Summary
Косвенное иммунофлуоресцентный (IIF) анализы традиционно использовались для обнаружения антинуклеарных антител (АНА) в сыворотке крови человека. Присутствие этих антител может помочь в диагностике системных аутоиммунных ревматических заболеваний (САРД). Этот протокол демонстрирует, как эффективно выполнять технику IIF точно обнаружить эти аутоантитела.
Abstract
Американский колледж Положении ревматологии по тестированию ANA предусматривает использование IIF в качестве метода золотой стандарт для ANA скрининг 1. Хотя IIF является отличным скрининг-тест в опытных руках, технические трудности обработки и чтения IIF скользит - таких, как трудоемкой обработки слайд, ручного считывания, потребность в опытных, обученных технологов и использование темной комнате - сделать метод IIF трудно вписать в рабочий процесс современных, автоматизированных лабораторий.
Первый и наиболее важный шаг на пути к высококачественной ANA скрининга осторожны обработки слайд. Эта процедура является трудоемкой и требует полного понимания процесса, а также внимание к деталям и опыта.
Презентация считывание выполняется методом флуоресцентной микроскопии в темных комнатах, и делается обученным технологов, которые знакомы с различными узорами, в контексте клеточного циклаи морфология интерфазы и делящихся клеток. При условии, что IIF является первой линией инструмент скрининга для САРД, понимая шаги правильно выполнять эту технику имеет решающее значение.
В последнее время цифровые системы визуализации были разработаны для автоматизированного чтения IIF слайдов. Эти системы, такие как NOVA Посмотреть автоматизированной флуоресцентного микроскопа, предназначены для упрощения рутинной рабочий процесс IIF. NOVA Посмотреть приобретает и сохраняет с высоким разрешением цифровые изображения лунок, тем самым отделяя получение изображений от интерпретации; просмотре изображений интерпретируется на компьютерных мониторах высокого разрешения. Он хранит изображения для использования в будущем и поддерживает интерпретацию оператора, предоставляя флуоресцентные данные интенсивности света на изображениях. Он также предварительно классифицирует результаты как позитивные или негативные, и обеспечивает распознавание образов для положительных образцов. Таким образом, это устраняет необходимость в темной комнате, и автоматизирует и упрощает Readi IIFнг / интерпретация рабочий процесс. Самое главное, что увеличивает согласованность между читателями и чтениях. Кроме того, с использованием штрих слайдов, ошибки транскрипции устраняются путем предоставления образца отслеживаемости и положительной идентификации пациента. Это приводит к увеличению пациента целостности и безопасности данных.
Общая цель этого видео, чтобы продемонстрировать процедуру IIF, включая обработку слайд, выявление общих моделей IIF, и внедрения новых достижений упрощения и согласования эту технику.
Introduction
Термин антинуклеарных антител (АНА) описывает разнообразные аутоантител, реагирующих с компонентами клеток ядер в том числе ДНК, белков и рибонуклеопротеинов 1, 2. Нер-2 клеток, уроженец массив белка с сотнями антигенов, представляет собой идеальную подложку для обнаружения АНА 1. Обнаружение ANA в сыворотке человека является важным инструментом скрининга для заболеваний соединительной ткани, и IIF является эталонным методом для тестирования ANA 1. Недавно IIF на Нер-2 клеток была заменена в некоторых лабораторий с антиген-специфических иммунологических и мультиплексных методами. Из-за опасений по поводу ложных отрицательных результатов и отсутствия прозрачности для клиницистов, Американский колледж ревматологии сформировали целевую группу, что к выводу, что IIF использованием клеток Нер-2 должен быть "золотым стандартом" для ANA скрининг 1.
Из-за субъективного характера ANA скрининга, качество Нер-2 в клеткахинтегральную к точной и уверенной отчетности о результатах. Присутствие большого количества митотических клеток, оптимальная морфология клеток, достаточное сплошности и экспрессию соответствующих антигенов являются особенно важными. IIF распознавания образов служит в качестве важного инструмента для оказания помощи в диагностике пациентов. Понимание значения различных форм позволяет клиницисты и персонал лаборатории для выполнения соответствующего Последующие испытания, чтобы подтвердить диагноз. Например, однородный образец ANA может происходить в присутствии анти-дцДНК или хроматина антител, и могут быть связаны с системной красной волчанкой (СКВ) 3. С другой стороны, недавно было описано, что так называемые плотные мелкий пестрый рисунок (DFS), что обычно наблюдается в до 12% рутинных проб, в основном были связаны с анти-DFS70 антител. Эти аутоантитела, когда найдено в изоляции (без других конкретных заболеваний АНА) не связаны с системными аутоиммунными ревматическими заболеваниями <вир> 4-9. Таким образом подтверждающее тестирование на анти-DFS70 антител может помочь уменьшить ненужных испытаний рефлекс, предложить значительную экономию средств, и ослабить беспокойство пациента.
Учитывая, что IIF является первым методология линия скрининг для выявления аутоантител, чрезвычайно важно, чтобы пользователь понимает, как выбор реагентов и тканей субстратов может повлиять на результаты. Поскольку методика IIF по своей сути субъективны, важно, чтобы реагенты, используемые обеспечивают самые высокие качественные результаты.
Эта цель этого видео протокола является ознакомление пользователя с правильными шаги, необходимые для выполнения способа IIF, распространенные паттерны, связанные с АНА, и ввести новые достижения, которые могут рационализации лабораторный рабочий процесс и стандартизации результатов.
Protocol
1. Подготовка образцов и подложки Selection
- Удалить реагенты из упаковки и позволяют каждый элемент до комнатной температуры. Подготовка реагентов и разбавить сывороток пациентов в соответствии с направлением вставки. Примечание: NOVA Lite слайды штрих и может быть легко интегрирован в автоматизированные системы в сочетании с Лабораторная информационная система ЛИС. Эта процедура иллюстрирует ручной обработки слайд; высокие лаборатории пропускной, однако, может выбрать для автоматизированной технологического оборудования слайд.
2. Добавление контролей и образцов
- Внесите 1 каплю положительного контроля и 1 каплю отрицательного контроля в соответствующие слайд скважин. Внесите 20-25 мкл разбавленной сыворотки пациента в оставшиеся лунки. Процесс один слайд в то время.
- Поместите слайд (ы) в окрашивания контейнер с влажным бумажным полотенцем на дне. Крышка контейнера и инкубировать слайд (ы) в течение 30 мин. Примечание: влажных условиях будетпредотвратить субстрат от высыхания. Сушка скважин может привести к артефактом окрашивания. В течение этого инкубационного периода антиядерные антитела в сыворотке пациента, связываются с антигенами клеток, устраняемых в каждую лунку.
- После инкубационного периода, смойте сыворотку с помощью нежный поток промывочного буфера. Во избежание повреждения подложки и предотвратить перекрестное за кадром образцов между скважинами, угол скольжения слегка чтобы избежать направления потока непосредственно на скважинах. Нажмите лишнюю промывочный буфер и поместить слайд в банку Коплин содержащей промывочного буферного раствора в течение примерно 5 мин.
3. Добавление люминесцентных конъюгата
- Один за другим, удалить слайды из буфера мытья и слегка постучите, чтобы удалить избыток промывочного буфера. Нанести 1 каплю флуоресцентного конъюгата (FITC с надписью анти-человеческий IgG) в каждую лунку. Инкубируйте слайды в течение 30 мин в увлажненной контейнера, и не забудьте заменить окрашиваниекрышка контейнера. Примечание: Для тестирования ANA, использование в конкретной сопряженных IgG Fc рекомендуется. Сопряженная является светочувствительным, и крышка защитит слайды от воздействия света в дополнение к поддержанию во влажной среде. В течение этого периода инкубации, сопряженное будет связываться с анти-ядерных антител пациента, которые связаны с клеточными антигенами. Этот связывающий конъюгат результаты в присутствии флуоресценции в лунках.
- Промыть и мыть слайд, как описано выше.
- Поместите покровное на бумажное полотенце и применять монтажную среду в сплошной линией на нижнем краю покровного стекла.
- Удалить каждый слайд из буфера мытья и нажмите слайд осторожно, чтобы удалить лишнюю промывочный буфер. Нажмите нижний край слайда к краю покровного стекла.
- Осторожно опустить слайд на покровное таким образом, что монтажная среда на покровное течет в верхней кромки ползуна без образования пузырьков воздуха. Примечание: Соverslipping, в том числе с использованием оптимального количества монтажной среды, является метод, который требует практики, чтобы усовершенствовать.
4. Выявление положительных и отрицательных результатов
Руководство Интерпретация
- Просмотр слайдов с флуоресцентным микроскопом, расположенный в темной комнате. Выполните сканирование всего скважины с 20-кратным или 25X цели для оценки распределения клеток и однородность флуоресценции
- Переключитесь на цели 40Х, чтобы сделать окончательный интерпретацию о положительности и рисунок.
- Посмотрите на положительных и отрицательных контролей. Оценка положительность использованием реактивности бальной шкале от 1 + до 4 +. Примечание: отрицательный контроль может не появиться совсем темно, но будет часто демонстрируют неспецифическую флуоресценцию низкий уровень. Положительный контроль покажет яркий яблочный зеленую флуоресценцию в ядре (рис. 1).
Автоматизированная интерпретация
Примечание: В дополнительна ручной интерпретации, нагрузки и сканирования слайдов по NOVA Посмотреть автоматизированной флуоресцентного микроскопа или другого автоматизированного цифрового прибора формирования изображения; не фотолаборатории не требуется. После создания проекта, выбрав подходящий тип слайд, прибор приобретает и сохраняет с высоким разрешением цифровые изображения клеток в каждой лунке. Кроме того, NOVA Посмотреть измеряет интенсивность флуоресценции света, и классифицирует результаты как позитивные или негативные, и обеспечивает распознавание образов для положительных образцов. Изображения просматриваться оператором на мониторе компьютера с высоким разрешением, что позволяет окончательной интерпретации, пересмотра и подтверждения NOVA Посмотреть результат. Отчеты можно создавать на подтвержденных результатов. Цифровая микроскопия должен быть использован в сочетании с опытным лаборанта так как он предназначен для помощи в интерпретации результатов.
Representative Results
При оценке результатов окрашивания клеток для Нер-2, пять основных ядерных шаблоны наиболее часто встречающихся: однородная, в крапинку, центромеры, ядрышек, а ядерные точки. Эти модели являются результатом аутоантител связывания со специфическими компонентами ядра. Хотя тестирование ANA является специфическим для ядерных структур, цитоплазматические структуры, связанные с аутоантител против цитоплазматических структур также может наблюдаться. В некоторых случаях, несколько аутоантитела могут присутствовать в образце, и изображение может отображаться в виде смешанной формы.
Есть и другие, менее часто наблюдается, и часто специфические клеточного цикла модели, которые могут быть обнаружены с помощью метода IIF; Совсем недавно так называемые плотные мелкий пестрый узор с особым клиническое значение было описано в некоторых ANA положительной сыворотки.
Однородная Pattern
Чтобы определить однородную картину, сканировать хорошо и определить митотических или делениемклетки. Конденсированного хроматина из делящихся клеток (рис. 2, оранжевая стрелка) имеет прочную, единую флуоресценции который часто сильнее, чем в покоящейся клетки nuclei.In однородной рисунком, покоящиеся клетки выставочная форме, диффузного флуоресценции всей ядра (рис. 2, белые стрелки). Это характерная картина часто является результатом анти-дц-ДНК антител 10.
Пестрая Pattern
В грубой пестрой картины, митотические клетки не проявляют окрашивание конденсированных участков хромосом (рис. 3, оранжевая стрелка). В покоящиеся клетки проявляют гранулированный флуоресценции в течение всего ядра. Ядерная зернистость может быть определен как грубой или штрафа. Грубый рисунок зернистость часто является результатом анти-Sm и анти-RNP 11.
В изобразительном пестрой картины, то покоящиеся клетки отображения мелких или диффузное зернистость всей ядер, как правило, в едином гistribution (рис. 4, белые стрелки). Штраф в крапинку рисунок часто является результатом анти-SSAand анти-SSB 12.
