клеточной суспензии с собирали и специфической антисыворотки, направленной против капсульного полисахарида. Реакции антиген-антитело наблюдаются под микроскопом. Протокол состоит из трех основных этапов: 1) подготовка бактериальной суспензии клеток, 2) смешивания клеток и антисыворотки на предметное стекло, и 3) чтение реакцию реакция набухания капсулы с помощью микроскопа. Реакционную реакция набухания капсулы является достаточно прост в исполнении и может быть применен там, где подходит микроскоп и доступны антисыворотка.

Introduction

Пневмококк (пневмококк) несет ответственность за смерти примерно 800 тысяч детей в возрасте до пяти лет ежегодно, с бремя болезней падения преимущественно в странах с ограниченными ресурсами 1. Пневмококковые заболевания варьируются от локализованных инфекций, таких как острый средний отит до тяжелых угрожающих жизни инфекций, таких как сепсис, менингит и пневмония 2. Более 90 капсульные серотипов пневмококков были описаны 3, 4. Текущие пневмококковой вакцины обеспечивают защиту от серотипов, которые отвечают за большинство инвазивных заболеваний 5, 6. Тем не менее, широкое использование вакцин было связано с заменой серотипов включенных в вакцину на невакцинных серотипов, как в носоглотки перевозки и инвазивных заболеваний 7, 8. Это подчеркивает важность серотипирования для эпидемиологическогонаблюдение и долгосрочное воздействие вакцины изучает 9.

Способ золотым стандартом для пневмококковой ввода является испытание реакции капсульный, известный как реакции реакция набухания капсулы, впервые описан в 1902 году Neufeld (см. австрийский 10). Высокая степень согласованности была обнаружена между лабораториях, а между реакцией реакция набухания капсулы и другие методы серотипирования 11-13. Есть несколько вариантов реакции реакция набухания капсулы 10, 14-16. Описанный здесь метод не требует использование счетчика пятна или масло погружения линзы, а, скорее, капля приготовленных образца смешивают с печатания сыворотки и исследуют сразу под 400-кратном увеличении.

Реакция реакция набухания капсулы обычно выполняется с использованием коммерчески доступного иммунных сывороток. Описанный здесь метод использует меньше антисыворотки по сравнению с некоторыми другими методами 16, 17, что делает его более экономичным. После изолели идентифицируется как пневмококка, он последовательно испытан с антисывороткой бассейнов, пока не наблюдается положительная реакция. Каждый пул сыворотка содержит различные смеси антисыворотки 91 пневмококковых серотипов 18. После того, как пул установлено, индивидуальный тип и группа антисыворотки, которые включены в реактивном бассейне протестированы индивидуально в последовательности. Тип антисыворотки обычно реагируют с одной серотипа (например, тип 1 антисыворотка реагирует с серотипа 1), тогда как группа антисыворотки в реакцию с всех серотипов в конкретной группе (например, группа 22 антисыворотка реагирует с серотипов 22F и 22А). Некоторые серотипы внутри групп дополнительно дифференцированы с помощью фактор антисыворотки (например Серотип 22F реагирует с фактором 22b, но не 22с). В этом случае тестирование продолжается всю необходимую фактора антисыворотками до серотипа не определяется 19, 20. Реакционную реакция набухания капсулы просто и быстро 14 и может быть выполнена в любом лaboratory, который оснащен хорошего качества микроскопа и соответствующим набором антисывороток.

Protocol

1. Подготовка клеточной суспензии для Ввод

  1. Используя стерильный одноразовый 1 мкл петлю, взять небольшой размах свежего ночного чистой культуры пневмококков, выращенной на твердом агаре неселективный крови лошади и привить 100 мкл Heart Infusion (HI) бульон. Подвеска должна показаться всего лишь заметно мутным. Аккуратно агитировать трубку к эмульсию.
    Примечание: Другие средства, такие как сердечно-мозговым бульоне также могут быть пригодны. Добавление сыворотки (например, в конечной концентрации 10% (об / об) лошадиной сыворотки) и инкубации при 37 ° С в течение приблизительно 1 часа перед использованием могут быть использованы для повышения реакции.

2. Проверка плотности клеточной суспензии

Клеточную суспензию полученного на стадии 1.1, также будет использоваться в качестве отрицательного контроля, и должны быть проверены на плотность клеток перед добавлением сыворотки набора текста.

