Summary
Den Quellung reaktion är den gyllene standarden teknik för serotypning Streptococcus pneumoniae. Denna teknik utnyttjar ett mikroskop och specifik pneumokock antisera och används ofta i referens-och forskningslaboratorier över hela världen.
Abstract
Det finns över 90 olika kapsel serotyper av Streptococcus pneumoniae (den pneumokocker). Förutom att vara ett verktyg för att förstå pneumokocker epidemiologi, kan kapsel serotypning ge användbar information för vaccin effekt och effektstudier. Den Quellung reaktion är den gyllene standarden metod för pneumokock kapsulär serotypning. Metoden innebär att testa en pneumokock cellsuspension med poolade och specifika antisera riktade mot kapselpolysackariden. De antigen-antikroppsreaktioner observeras mikroskopiskt. Protokollet har tre huvudsteg: 1) framställning av en bakteriecellsuspension, 2) blandning av celler och antisera på en glasskiva, och 3) läser Quellung reaktion med användning av ett mikroskop. Den Quellung reaktion är relativt enkelt att utföra och kan användas överallt där en lämplig mikroskop och antisera är tillgängliga.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (den pneumokocker) är ansvarig för döden av uppskattningsvis 800.000 barn under fem års ålder varje år, med sjukdomsbördan faller främst i resursfattiga länder 1. Pneumokocksjukdomar variera i svårighetsgrad från lokala infektioner såsom akut öroninflammation till allvarliga livshotande infektioner såsom sepsis, hjärnhinneinflammation och lunginflammation 2. Över 90 kapsel serotyper av pneumokocker har beskrivits 3, 4. Aktuella pneumokocker ger skydd mot de serotyper som är ansvariga för majoriteten av invasiv sjukdom 5, 6. Emellertid har en utbredd användning av vacciner förknippats med byte av serotyper som ingår i vaccinet genom nonvaccine serotyper, både i nasopharyngeal vagnen och invasiv sjukdom 7, 8. Detta belyser vikten av serotypning för epidemiologiskövervakning och långsiktiga vaccin konsekvensbeskrivningar 9.
Guldmyntfoten metod för pneumokocker typning är kapselreaktionstestet, som kallas Quellung reaktionen, först beskriven av Neufeld 1902 (se österrikisk 10). En hög grad av överensstämmelse har konstaterats mellan laboratorier, och mellan Quellung reaktion och andra serotypning metoder 11-13. Det finns flera varianter av Quellung reaktion 10, 14-16. Den metod som beskrivs här kräver inte användning av en räknare bets eller oljeimmersionslins, snarare är en droppe av beredda provet blandas med typning serum och undersöktes omedelbart under 400X förstoring.
Den Quellung Reaktionen utförs vanligtvis med hjälp av kommersiellt tillgängliga antiserum. Den metod som beskrivs här använder mindre antisera jämfört med vissa andra metoder 16, 17, vilket gör det mer kostnadseffektivt. När ett isolåt identifieras som en pneumokocker, den är i tur och ordning provas med antisera pooler tills en positiv reaktion kan iakttas. Varje pool antiserum innehåller olika blandningar av antisera mot 91 pneumokockserotyper 18. När poolen är etablerad, är den individuella typ och grupp antisera som ingår i den reaktiva poolen testas individuellt i följd. Typ antisera reagerar i allmänhet med en enda serotyp (t.ex. typ 1-antiserum reagerar med serotyp 1), medan gruppantiserum reagerar med alla serotyper i en viss grupp (t.ex. Grupp 22-antiserum reagerar med serotyperna 22F och 22A). Vissa serotyper inom grupper är vidare differentieras med hjälp av faktorantiserum (t.ex. serotyp 22F reagerar med faktor 22b, men inte 22c). I så fall testa fortsätter med all relevant faktor sera tills serotyp bestäms 19, 20. Den Quellung reaktion är enkel och snabb 14 och kan utföras i alla laboratory som är utrustad med en god kvalitet mikroskop och lämplig uppsättning av antisera.
Protocol
1. Förberedelse för cell suspension Typing
- Med hjälp av en steril engångs 1 pl loop, ta ett litet svep av färsk natten renkultur av pneumokocker odlas på fast icke-selektiva hästblodagar och inokulera 100 ^ Heart Infusion (HI) buljong. Suspensionen skulle tyckas vara bara synligt grumlig. Skaka försiktigt på röret för att emulgera.
Anmärkning: Andra media såsom Brain Heart Infusion-buljong kan också vara lämpliga. Tillsats av serum (t ex en slutlig koncentration av 10% (volym / volym) hästserum) och inkubering vid 37 ° C under ca 1 timme före användning kan användas för att förbättra reaktionen.
2. Kontroll Densitet för cell Suspension
Cellsuspensionen bereddes i steg 1,1 kommer också att användas som den negativa kontrollen, och bör kontrolleras för celldensitet före tillsats av typning sera.
- Med hjälp av en 1 il slinga, överföra en droppe av inokulat beredd i steg 1.1 på ett glass objektglas.
- Med hjälp av en pincett, placera en liten rund täckglas på upphängningen.
- Använda inställnings fas-kontrast, observera preparatet mikroskopiskt i 400X förstoring, för att kontrollera tätheten av suspensionen (Figur 1A).
- Om inokulatet är för tung (fig 2A), tillsätt mer buljong till cellsuspensionen i steg 1,1 för att späda ut det. Blanda försiktigt igen.
- Om ympen är för ljus, till exempel, finns det <50 celler synliga i det mikroskopiska området (Figur 2B), lägga till fler bakterier till cellsuspensionen preparat görs i steg 1,1 och blanda försiktigt.
Anm: Med erfarenhet, kan densiteten av cellsuspensionen bedömas genom att skaka och hålla upp den mot ljuset, där det ska framstå som bara synligt grumlig.
- Upprepa steg 2,1-2,3 tills ett lämpligt antal celler är synliga i det mikroskopiska området.
OBS: Glasskivor och coverslips presentera en avfalls fara. Efter användning, diabilder och täck förorenade med infektiöst material och måste bortskaffas i en biologiskt avfallsbehållare.
3. Typing
- Överför ~ 1 l av det beredda inokulat (t.ex. med 1 pl loop) på glasobjektglas. Kasta in öglan i biologiskt avfallsbehållare.
- Lägg till en lika stor volym (1 pl ögla) i rumstemperatur antiserum på objektglaset och blanda båda faller väl med slingan.
- Med hjälp av en pincett, placera en liten rund täckglas på fjädring, se till att inte röra vid nedgången. Placera täckglas på suspensionen omedelbart efter tillsatsen av antisera för att förhindra att vätska på sliden från att torka ut.
- Med hjälp av ett mikroskop, observera suspensionen i fas-kontrast med 400X förstoring. En negativ Quellung reaktion observeras när liten eller ingen "svullnad" av pneumococcal celler kan ses vid 400X förstoring, liknande det som observerats i pneumokock cellsuspensionen utan antiserum tillsätts (negativ kontroll). En positiv Quellung reaktioner observeras när cellerna visas förstorad eller "svullen" och mer synlig i jämförelse med cellerna i den negativa kontrollen.
OBS: Tvetydiga reaktioner bör utredas vidare, till exempel genom att undersöka reaktionen efter 5-10 min inkubation vid rumstemperatur, eller genom att upprepa reaktionen med mer antiserum. - Genomför pneumokock serotypning med successiv testning av individuella antisera pooler tills en positiv reaktion kan iakttas. Alternativt kan pooler tillämpas i "rundor" beroende på lokal förekomst av serotyper.
Notera: Testning i "rundor" säkerställer att poolerna innehåller antikroppar mot de vanligaste serotyperna testas först, minimerar ansträngning och kostnad. Samtidig testning av flera pooler ger också ytterligare negativa kontroller, vilket kan vara användbart i interpretation. Om alla pooler i en särskild "runda" är negativa, testa isolat med efterföljande rundor av pooler. - Testa isolat med hjälp av lämplig typ eller grupp antiserum som finns i det reaktiva poolen. Vid behov använder faktorantiserum för att ytterligare differentiera serotyp.
OBS: Nycklar till pneumokock antiserum från tillverkaren används i valet av lämplig pool, typ, grupp eller faktor sera och tolkning av resultat (inklusive eventuella korsreaktioner). - Om negativa resultat erhålls med alla pooler, testa isolat med Omniserum reagens (innehåller antikroppar mot 91 serotyper 21). Om en positiv Quellung reaktion fortfarande inte observeras när man testar ett pneumokock isolat med Omniserum reagens, kan detta bero på att isolera uttrycker liten eller ingen kapsel, eller att antikroppar mot serotyp är inte representerade i Omniserum. Den senare kategorin kan inkludera nya serotyper. </ Ol>
Representative Results
En positiv Quellung reaktion sker när typspecifik antikropp binder till kapseln av pneumokocker, vilket leder till en ändring i dess brytningsindex 10. När ses i mikroskop, bakterierna verkar "svullen" och mer synliga 14. Figur 1A visar pneumokocker celler i HI buljong. Vid typ-specifika antiserum tillsätts bakteriesuspensionen, pneumokocker visas "svullen", brytnings och mer rundad (Figur 1B).
Alltför många bakterieceller till buljongen kan resultera i aggregation av celler eller en falsk negativ reaktion. Figur 2 visar inokula av pneumococcal celler i Hl-buljong som är "för tung" (figur 2A) eller "för ljus" (figur 2B).
08fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51208/51208fig1.jpg "/>
Figur 1. Negativ och positiv Quellung reaktion. Beredningar av serotyp 9V pneumokock isolat utan antiserum (1A) och med grupp 9 antiserum (1B), sågs i 400X förstoring. Det senare visar "svullnad" och avrundning av bakterieceller typiskt sett i en positiv Quellung reaktion.
Figur 2. För tungt och för lätt inokulat. Beredningar av pneumokocker cellsuspensioner som är för tung (2A) eller för ljus (2B), när den visas med 400X förstoring.
Discussion
Ett kritiskt steg i denna teknik är att säkerställa en ren kultur används för att bereda suspensionen tillsammans med tillsats av ett lämpligt antal av bakterieceller till buljongen. Det bör noteras att kolonitillväxt och morfologi på agarplattor varierar mellan olika pneumococcal isolat. Vissa producerar torra och grova kolonier, som kan vara svåra att plocka bort med en ögla och inte emulgerar bra i buljongen. Därför kan en större svep av bakterier krävs vid upprättande av cellsuspension. I varje fall är det absolut nödvändigt att enskilda celler och inte aggregat, är uppenbara i den negativa kontrollen, så att deras relativa storlek kan jämföras med cellerna med antiserum tillsattes. Dessutom kan alltför många bakteriella celler resultera i en falsk negativ reaktion, där ett överskott av kapselantigen kan hämma Quellung reaktion 10. Av denna anledning är det viktigt att skapa en bakteriesuspension med en lämplig celldensitet (figur 1). SUSpension kan bevaras i flera månader genom tillsats av några droppar koncentrerad formalin. Detta möjliggör enklare batch tester och även steriliserar buljongen minskar risken för laboratorie-infektioner, även om detta måste vägas mot risken säkerheten i hanteringen formalin, som är giftigt, frätande, cancerframkallande, allergiframkallande, och brandfarligt. Dessutom har vi observerat att vissa isolat visar svagare reaktioner i närvaro av formalin (data ej visade).
Quellung reaktioner undersöktes med användning av ett mikroskop. Användningen av faskontrast ökar synligheten av kapseln. I vissa laboratorier reaktionen visas med oljeimmersion vid 1000 X förstoring 14, 16. Dessutom, vissa laboratorier använder en räknare fläck (metylenblått) för att ytterligare öka synligheten för en positiv reaktion 10, 16, 22. Den metod som presenteras här betraktas utan olja-immersion och under 400X förstoring 15, 17. Denna metod är snabb, enkel och relativt lätt att läsa 23.
Det är viktigt att upprätthålla en god intern kvalitetskontroll för att säkerställa att sera och testmetoderna är i ordning. Deltagande i ett externt kvalitetssäkringsprogram är ofta fördelaktigt.
En viktig begränsning av Quellung reaktion för serotypning av pneumokocker är den höga kostnaden för antisera krävs. Detta är dock minimeras i ovanstående protokoll på grund av den lilla mängd av antiserum som används för varje reaktion. Flera andra metoder har beskrivits för serotypning pneumokocker 23, 24. Men Quellung fortfarande guldmyntfoten och utvecklingen av nya metoder kräver standardisering mot Quellung reaktion 23. Med hjälp av lämpligt antiserum kan Quellung reaktion också användas för att identifiera och skriva andra lockule producerande bakterier 25. Den Quellung reaktion är avgörande för karaktärisering av befintliga och nya serotyper av pneumokocker, samt att ge information om vaccinets effektivitet och långsiktiga effekter av vaccination på vagnen och sjukdom.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Bill och Melinda Gates Foundation (PneuCarriage projekt, Grant 52099) och den viktorianska regeringens Operational Infrastruktur Support Program. Tack vare Eileen Dunne, Janet Strachan, och Kim Hare för kritisk läsning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | http://www.ssi.dk/ssidiagnostica Bring all antisera to room temperature before use |
|
| Pneumococcus (Omni) antiserum | SSI Diagnostica | 2438 | Bring all antisera to room temperature before use |
| Optical Microscope | Leica Microsystems | Leica DML | |
| Calibrated Disposable Inoculating Loops 1 µl | Copan | CD175S01 | |
| Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | http://www.thermofisher.com.au/ Bring to room temperature before use |
| Heart Infusion (HI) broth | Media Preparation Unit (MPU), The University of Melbourne | 40HIN | Bring to room temperature before use |
| Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Lomb Scientific | 7101 | Sharps hazard: Dispose in a biohazard sharps container |
| Circular glass coverslips | NeuVitro | GG-5 | |
| *Excluding the antisera, all other materials can be purchased from alternative suppliers | |||
| *Plates prepared from defibranated sheep blood are suitable but blood plates prepared from citrated blood or human blood are not |
References
- O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
- Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4, 144-154 (2004).
- Henrichsen, J. Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae. J. Clin. Microbiol. 33, 2759-2762 (1995).
- Calix, J. J., et al. Biochemical, genetic, and serological characterization of two capsule subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 strains: discovery of a new pneumococcal serotype. J. Biol. Chem. 287, 27885-27894 (2012).
- Hausdorff, W. P., Bryant, J., Paradiso, P. R., Siber, G. R. Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I. Clin. Infect. Dis. 30, 100-121 (2000).
- Johnson, H. L., et al. Systematic evaluation of serotypes causing invasive pneumococcal disease among children under five: the pneumococcal global serotype project. PLoS Med. 8, (2010).
- Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378, 1962-1973 (2011).
- Obaro, S. K., Adegbola, R. A., Banya, W. A., Greenwood, B. M. Carriage of pneumococci after pneumococcal vaccination. Lancet. 348, 271-272 (1996).
- Mulholland, K., Satzke, C. Serotype replacement after pneumococcal vaccination. Lancet. 379, 1388-1389 (2012).
- Austrian, R. The quellung reaction, a neglected microbiologic technique. Mt. Sinai. J. Med. 43, 699-709 (1976).
- Konradsen, H. B. Validation of serotyping of Streptococcus pneumoniae in Europe. Vaccine. 23, 1368-1373 (2005).
- Lovgren, M., et al. Evolution of an international external quality assurance model to support laboratory investigation of Streptococcus pneumoniae, developed for the SIREVA project in Latin America, from. J. Clin. Microbiol. 45, 3184-3190 (2007).
- Reasonover, A., et al. The International Circumpolar Surveillance interlaboratory quality control program for Streptococcus pneumoniae. J. Clin. Microbiol. 49, 138-143 (2011).
- Hare, K. M., et al. #34;Dodgy 6As": differentiating pneumococcal serotype 6C from 6A by use of the Quellung reaction. J. Clin. Microbiol. 47, 1981-1982 (2009).
- Kong, F., Gilbert, G. L. Using cpsA-cpsB sequence polymorphisms and serotype-/group-specific PCR to predict 51 Streptococcus pneumoniae capsular serotypes. J. Med. Microbiol. 52, 1047-1058 (2003).
- Castillo, D., et al. Identification and characterization of Streptococcus pneumoniae. Laboratory Methods for the Diagnosis of Meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae. 2nd ed. , World Health Organization. 73-86 (2011).
- Kaijalainen, T., Rintamaki, S., Herva, E., Leinonen, M. Evaluation of gene-technological and conventional methods in the identification of Streptococcus pneumoniae. J. Microbiol. Methods. 51, 111-118 (2002).
- SSIDiagnostica, Neufeld antisera. , Available from: http://www.ssi.dk/ssidiagnostica (2013).
- Sorensen, U. B. Typing of pneumococci by using 12 pooled antisera. J. Clin. Microbiol. 31, 2097-2100 (1993).
- Diagnostica SSI, Key to pneumococcal factor antisera. , (2013).
- Diagnostica SSI, Pneumococcal antisera for in vitro diagnostic use. , (2011).
- Lund, E. Laboratory diagnosis of Pneumococcus infections. Bull. World Health Organ. 23, 5-13 (1960).
- Satzke, C., et al. Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group. Vaccine. 32, 165-179 (2013).
- Vernet, G., et al. Laboratory-based diagnosis of pneumococcal pneumonia: state of the art and unmet needs. Clin. Microbiol. Infect. 17, 1-13 (2011).
- Casewell, M. W. Experiences in the use of commercial antisera for the capsular typing of klebsiella species. J. Clin. Pathol. 25, 734-737 (1972).