Плотные Изысканные Пестрая Pattern
В настоящее время признано, что плотная тонкая пестрый узор (DFS) является общим в рутинного тестирования, и столько, сколько 12% проб положительны для анти-DFS70 аутоантител. Однако эти аутоантитела, когда найдено в изоляции, не связаны с системными аутоиммунными ревматическими заболеваниями 4 -6. Эти антитела, которые широко распространены в здоровых людей и пациентов, имеющих заболевания, не связанные с САРД 6. Подтверждающий тест на анти-DFS70 антител может помочь уменьшить ненужных испытаний рефлекс, предложить значительную экономию средств, и ослабить беспокойство пациента.
Поскольку шаблон DFS трудно определить и ANA положительность может вызвать беспокойство в обоих пациентов и врачей, то настоятельно рекомендуем выполнить подтверждающий тест после отождествлении фикации шаблон наводящий анти-DFS70 антител уточнить клиническое значение АНА positivty 5,6.
В этом шаблоне митоза клетки (рис. 5, оранжевая стрелка) показать положительный пятнистые окрашивание метафазной хроматина, во время отдыха клеточные ядра (рис. 5, белая стрелка) экспонат равномерно распределенные мелкие крапинки по всему ядру.
Центромера Pattern
Чтобы определить модель центромер, сканировать скважин и определить митотических или делящиеся клетки. В митотических клеток (рис. 6, оранжевая стрелка), эти дискретные пятен стать тесно связана в том, что часто описывается как "метафазной баре". В структуре центромеры, покоящиеся клетки (рис. 6, белая стрелка) показать около 40-60 дискретных пятен, распределенные по ядер. Шаблон центромеры является результатом анти-CENP A, B, C антитела 13.
шаг "> ядрышковых PatternНекоторые ядрышковые модели связаны с диффузной окрашивание цитоплазмы в митотических клеток (рис. 7, оранжевая стрелка) и отрицательной области хромосомы, в то время как другие nucleolear модели отображения положительное окрашивание хромосомной области. Ядрышковый шаблон связан с однородной или крапчатый окрашивания ядрышек (рис. 7, белая стрелка), а также слабой крапчатый или гомогенного окрашивания нуклеоплазме. Эти модели связаны с анти-РНК-полимеразы III, анти-фибрилларин, anti-Th/To и anti-PM/Scl антитела 14,15.
Ядерная Dot Pattern
Шаблон ядерной точка связана с отрицательными метафаза митотических клеток (рис. 8, оранжевая стрелка) и с несколькими дискретными крапинками в покое клеточных ядер (рис. 8, белая стрелка). Это характерная картина часто результат SP-100, ПМЛ, или P80 Колин аутоантител. Эти антитела также sociated с первичным билиарным циррозом и аутоиммунным гепатитом 16.
. Рисунок 1 Отрицательный контроль (слева): Клетки отображения низкий уровень неспецифического флуоресценции, но не конкретный ядерное окрашивание Положительный контроль (справа):. Клетки отображения яблочный зеленый ядерной флуоресценции.
Рисунок 2. Однородная модель. Митотические клетки (orangearrow) показать твердую флуоресценции. Покоящиеся клетки показывают даже, диффузный окрашивания (whitearrow).
"Ширина =" 500 "/>
Рисунок 3. Грубый пятнистые картины. Митотические клетки (оранжевая стрелка) показать негативное окрашивание. Покоящихся клеток наблюдается отчетливая крапчатую пятно (белая стрелка).
Рисунок 4. Изысканные пестрый рисунок. Митотических клеток (оранжевая стрелка) показать негативное окрашивание. Покоящихся клеток наблюдается отчетливая тонкая крапчатую окрашивание (белая стрелка).
Рисунок 5. Плотные штраф в крапинку рисунок. Митотических клеток (оранжевая стрелка) показывают мелкозернистого твердого окрашивание. Покоящихся клеток показывают, очень тонкие, диффузный крапчатую пятно (whitearrow).
Рисунок 6. Центромера рисунок. Митотические клетки (orangearrow) показать равномерным, дискретные пятен. Отдыхая клетки (whitearrow) показывает 40-60 дискретных пятен на клеточном ядре.
Рисунок 7. Ядрышковых рисунок. Митотические клетки (orangearrow) появляются как большие кластеры гранулированного окрашивания. Отдыхая клеток nucleishows флуоресценции в ядрышек (whitearrow).
Рисунок 8. Ядерная точка рисунок. Митотические клетки (orangearrow) появляются отрицательные. Покоящиеся клетки показывают несколько DISCRETE пятен в ядре (whitearrow). Кроме того, nucelar шаблон точка может сосуществовать с цитоплазматической окрашивания, связанной с аутоантител к митохондриальных антигенов (красная стрелка).
Disclosures
Авторы Габриэлла Lakos, Кассандра Брайант, Кэрол Бюхнера, и Анна Ислами являются сотрудниками INOVA Diagnostics.
Acknowledgments
Мы благодарим Cassandra Брайант для проведения эксперимента IIF и Кэрол Buchner для ее экспертной технического обзора.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate) | INOVA Diagnostics | 708102 | |
| NOVA View Instrument | INOVA Diagnostics | NV2000 | |
| QUANTA Link Workstation | INOVA Diagnostics | LINK010 | |
| QUANTA Link Workstation License | INOVA Diagnostics | LINK001 | |
| Barcode Scanner | INOVA Diagnostics | LINK019 |
References
- Meroni, P. L., Schur, P. H. ANA screening: an old test with new recommendations. Ann Rheum Dis. 69 (8), 1420-1422 (2010).
- Tan, E. M. Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in immunology. 33, 167-240 (1982).
- Sack, U., et al. Autoantibody detection using indirect immunofluorescence on HEp-2 cells. Ann NY Acad Sci. 1173, 166-173 (2009).
- Watanabe, A., et al. Anti-DFS70 antibodies in 597 healthy hospital workers. Arthritis Rheum. 50 (3), 892-900 (2004).
- Mahler, M., et al. Importance of the dense fine speckled pattern on HEp-2 cells and anti-DFS70 antibodies for the diagnosis of systemic autoimmune diseases. Autoimmun Revi. 11 (9), 642-645 (2012).
- Mahler, M., Fritzler, M. J. The clinical significance of the dense fine speckled immunofluorescence pattern on HEp-2 cells for the diagnosis of systemic autoimmune diseases. Clin Dev Immunol. , (2012).
- Miyara, M., et al. Clinical phenotypes of patients with anti-DFS70/LEDGF antibodies in a routine ANA referral cohort. Clin Dev Immunol. , (2013).
- Mariz, H., et al. Pattern on the antinuclear antibody-HEp-2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear antibody positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases. Arthritis Rheum. 63 (1), 191-200 (2011).
- Muro, Y., et al. High concomitance of disease marker autoantibodies in anti-DFS70/LEDGF autoantibody-positive patients with autoimmune rheumatic disease. Lupus. 17 (3), 171-176 (2008).
- Agmon-Levin, N., et al. International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies. Ann Rheum Dis. 73 (1), 17-23 (2014).
- Craft, J., et al. The U2 small nuclear ribonucleoprotein particle as an autoantigen. J Clin Invest. 81 (6), 1716-1724 (1998).
- Salomonsson, S., et al. A serologic marker for fetal risk of congenital heart block. Arthritis Rheum. 46 (5), 1233-1241 (2002).
- Miyawaki, S., et al. Clinical and serological heterogeneity in patients with anticentromere antibodies. J Rheumatology. 32 (8), 1488-1494 (2005).
- Raijamkers, R., et al. PM-Scl-75 is the main autoantigen in patients with the polymyositis/scleroderma overlap syndrome. Arthritis Rheum. 50 (2), 565-569 (2004).
- Yang, J. M., et al. Human scleroderma sera contain autoantibodies to protein components specific to the UC small nucleolar RNP complex. Arthritis Rheum. 48 (1), 210-217 (2003).
- Granito, A., et al. Antinuclear antibodies as ancillary markers in primary biliary cirrhosis. Expert Rev Mol Diagn. 12 (1), 65-74 (2012).