  1. Использование 1 мкл петлю, передача каплю инокулята, полученного на стадии 1.1 на стеклс микроскопа.
  2. Используя пару щипцов, нанесите небольшое круглое покровное о приостановлении.
  3. Использование настройки фазоконтрастной, наблюдать за подготовку микроскопически при 400-кратном увеличении, чтобы проверить плотность суспензии (рис. 1А).
    1. Если инокулят слишком тяжелыми (2А), добавить больше бульона с клеточной суспензией, приготовленной на стадии 1.1, чтобы разбавить его. Аккуратно перемешайте снова.
    2. Если инокулят слишком свет, например, есть <50 клеток видны при микроскопическом поле (рис. 2В), добавить больше бактерий к получению клеточной суспензии сделанного на шаге 1.1 и осторожно перемешать.
      Примечание: С опытом, плотность клеточной суспензии можно судить путем встряхивания и проведение на свет, где оно должно появиться, чтобы быть просто заметно мутным.
  4. Повторите шаги 2.1-2.3 до подходящее количество клеток не могут видеть в поле зрения микроскопа.
    Примечание: Стеклянные слайды и coverslIPS представить острых опасность. После использования горки и покровные загрязнены инфекционного материала и должны быть утилизированы в биологической контейнер для острых предметов.

3. Ввод

  1. Трансфер ~ 1 мкл подготовленной посевного (например, с использованием мкл петлю 1) на предметное стекло микроскопа. Откажитесь от петли в биологической контейнер для острых предметов.
  2. Добавить равный объем (1 мкл петлю) при комнатных температурах антисыворотки на слайд и смешать оба хорошо падает с петлей.
  3. Используя пару щипцов, нанесите небольшое круглое покровное о приостановлении, стараясь не прикасаться к падение. Поместите покровное о приостановке немедленно после добавления антисыворотки, чтобы предотвратить жидкость на слайде от высыхания.
  4. Использование микроскопа, наблюдать за подвеску под поэтапного отличие от 400-кратном увеличении. Негативная реакция реакция набухания капсулы наблюдается при мало или нет "отек" из пневмококковых клеток не видно при 400Х увеличение, подобно тому, что наблюдается в пневмококковой суспензии клеток, без антисыворотками добавил (отрицательный контроль). Положительная реакция реакция набухания капсулы наблюдается, когда клетки появляются в увеличенном или "опухшие 'и более заметным по сравнению с клетками в отрицательного контроля.
    Примечание: Двусмысленные реакции должна быть исследована далее, например, исследуя реакцию после 5-10 мин инкубации при комнатной температуре, или путем повторения реакцию с антисывороткой более.
  5. Провести пневмококковой серотипирование с последовательной проверки отдельных бассейнов АНТИСЫВОРОТКИ пока не наблюдается положительная реакция. Кроме того, бассейны могут быть применены в 'раундов' в зависимости от местных частоты серотипов.
    Примечание: Тестирование в 'раундов' гарантирует, что бассейны, содержащие антитела к наиболее распространенных серотипов будут проверены первыми, минимизации усилий и затрат. Параллельное тестирование несколько бассейнов также обеспечивает дополнительные отрицательные контроли, которые могут быть полезны в Interpretation. Если все бассейны в конкретной "круглые" отрицательны, проверить изолят с последующих раундах бассейнов.
  6. Проверьте изолят с использованием соответствующего типа или группы антисыворотки, содержащийся в реактивной бассейн. В случае необходимости, использовать фактор антисыворотки к дальнейшей дифференциации серотип.
    Примечание: Ключи к пневмококковой антисыворотками поставляемые изготовителем используются в выборе соответствующего пула, типу, группе или фактора антисыворотками и интерпретации результатов (включая любые перекрестные реакции).
  7. Если получены отрицательные результаты, со всеми бассейнами, проверить изолят с Omniserum реагента (содержит антитела против 91 серотипов 21). Если положительная реакция реакция набухания капсулы по-прежнему не наблюдается при тестировании пневмококковой изолировать с реагентом Omniserum, это может быть потому, что изолят выражает мало или вообще не капсулу, или, что антитела против серотипа не представлены в Omniserum. Последняя категория может включать в себя новые серотипов.
    8. </ Ол>

Representative Results

Положительная реакция реакция набухания капсулы происходит, когда тип-специфическое антитело связывается с капсулой пневмококка, что приводит к изменению его преломления 10. При осмотре под микроскопом, бактерии появляются "опухшие" и более заметными 14. Рис. 1А показывает пневмококковых клетки в HI бульоне. Когда тип специфических анти-сыворотки добавляют в бактериальной суспензии, пневмококки появляются 'опухшие', рефракционной и более округлые (фиг.1В).

Слишком много бактериальные клетки добавленных к бульону может привести к агрегации клеток или ложной негативной реакции. Рисунок 2 показывает инокулята пневмококковых клеток в бульоне HI, которые "слишком тяжелы '(фиг. 2А) или" слишком свет' (фиг. 2В).

