Anti-nukleare Antibody Screening Brug HEp-2-celler

Summary

Indirekte immunofluorescens (IIF) assays er traditionelt blevet anvendt til påvisning af antinukleare antistoffer (ANA) i humant serum. Tilstedeværelsen af ​​disse antistoffer kan støtte i diagnosticering af systemiske autoimmune reumatiske sygdomme (SARD). Denne protokol viser, hvordan man effektivt udfører IIF teknik til præcist at opdage disse autoantistoffer.

Abstract

American College of Rheumatology position erklæring om ANA test fastsætter anvendelse af IIF som guldstandarden metode til ANA screening ^1. Selvom IIF er en fremragende screening test i ekspert hænder, de tekniske vanskeligheder for forarbejdning og læsning IIF slides - såsom arbejdskrævende slide behandling, manuel aflæsning, behovet for erfarne, uddannede teknologer og brugen af ​​mørkt rum - gør IIF-metoden svært at passe i arbejdsgangen af ​​moderne, automatiserede laboratorier.

Det første og afgørende skridt i retning af høj kvalitet ANA screening er omhyggelig slide forarbejdning. Denne procedure er arbejdskrævende, og kræver fuld forståelse af processen, samt opmærksomhed på detaljer og erfaring.

Slide læsning er udført af fluorescerende mikroskopi i mørke rum, og er udført af uddannede teknologer, der er bekendt med de forskellige mønstre i forbindelse med cellecyklusog morfologi interfase og delende celler. Forudsat at IIF er den første linje screeningsværktøj til SARD forstå de skridt til korrekt udføre denne teknik er kritisk.

For nylig er der blevet udviklet digital billedbehandling systemer til automatiseret læsning af IIF dias. Disse systemer, såsom NOVA View Automated fluorescerende mikroskop, er designet til at strømline den rutinemæssige IIF workflow. NOVA View erhverver og gemmer højopløselige digitale billeder af brøndene, og dermed adskille billede erhvervelse fra fortolkning; billederne ses en fortolket på høj opløsning computerskærme. Den gemmer billeder til fremtidig reference og støtter operatørens fortolkning ved at give fluorescerende lys intensitet data om billederne. Det er også foreløbigt kategoriserer resultater som positiv eller negativ, og giver mønstergenkendelse for positive prøver. Sammenfattende det eliminerer behovet for mørkekammer, og automatiserer og strømliner IIF om enhedenng / tolkning workflow. Vigtigst er det, det øger overensstemmelsen mellem læsere og aflæsninger. Desuden med brug af stregkoder dias, er transskriptionsfejl elimineres ved at prøve sporbarhed og positiv patient identifikation. Dette resulterer i øget patientsikkerhed dataintegritet og sikkerhed.

Det overordnede mål med denne video er at demonstrere IIF proceduren, herunder slide behandling, identifikation af fælles IIF mønstre, og indførelsen af ​​nye fremskridt for at forenkle og harmonisere denne teknik.

Introduction

Udtrykket antinuclear antistof (ANA) beskriver en række autoantistoffer, som reagerer med bestanddele af cellekerner inklusive DNA, proteiner og ribonucleoproteiner ^{1, 2.} Den HEp-2 celle, et nativt protein array med hundreder af antigener, tilvejebringer et ideelt substrat til påvisning af ANA ^1. Påvisning af ANA i humant serum er et vigtigt screeningsværktøj til bindevævssygdomme, og IIF er referencemetoden for ANA test af ^1.. For nylig har IIF om HEP-2 celler blevet erstattet i nogle laboratorier med antigen-specifikke immunanalyser og multiplex metoder. Grund af bekymring over falske negative resultater og den manglende gennemsigtighed for klinikere, American College of Rheumatology dannet en taskforce, der konkluderede, at IIF hjælp HEP-2 celler skal være "gold standard" for ANA screening ^1.

På grund af den subjektive natur af ANA screening, kvaliteten af ​​HEp-2-celler iTegral til nøjagtige og selvsikker rapportering af resultater. Tilstedeværelsen af ​​et stort antal mitotiske celler, optimal cellemorfologi tilstrækkelig konfluens og ekspression af relevante antigener er særligt vigtige. IIF mønstergenkendelse fungerer som et vigtigt redskab til at støtte patientens diagnose. Forstå betydningen af ​​forskellige mønstre gør det muligt for klinikere og laboratorie personale til at udføre den relevante opfølgning test for at bekræfte diagnosen. For eksempel kan homogen ANA mønster forekommer i tilstedeværelsen af anti-dsDNA eller kromatin antistoffer og kan være forbundet med systemisk lupus erythematosus (SLE) ^3. Fra den anden side, er det for nylig blevet beskrevet, at den såkaldte tætte fine spættede mønster (DFS), der ofte ses i op til 12% af rutinemæssige prøver, for det meste har været forbundet med anti-DFS70 antistoffer. Disse autoantistoffer, da de blev fundet i isolation (uden anden sygdom-specifikke ANA) er ikke forbundet med systemiske autoimmune gigtsygdomme <sup> 4-9. Derved bekræftende test for anti-DFS70 antistoffer kan hjælpe med at reducere unødvendige refleks test, tilbyder betydelige omkostningsbesparelser, og lette patientens angst.

Da IIF er den første linje screening metode til at opdage autoantistoffer, er det altafgørende, at brugeren forstår, hvordan udvælgelsen af ​​reagenser og væv substrater kan påvirke resultaterne. Da IIF teknik er i sagens natur subjektive, er det vigtigt, at de anvendte reagenser levere den højeste kvalitet.

Dette mål af denne video protokol er at gøre brugeren med de rigtige skridt, der er nødvendige for at udføre IIF-metoden, de fælles mønstre forbundet med ANA, og indføre nye fremskridt, som kan effektivisere arbejdsgangen laboratorium og standardisere resultater.

Protocol

1.. Prøve Selection Forberedelse og substrat

1. Fjern reagenser fra emballage og give hvert element til at komme til stuetemperatur. Forbered reagenser og fortyndes patientsera overensstemmelse med retningen indsatsen. Bemærk: NOVA Lite dias Barcoded og kan nemt integreres i automatiserede systemer i forbindelse med Laboratory Information System LIS. Denne procedure illustrerer manuel slide behandling; høje throughput laboratorier kan dog vælge automatiseret slide udstyr.

2.. Tilsætning af kontroller og prøver

1. Doser 1 dråbe af den positive kontrol og 1 dråbe af den negative kontrol til de relevante slide brønde. Pipetter 20-25 pi fortyndet patientserum til de resterende brønde. Proces ét dias ad gangen.
2. Anbring slide (r) i en farvning beholder med en fugtig papirserviet på bunden. Dæk beholderen og inkubere objektglasset (r) i 30 minutter. Bemærk: De fugtige forhold vilforhindre substratet i at tørre ud. Tørring af brøndene kan resultere i kunstig farvning. I løbet af denne inkubationsperiode vil anti-nukleare antistoffer i patientens serum binder til antigener af de celler, der er fastgjort på hver brønd.
3. Efter inkubationsperioden skylle serum under anvendelse af en mild strøm af vaskepuffer. For at undgå at beskadige underlaget og forhindre cross-over af prøver mellem brønde, vinkel slide lidt for at undgå at lede strømmen direkte på brøndene. Bank overskydende vaskebuffer og placere dias i en Coplin krukke indeholdende vaskebuffer i ca 5 min.

3.. Tilsætning af fluorescerende konjugat

1. Én efter én, skal du fjerne dias fra vaskebuffer og forsigtigt trykke for at fjerne den overskydende vaskebuffer. Anvend 1 dråbe fluorescerende konjugat (FITC-mærket anti-humant IgG) på hver brønd. Glassene inkuberes i 30 minutter i det befugtet beholder, og sørg for at udskifte farvningenbeholderdækslet. Bemærk: ANA test, anbefales brug af en IgG Fc specifik konjugat. Konjugatet er lysfølsomt, og dækslet vil beskytte objektglassene mod lys ud over at opretholde den befugtede miljø. I løbet af denne inkubationsperiode vil konjugatet binde til patientens anti-nukleare antistoffer, som har bundet til celle-antigener. Dette konjugat bindende resultater i nærvær af fluorescens i brøndene.
2. Skyl og vask det dias, som beskrevet ovenfor.
3. Placer et dækglas på et stykke køkkenrulle og anvende montering medium i en ubrudt linje til den nederste kant af dækglasset.
4. Fjern hver dias fra vaskebuffer og trykke på Skub forsigtigt at fjerne den overskydende vaskebuffer. Tryk på den nederste kant af dias til kanten af ​​dækglasset.
5. Sænk forsigtigt slæden på dækglasset på en sådan måde, at deres montering medium på dækglasset strømme til den øverste kant af objektglasset uden luft bobledannelse. Bemærk: Coverslipping, herunder ved hjælp af den optimale mængde af montering medium, er en teknik, der kræver øvelse at perfektionere.

4.. Identifikation af positive og negative resultater

Manuel Fortolkning

1. Se objektglas med et fluorescensmikroskop, der ligger i et mørkt rum. Udføre en scanning af hele godt med en 20X eller 25X formål at vurdere cellefordeling og ensartethed af fluorescens
2. Skift til en 40X målsætning at foretage den endelige fortolkning med hensyn til positivitet og mønster.
3. Ser på de positive og negative kontroller. Grade positivitet ved hjælp af en reaktivitet karakterskala fra 1 + til 4 +. Bemærk: Den negative kontrol vises muligvis ikke helt mørkt, men vil ofte vise lavt niveau uspecifik fluorescens. Den positive kontrol vil vise lyse æble grøn fluorescens i kernen (figur 1).

Automatisk tolkning

Bemærk: I additipå manuel fortolkning, belastning og scan dias fra NOVA View Automatiseret Fluorescens mikroskop eller andre automatiserede digital billedbehandling instrument; ingen mørkekammer er nødvendig. Efter oprettelse af et projekt ved at vælge den relevante slide type instrumentet erhverver og gemmer højopløselige digitale billeder af celler i hver brønd. Derudover NOVA View måler fluorescerende lys intensitet, og kategoriserer resultater som positiv eller negativ, og giver mønstergenkendelse for positive prøver. Billeder er set af operatøren på en høj opløsning computerskærm, der giver mulighed for den endelige fortolkning, revision og bekræftelse af NOVA View resultat. Rapporter kan genereres bekræftede resultater. Digital mikroskopi bør anvendes sammen med en erfaren laborant, som det er beregnet til at hjælpe i fortolkning af resultaterne.

Representative Results

Ved vurdering cellefarvning resultater for HEP-2, fem større nukleare mønstre er hyppigst rapporterede: homogen, spættede centromere, nucleolar og nukleare prikker. Disse mønstre er resultatet af autoantistof binde sig til specifikke bestanddele af kernen. Selvom ANA test er specifik for nukleare strukturer kan cytoplasmatiske mønstre forbundet med autoantistoffer mod cytoplasmatiske strukturer også overholdes. I nogle tilfælde kan flere autoantistoffer være til stede i en prøve, og billedet vises som en blandet mønster.

Der er andre, mindre hyppigt observeret, og ofte cellecyklus specifikke mønstre, der kan registreres af IIF-metoden; Senest har en såkaldt tæt fint spættede mønster med særlig klinisk betydning blevet beskrevet i nogle ANA positive sera.

Homogen Mønster

At identificere en homogen mønster, scanne godt og identificere mitotiske eller dividereceller. Den kondenserede kromatin af mitotiske celler (figur 2, orange pil) udviser fast, ensartet fluorescens, som ofte er mere udtalt end i den hvilende celle nuclei.In det homogene mønster og hvilende celler udviser ensartet diffus fluorescens af hele kernen (figur 2, hvid pil). Denne karakteristisk mønster er ofte et resultat af anti-dsDNA-antistoffer ^10.

Spættet mønster

I grove spættede mønster, de mitotiske celler viser ingen farvning af kondenserede kromosomale regioner (figur 3, orange pil). De hvilende celler udviser kornet fluorescens hele kernen. Det nukleare speckling kan defineres som groft eller fint. Den Grov speckling mønster er ofte et resultat af anti-Sm og anti-RNP ^11.

I det fine spættede mønster, de hvilende celler vise fine eller diffuse speckling hele kerner, typisk i uniform dFordeling (figur 4, hvid pil). Den fine plettet mønster er ofte et resultat af anti-SSAand anti-SSB ^12.

Dense Fin Speckled Mønster

Det er nu anerkendt, at den tætte fine spættede mønster (DFS) er almindeligt i rutinemæssig afprøvning, og så meget som 12% af prøverne er positive for anti-DFS70 autoantistoffer. Men disse autoantistoffer, når der findes i isolation, er ikke forbundet med systemiske autoimmune gigtsygdomme ^{4 -6.} Disse antistoffer er fremherskende hos raske personer og patienter, der bærer sygdomme relateret til SARD ^6. Bekræftende test for anti-DFS70 antistoffer kan hjælpe med at reducere unødvendige refleks test, tilbyder betydelige omkostningsbesparelser, og lette patientens angst.

Da DFS mønster er vanskeligt at identificere og ANA positivitet kan forårsage angst for både patienter og læger, er det stærkt anbefales at udføre en bekræftende test efter identifi velse af et mønster, der tyder på anti-DFS70 antistoffer til at klarlægge den kliniske betydning af ANA positivty ^5,6.

I dette mønster mitotiske celler (figur 5, orange pil) viser positiv plettet farvning af metafase chromatin mens hvilende cellekerner (fig. 5, hvid pil) udviser ensartet fordelte fine prikker hele kernen.

Centromer mønster

At identificere centromeren mønster, scan brøndene og identificere mitotiske eller delende celler. I mitotiske celler (figur 6, orange pil), er disse diskrete prikker blevet tæt knyttet i det, der ofte beskrives som en "metafase bar". I centromeren mønster, hvilende celler (figur 6, hvid pil) viser ca 40-60 diskrete prikker fordelt over hele kerner. Centromer mønster er et resultat af anti-CENP A, B, C antistoffer ^13.

skridt "> nucleolar Mønster

Nogle nucleolar mønstre er forbundet med diffus cytoplasmatisk farvning i mitotiske celler (fig. 7, orange pil) og negative kromosomale område, medens andre nucleolear mønstre viser positiv farvning af det kromosomale region. Den nucleolar mønster er forbundet med homogene eller plettet farvning af nucleoli (fig. 7, hvid pil), sammen med svag plettet eller homogen farvning af nucleoplasm. Disse mønstre er forbundet med anti-RNA-polymerase III, anti-fibrillarin, anti-Th/To og anti-PM/Scl antistoffer ^14,15.

Nuklear prikmønster

Det nukleare prik mønster er forbundet med negative metafase mitotiske celler (fig. 8, orange pil) og med få diskrete prikker i hvilende cellekerner (fig. 8, hvid pil). Denne karakteristisk mønster er ofte et resultat af sp-100, PML eller p80 Colin autoantistoffer. Disse antistoffer er som som knyttes med primær biliær cirrose og autoimmun hepatitis ^16..

. Figur 1. Negativ kontrol (venstre): Celler vist lavt niveau af ikke-specifik fluorescens, men ingen specifik nuklear farvning Positiv kontrol (højre):. Celler vise æblegrøn nuklear fluorescens.

Figur 2. Homogen mønster. Mitotiske celler (orangearrow) viser solid fluorescens. Hvilende celler viser endda, diffus farvning (whitearrow).

"Width =" 500 "/>
Figur 3.. Grov plettet mønster. Mitotiske celler (orange pil) viser negativ farvning. Hvilende celler udviser et klart plettet farvning (hvid pil).

Figur 4.. Fin plettet mønster. Mitotiske celler (orange pil) viser negativ farvning. Hvilende celler udviser et klart fin plettet farvning (hvid pil).

Figur 5.. Tætte fint spættede mønster. Mitotiske celler (orange pil) viser et fint granuleret solid farvning. Hvilende celler viser en meget fin, diffus plettet farvning (whitearrow).

Figur 6.. Centromer mønster. Mitotiske celler (orangearrow) viser uniform, diskrete prikker. Hvilende celler (whitearrow) viser 40-60 diskrete prikker pr cellekernen.

Figur 7. Nucleolar mønster. Mitotiske celler (orangearrow) vises som store klynger af granulær farvning. Resting celle nucleishows fluorescens i nucleoli (whitearrow).

Figur 8. Nuklear punktmønster. Mitotiske celler (orangearrow) fremgår negativ. Hvilende celler viser et par Discrete prikkerne i kernen (whitearrow). Derudover kan nucelar punktmønster sameksistere med cytoplasmatisk farvning er forbundet med autoantistoffer til mitokondrielle antigener (rød pil).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate)	INOVA Diagnostics	708102
NOVA View Instrument	INOVA Diagnostics	NV2000
QUANTA Link Workstation	INOVA Diagnostics	LINK010
QUANTA Link Workstation License	INOVA Diagnostics	LINK001
Barcode Scanner	INOVA Diagnostics	LINK019