08fig1highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51208/51208fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Отрицательный и положительная реакция реакция набухания капсулы. Препараты серотипа 9В пневмококковой изолировать, не антисыворотки (1А) и с группой 9 антисыворотки (1Б), рассматривались в 400-кратном увеличении. Последнее показывает "отек" и округления бактериальных клеток, обычно наблюдаемым в положительной реакции реакция набухания капсулы.

Рисунок 2
Рисунок 2. Слишком тяжелым и слишком светлый посевной. Препараты пневмококковых клеточных суспензий, которые слишком тяжелые (2А) или слишком светлые (2B), если смотреть под 400-кратном увеличении.

Discussion

Важным шагом в этой методики заключается в обеспечении чистой культурой используется для приготовления суспензии вместе с добавлением подходящего количества бактериальных клеток в бульоне. Следует отметить, что рост колоний и морфологии на чашках с агаром варьируется между различными пневмококковых штаммов. Некоторые производят сухие и грубые колонии, которые могут быть трудно обрывать с петлей и не эмульсию хорошо в бульоне. По этой причине больший размах бактерий может потребоваться при подготовке клеточной суспензии. В любом случае, важно, что отдельные клетки, а не агрегатов, очевидны в отрицательном контроле, так что их относительный размер можно сравнить с клетками антисыворотками добавил. Кроме того, слишком много бактериальные клетки могут привести к ложной негативной реакции, где избыток капсульного антигена могут ингибировать реакцию реакция набухания капсулы 10. По этой причине очень важно, чтобы создать бактериальной суспензии с подходящей плотности клеток (рис. 1). Устойпенсионного могут быть сохранены в течение нескольких месяцев добавлением нескольких капель концентрированной формалине. Это позволяет легче пакетный тестирование, а также стерилизует бульон снижает риск приобретения инфекций лабораторным путем, хоть это и должны оцениваться с риском безопасности обработки формалином, который токсичные, коррозионные, канцерогенным, информирование и горюч. Кроме того, мы обнаружили, что некоторые штаммы показывают более слабые реакции в присутствии формалина (данные не показаны).

Реакция набухания капсулы реакции рассматриваются с помощью микроскопа. Использование фазового контраста улучшает видимость капсулы. В некоторых лабораториях, реакцию просматривать с помощью масло-погружение в 1000-кратном увеличении 14, 16. Кроме того, некоторые лаборатории используют встречный пятно (метиленовый синий) для дальнейшего повышения наглядности положительной реакции 10, 16, 22. Метод, представленный здесь рассматривается без масла-Immersion и при 400-кратном увеличении 15, 17. Этот метод является быстрым, простым и относительно легко читать 23.

Важно поддерживать хорошие внутренние процедуры контроля качества для обеспечения процедуры сыворотки иммунные и тестирования в порядке. Участие во внешнем программы обеспечения качества часто полезно.

Главным ограничением реакции реакция набухания капсулы для серотипирования пневмококков является высокая стоимость антисыворотки требуется. Однако это сведено к минимуму в приведенном выше протоколе из-за небольшого количества антисыворотки, используемой для каждой реакции. Некоторые другие способы были описаны для серотипирование пневмококков 23, 24. Тем не менее, реакция набухания капсулы остается золотым стандартом и разработка новых методов требует стандартизации против реакции реакция набухания капсулы 23. Использование соответствующих сывороток, реакция реакция набухания капсулы также могут быть использованы для идентификации и ввести другие крышкиОЮЛ бактерий, продуцирующих 25. Реакция реакция набухания капсулы играет важную роль в характеристике текущих и возникающих серотипов пневмококков, а также предоставление информации о эффективности вакцины и долгосрочного воздействия вакцинации на перевозки и болезней.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Фондом Билла и Мелинды Гейтс (проект PneuCarriage, Грант 52099) и Оперативной программы Инфраструктура поддержки викторианской правительства. Благодаря Эйлин Данн, Джанет Страчан, и Ким Заяц за критическое прочтение рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pneumococcus (Neufeld) antisera SSI Diagnostica http://www.ssi.dk/ssidiagnostica
Bring all antisera to room temperature before use
Pneumococcus (Omni) antiserum SSI Diagnostica 2438 Bring all antisera to room temperature before use
Optical Microscope Leica Microsystems Leica DML
Calibrated Disposable Inoculating Loops 1 µl Copan CD175S01
Horse Blood Agar (HBA) plates Thermo Fisher Scientific PP2001 http://www.thermofisher.com.au/
Bring to room temperature before use
Heart Infusion (HI) broth Media Preparation Unit (MPU), The University of Melbourne 40HIN Bring to room temperature before use
Glass microscope slides 76 mm x 26 mm Lomb Scientific 7101 Sharps hazard: Dispose in a biohazard sharps container
Circular glass coverslips NeuVitro GG-5
*Excluding the antisera, all other materials can be purchased from alternative suppliers
*Plates prepared from defibranated sheep blood are suitable but blood plates prepared from citrated blood or human blood are not

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
  2. Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4, 144-154 (2004).
  3. Henrichsen, J. Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae. J. Clin. Microbiol. 33, 2759-2762 (1995).
  4. Calix, J. J., et al. Biochemical, genetic, and serological characterization of two capsule subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 strains: discovery of a new pneumococcal serotype. J. Biol. Chem. 287, 27885-27894 (2012).
  5. Hausdorff, W. P., Bryant, J., Paradiso, P. R., Siber, G. R. Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I. Clin. Infect. Dis. 30, 100-121 (2000).
  6. Johnson, H. L., et al. Systematic evaluation of serotypes causing invasive pneumococcal disease among children under five: the pneumococcal global serotype project. PLoS Med. 8, (2010).
  7. Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378, 1962-1973 (2011).
  8. Obaro, S. K., Adegbola, R. A., Banya, W. A., Greenwood, B. M. Carriage of pneumococci after pneumococcal vaccination. Lancet. 348, 271-272 (1996).
  9. Mulholland, K., Satzke, C. Serotype replacement after pneumococcal vaccination. Lancet. 379, 1388-1389 (2012).
  10. Austrian, R. The quellung reaction, a neglected microbiologic technique. Mt. Sinai. J. Med. 43, 699-709 (1976).
  11. Konradsen, H. B. Validation of serotyping of Streptococcus pneumoniae in Europe. Vaccine. 23, 1368-1373 (2005).
  12. Lovgren, M., et al. Evolution of an international external quality assurance model to support laboratory investigation of Streptococcus pneumoniae, developed for the SIREVA project in Latin America, from. J. Clin. Microbiol. 45, 3184-3190 (2007).
  13. Reasonover, A., et al. The International Circumpolar Surveillance interlaboratory quality control program for Streptococcus pneumoniae. J. Clin. Microbiol. 49, 138-143 (2011).
  14. Hare, K. M., et al. #34;Dodgy 6As": differentiating pneumococcal serotype 6C from 6A by use of the Quellung reaction. J. Clin. Microbiol. 47, 1981-1982 (2009).
  15. Kong, F., Gilbert, G. L. Using cpsA-cpsB sequence polymorphisms and serotype-/group-specific PCR to predict 51 Streptococcus pneumoniae capsular serotypes. J. Med. Microbiol. 52, 1047-1058 (2003).
  16. Castillo, D., et al. Identification and characterization of Streptococcus pneumoniae. Laboratory Methods for the Diagnosis of Meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae. 2nd ed. , World Health Organization. 73-86 (2011).
  17. Kaijalainen, T., Rintamaki, S., Herva, E., Leinonen, M. Evaluation of gene-technological and conventional methods in the identification of Streptococcus pneumoniae. J. Microbiol. Methods. 51, 111-118 (2002).
  18. SSIDiagnostica, Neufeld antisera. , Available from: http://www.ssi.dk/ssidiagnostica (2013).
  19. Sorensen, U. B. Typing of pneumococci by using 12 pooled antisera. J. Clin. Microbiol. 31, 2097-2100 (1993).
  20. Diagnostica SSI, Key to pneumococcal factor antisera. , (2013).
  21. Diagnostica SSI, Pneumococcal antisera for in vitro diagnostic use. , (2011).
  22. Lund, E. Laboratory diagnosis of Pneumococcus infections. Bull. World Health Organ. 23, 5-13 (1960).
  23. Satzke, C., et al. Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group. Vaccine. 32, 165-179 (2013).
  24. Vernet, G., et al. Laboratory-based diagnosis of pneumococcal pneumonia: state of the art and unmet needs. Clin. Microbiol. Infect. 17, 1-13 (2011).
  25. Casewell, M. W. Experiences in the use of commercial antisera for the capsular typing of klebsiella species. J. Clin. Pathol. 25, 734-737 (1972).

Tags

Иммунологии выпуск 84, Реакция набухания капсулы серотипирование Нейфельд пневмококк
Капсульная серотипирования<em&gt; Пневмококк</em&gt; Использование реакции реакция набухания капсулы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Habib, M., Porter, B. D., Satzke, C. … More

Habib, M., Porter, B. D., Satzke, C. Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction. J. Vis. Exp. (84), e51208, doi:10.3791/51208 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter