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Medicine

ऑस्टियो सार्कोमा कोशिकाओं में Photodynamic थेरेपी के साइटोटोक्सिक प्रभावकारिता Published: March 18, 2014 doi: 10.3791/51213
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Laboratory for Orthopedic Research, Balgrist University Hospital, Zurich, Switzerland
* These authors contributed equally

Summary

यहां बताया प्रोटोकॉल की अनुमति देता है photodynamic सेल लाइनों में थेरेपी (पीडीटी) और पशु मॉडल में चिकित्सा लागू करने से पहले पीडीटी सेटिंग्स का अनुकूलन की प्रभावकारिता का मूल्यांकन.

Abstract

हाल के वर्षों में, कम प्रणालीगत दुष्प्रभाव के साथ कैंसर के खिलाफ अधिक प्रभावी उपचार खोजने में परेशानी हुई है. इसलिए Photodynamic थेरेपी एक अधिक ट्यूमर चयनात्मक उपचार के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण है.

ऑक्सीजन की उपस्थिति में एक विशिष्ट तरंगदैर्ध्य के प्रकाश के साथ सक्रियण पर, एक साइटोटोक्सिक प्रतिक्रिया 1 बटोर कि ऑक्सीजन कण उत्पन्न करता है, जो एक nontoxic photosensitizer (पी एस), का उपयोग करता है कि Photodynamic थेरेपी (पीडीटी). एफडीए द्वारा लगभग बीस साल पहले अपने अनुमोदन के बावजूद, पीडीटी आजकल केवल प्रकार के कैंसर (त्वचा, मूत्राशय) और nononcological रोग (सोरायसिस, सुर्य keratosis) 2 की सीमित संख्या के इलाज के लिए प्रयोग किया जाता है.

पीडीटी का उपयोग करने का प्रमुख लाभ प्रणालीगत दुष्प्रभाव से बचाता है जो एक स्थानीय उपचार, प्रदर्शन करने की क्षमता है. इसके अलावा, यह (नसों या रक्त वाहिकाओं के आसपास जैसे) नाजुक स्थलों पर ट्यूमर के इलाज के लिए अनुमति देता है. इधर, एक intraoperatपीडीटी के Ive आवेदन osteosarcoma (ओएस) में, प्राथमिक ट्यूमर उपग्रहों को लक्षित करने के लिए हड्डी के एक ट्यूमर, शल्य ट्यूमर लकीर के बाद आसपास के ऊतकों ट्यूमर में पीछे छोड़ दिया है माना जाता है. उपचार recurrences की संख्या को कम करने के लिए और (पश्चात) मेटास्टेसिस के लिए जोखिम को कम करना है.

अध्ययन में मौजूद है, हम अच्छी तरह से स्थापित intratibial ओएस माउस मॉडल में मानव रोग पुन: पेश करने के लिए उपयोग किया जाता है कि व्यापक रूप से इस्तेमाल ओएस सेल लाइनों के प्रभावी उपचार के लिए इष्टतम पीडीटी सेटिंग्स स्थापित करने के लिए इन विट्रो पीडीटी प्रक्रियाओं में प्रस्तुत करते हैं. पुनश्च mTHPC की तेज एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और phototoxicity एक WST-1 परख के साथ और जीवित कोशिकाओं की गिनती द्वारा मूल्यांकन कोशिका मृत्यु को उत्पन्न करने के लिए 652 एनएम पर mTHPC की लेजर प्रकाश उत्तेजना के साथ उकसाया था के साथ जांच की गई थी. स्थापित तकनीक पशु मॉडल में भविष्य के अध्ययन के लिए इष्टतम पीडीटी सेटिंग्स को परिभाषित करने के लिए सक्षम. वे पीडीटी की प्रभावकारिता के मूल्यांकन के लिए एक आसान और त्वरित उपकरण हैं विवो में एक आवेदन से पहले.

Introduction

Osteosarcoma (ओएस) की कला उपचार के आज के राज्य, एक प्राथमिक हड्डी के ट्यूमर, नव सहायक कीमोथेरेपी और सर्जरी का एक संयोजन शामिल हैं. इस इलाज के आहार कीमोथेरेपी का उपयोग करने से पहले लगभग 20% से स्थानीय रोग के साथ रोगियों के जीवित रहने की दर में वृद्धि से पता चला है, वर्तमान में 4, 3% 60-70 के बीच. हालांकि, पिछले दो दशकों में, स्थानीय रोग के साथ ओएस रोगियों के समग्र अस्तित्व, 5 4 plateaued है. इसके अलावा, इन रोगियों के 30-40% के निदान के बाद 3 साल के भीतर पलटा और metastatic रोग के साथ रोगियों के 20-30% 4 के एक गरीब अस्तित्व, 6, 7 के लिए जारी. इन रोगियों के परिणाम में सुधार करने के लिए, नई चिकित्सकीय रणनीति विकसित किए जाने की जरूरत है.

Photodynamic थेरेपी (पीडीटी), एक नहीं बल्कि उपन्यास चिकित्सा विरोधी, एक photosensi की उत्तेजना के लिए एक विशिष्ट तरंगदैर्ध्य के प्रकाश का उपयोग करता हैखून में इसकी इंजेक्शन के बाद ट्यूमर कोशिकाओं में जम जाता है, जो tizer (पी एस),. पुनश्च की लेजर प्रकाश उत्तेजना ट्यूमर कोशिकाओं और कोशिका मृत्यु में साइटोटोक्सिक प्रतिक्रिया को प्रेरित जो ऑक्सीजन की उपस्थिति में ऑक्सीजन कण, उत्पन्न करता है. पीडीटी ट्यूमर रोधगलन के लिए अग्रणी वाहिकासंकीर्णन और ट्यूमर microvasculature की thrombus गठन का कारण बनता है और ट्यूमर के अंदर फलस्वरूप स्थानीय हाइपोक्सिया और अनॉक्सिता: इस प्राथमिक तंत्र के अलावा दो अतिरिक्त पीडीटी जैविक प्रक्रियाओं कम ट्यूमर के विकास के लिए योगदान पैदा की. अंत में, पीडीटी घायल और मरने से ट्यूमर कोशिकाओं को एक स्थानीय प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, पीडीटी के बजाय एक अनूठी विशेषता ट्रिगर. इस प्रणाली पूरक और वृक्ष के समान कोशिकाओं 8 पेश प्रतिजन के सक्रियण शामिल है. इस प्रकार, शर्तों ट्यूमर विशिष्ट प्रतिरक्षा करने के लिए अग्रणी, lymphoid कोशिकाओं के बाद सक्रियण के साथ ट्यूमर प्रतिजनों की प्रस्तुति के लिए बनाई गई हैं.

अब तक, पीडीटी नरम ऊतक ट्यूमर और hyperpl के कई प्रकार के इलाज के लिए इस्तेमाल किया गया हैएशिया की, इस तरह के सुर्य keratosis, बैरेट की घुटकी, endobronchial ट्यूमर, मूत्राशय कैंसर, बेसल सेल कार्सिनोमा, और सिर और गर्दन के कैंसर 2 की उपशामक उपचार के रूप में. इलाज केवल थोड़ा साइड इफेक्ट के साथ स्थानीय, बड़े पैमाने नेक्रोसिस उत्पन्न करने के लिए जाना जाता है, और इस प्रकार चुनिंदा ट्यूमर ऊतक उन्मूलन करने की क्षमता है. इन फायदों के बावजूद, पीडीटी के आवेदन chemotherapeutic दवाओं के प्रशासन से तकनीकी रूप से अधिक की मांग बनी हुई है. अधिक से अधिक प्रभावकारिता, पी एस एकाग्रता, प्रकाश जोखिम समय और कुल प्रकाश ऊर्जा हस्तांतरण प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. इस vivo प्रयोगों में किया जा सकता है, लेकिन, क्योंकि अनुकूलित करने की आवश्यकता है कि मापदंडों के रिश्तेदार बड़ी संख्या में, यह शुरू में इन विट्रो में इष्टतम स्थितियों का निर्धारण करने के लिए और अधिक कुशल है.

नीचे वर्णित प्रयोगों में, हम पी एस 5,10,15,20-tetrakis (मेटा hydroxyphenyl) सीएचएल का उपयोग पीडीटी के इन विट्रो प्रभावकारिता का परीक्षण कियाOrin, mTHPC (चित्रा 1 ए) में संक्षिप्त. mTHPC वर्तमान में सिर और गर्दन के कैंसर के उपशामक उपचार के लिए क्लिनिक में प्रयोग किया जाता है जो औषधीय उत्पाद Foscan, में सक्रिय पदार्थ है. यह कम मात्रा में पहले से ही बड़े पैमाने पर सेल नुकसान उत्प्रेरण, सबसे शक्तिशाली पुनश्च में से एक है, और यह ऊतक प्रवेश 9, 10 के मामले में अन्य पुनश्च से बेहतर प्रदर्शन किया था. इसके प्रकाश अवशोषण स्पेक्ट्रम (चित्रा 1 बी) क्रमशः पुनश्च जमते के ऊतक स्थानीयकरण के लिए और पीडीटी शामिल होने के लिए उपयोग किया जाता है जो दो प्रमुख चोटियों, 417 एनएम पर एक और 652 एनएम पर एक दूसरा, को दिखाती है.

वर्तमान में, mTHPC के लिए एक लिपोसोमल सूत्रीकरण विकास के अंतर्गत है. यहाँ, हम इस लिपोसोमल निर्माण के तेज यों, और दो मानव ओएस सेल लाइनों में पीडीटी प्रदर्शन करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन; कम metastatic अस्पताल और उच्च metastatic 143B कोशिकाओं. यहाँ प्रस्तुत आंकड़ों से कुछ 11 पहले सूचित किया गया है. गुयहाँ वर्णित ई दृष्टिकोण पीडीटी प्रभावकारिता पर एक metastatic phenotype के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सक्षम बनाता है. Orthotopically प्रतिरक्षा कमी SCID चूहों के हिंद अंग में इंजेक्शन 143B कोशिकाओं, intratibial metastasizing प्राथमिक ट्यूमर, निकट मानव metastasizing रोग नकल उतार एक मॉडल का कारण. इस प्रकार, प्रस्तावित इन विट्रो प्रयोगों इष्टतम पीडीटी सेटिंग्स बाद में विवो प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा करने के लिए मूल्यांकन करने के लिए पूरी तरह उपयुक्त हैं.

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Protocol

1. संबंधित कम में mTHPC के तेज और अत्यधिक metastatic अस्पताल और 143B ओएस सेल लाइनों की तुलना

  1. DMEM, हाम F12, और एक अनुपात 4.5:4.5:1 में गर्मी निष्क्रिय भ्रूण बछड़ा सीरम युक्त सेल संस्कृति के माध्यम से तैयार करें.
    नोट: पी एस mTHPC की लिपोसोमल निर्माण 1.5 मिलीग्राम / एमएल mTHPC की एक अंतिम एकाग्रता में पानी में भंग कर दिया गया.
  2. प्लेट 0.2 x 10 6 अस्पताल और 143B कोशिकाओं / अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह प्लेटें (प्रत्येक शर्त के लिए triplicates) में और कोशिकाओं रातोंरात पालन करते हैं.
    नोट: संख्या व्यक्तिगत सेल लाइनों के लिए समायोजित किया जाना है. 80-90% की एक confluency प्रयोग के समय में सबसे अधिक उपयुक्त है.
  3. अगले दिन पर, अलग अलग समय अवधि (समय निर्भर तेज) के लिए mTHPC की एक निश्चित एकाग्रता के साथ कोशिकाओं को सेते हैं, या एक निश्चित समय अवधि (खुराक निर्भर तेज) के दौरान mTHPC की सांद्रता में वृद्धि के साथ.
  4. विशिष्ट समय पी के लिए mTHPC साथ कोशिकाओं को सेतेoints या mTHPC की सांद्रता.
    नोट: इस अध्ययन में, अस्पताल और 143B सेल लाइनों दोनों के लिए 0.6 माइक्रोग्राम / एमएल mTHPC साथ incubated रहे थे 0, 2.5, 5, या 10 घंटे, या 5 घंटे के लिए 0, 0.6, 2.5, और 10 माइक्रोग्राम / एमएल mTHPC साथ. लागू समय अवधि और dosages प्रयोग किया जाता है कि सेल लाइन के आधार पर भिन्न हो सकते हैं.
  5. हमेशा की कोशिकाओं के प्रत्यक्ष प्रकाश जोखिम को रोकने के लिए अंधेरे में या मंद प्रकाश स्थितियों में काम करने के लिए याद रखें.
  6. संकेत शर्तों पर कोशिकाओं के ऊष्मायन के बाद, मध्यम aspirate और पीबीएस के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं. अगला, 0.5 मिलीग्राम / trypsin EDTA के साथ कोशिकाओं को अलग और कोशिकाओं गिनती.
  7. सेना की टुकड़ी के बाद, 5 मिनट के लिए 400 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र मध्यम aspirate और 200,000 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम घनत्व पीबीएस में कोशिकाओं resuspend.
  8. प्राप्त सेल निलंबन की पिपेट 100 μl एक 96 अच्छी तरह से थाली में और एक प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में इन कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति उपाय (यानी 20,000 कोशिकाओं). सेटिंगmTHPC प्रतिदीप्ति माप के लिए कर रहे हैं: उत्सर्जन के लिए उत्तेजना और 652 एनएम के लिए 417 एनएम.
  9. , सेल प्रति भाँति mTHPC की राशि की गणना के रूप में निम्नानुसार सेल नंबर और सेल की मात्रा के लिए रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाई (RFU) मानक के अनुसार करने के क्रम में:
  10. 0-4 ग्राम / एमएल (प्रयोग तीन प्रतियों माप) से पीबीएस में mTHPC के विभिन्न सांद्रता का उपयोग एक मानक वक्र तैयार करें. एक 96 अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक कमजोर पड़ने के 100 μl पिपेट और कदम 1.6 के तहत वर्णित सेटिंग्स का उपयोग कुओं की प्रतिदीप्ति उपाय.
  11. कुएं में (माइक्रोग्राम / एमएल) में mTHPC की एकाग्रता देता है जो mTHPC, रैखिक मानक वक्र की ढलान से (20,000 कोशिकाओं के लिए प्राप्त) RFU फूट डालो.
  12. (सेल निलंबन के 100 μl का प्रतिनिधित्व ग्राम में,) एक कुएं में mTHPC की कुल राशि पाने के लिए और 20,000 कोशिकाओं की मात्रा द्वारा इस मूल्य को विभाजित करने के लिए 10 से इस mTHPC एकाग्रता फूट डालो.
  13. एक्स (4/3 एक्स π): एक क्षेत्र के लिए फार्मूले के साथ मात्रा की गणनाआर 3. एक खुर्दबीन के नीचे 20 trypsinized कोशिकाओं के व्यास को मापने, और 2 से इस मूल्य विभाजित करके त्रिज्या आर प्राप्त करते हैं.
  14. अंत में, 10 ऊष्मायन (खुराक निर्भर तेज) के मानव संसाधन या 100% करने के लिए सेट किया गया है, जो 10 माइक्रोग्राम / एमएल mTHPC (समय निर्भर तेज), के साथ इलाज के बाद अस्पताल कोशिकाओं के लिए प्राप्त करने के लिए उन सभी मूल्यों मानक के अनुसार.

2. पुनश्च इन विट्रो में phototoxicity का मापन

  1. एक 96 अच्छी तरह से थाली (mTHPC की प्रत्येक एकाग्रता के लिए triplicates प्रयुक्त) में 3,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से बीज और उन्हें रातोंरात पालन करते हैं. इसी प्रकार एक अतिरिक्त 96 अच्छी तरह से थाली तैयार करने और नीचे वर्णित के रूप में कोशिकाओं का इलाज है, लेकिन फिर चरण विपरीत इमेजिंग के लिए एक तरफ रख दिया.
    नोट: संख्या प्रत्येक व्यक्ति के सेल लाइन के लिए समायोजित किया जाना है. प्रयोग के समय में 50-60% की एक confluency आदर्श है.
    1. MTHPC सांद्रता में से प्रत्येक के लिए कक्षों की इसी अंधेरे विषाक्तता नियंत्रण जोड़ने के लिए ध्यान रखें.एसई mTHPC के चयनित सांद्रता के अभाव या उपस्थिति में incubated किया जाएगा कि कोशिकाओं रहे हैं, लेकिन प्रबुद्ध नहीं किया जाएगा.
  2. अगले दिन पर, सेल लाइनों के आधार पर mTHPC (0, 0.0001, 0.001, 0.01, 0.03, 0.075, 0.15, 0.3, 0.6, 1.25, 2.5, 5, और 10 माइक्रोग्राम / एमएल) के विभिन्न सांद्रता के साथ कोशिकाओं को सेते हैं और 5 घंटे के लिए अंधेरे में रखने के लिए उन्हें.
    1. धारा 1.3.2 का संदर्भ लें
      नोट: ऊष्मायन समय रोशनी सेल लाइन पर और इस्तेमाल पुनश्च पर निर्भर करता है से पहले, इसलिए यह अलग प्रयोगों में अलग सांद्रता और अलग अलग समय बिंदुओं का परीक्षण करने की सलाह दी जाती है.
  3. संकेत समय अवधि के लिए ऊष्मायन के बाद, पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धोने और mTHPC बिना नए ताजा मध्यम जोड़ें.
  4. MTHPC अवशोषण स्पेक्ट्रम के लिए विशिष्ट एक 652 एनएम लेजर डायोड, (चित्रा 1 देखें) के साथ कोशिकाओं को स्पष्ट करना.
    1. 13.5 सेमी DISTA की ऊंचाई पर 21.88 मेगावाट / 2 सेमी सत्ता में लेजर सेट5 जम्मू / 2 सेमी की एक ऊर्जा खुराक पाने के लिए कोशिकाओं से nce,. 230 सेकंड के लिए कोशिकाओं को उजागर करना. (साथ और mTHPC) के बिना अंधेरे विषाक्तता नियंत्रण कक्षों रोशन न करें.
      नोट: हमेशा पुनश्च की उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया लेजर प्रकाश से आंखों की रक्षा के लिए चश्मा पहनते हैं.
  5. रोशनी के बाद 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में कोशिकाओं रहते हैं. बाद में, पानी में घुलनशील tetrazolium (WST -1) अभिकर्मक (मध्यम से 10 μl/100 μl) जोड़ें.
  6. तीन घंटे WST-1 अभिकर्मक के बाद इसके अलावा, 415 एनएम पर 96 अच्छी तरह से थाली के व्यक्तिगत कुओं की absorbance के उपाय.
  7. जीवित कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना करने के लिए, (यानी mTHPC बिना, mTHPC और nonilluminated बिना, प्रबुद्ध) 100% तक हर हालत के लिए गैर mTHPC इलाज कोशिकाओं के लिए प्राप्त मूल्यों का मतलब सेट.

3. सेल गिनती से सेल नंबर का आकलन

  1. बीज 20,000 कोशिकाओं / हम24 अच्छी तरह से थाली में करूँगा और उन्हें रातोंरात पालन करते हैं.
  2. MTHPC साथ 5 घंटा (0.001, 0.003, 0.15, 0.6, और 1.25 ग्राम / एमएल) के लिए कोशिकाओं को सेते हैं और ऊपर वर्णित के रूप में उन्हें रोशन.
  3. मध्यम लीजिए, 5 मिनट के लिए 400 XG पर centrifugation द्वारा, पीबीएस के साथ कोशिकाओं को एक बार धोने उन्हें trypsinize और उन्हें इकट्ठा.
  4. Centrifugation के बाद, मध्यम aspirate और ताजा माध्यम से 200 μl में कोशिकाओं resuspend.
  5. एक Neubauer कक्ष में कक्षों की गणना.

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Representative Results

यहां बताया तकनीक के साथ, हम मानव ओएस कोशिकाओं में mTHPC आधारित पीडीटी जांच की. सबसे पहले, mTHPC का समय और खुराक निर्भर तेज कम metastatic अस्पताल में और अत्यधिक metastatic 143B ओएस सेल लाइनों में जांच की गई. mTHPC तेज एक प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोफोटोमीटर साथ mTHPC की प्रतिदीप्ति (Reidy एट अल. 11 से अनुमति के साथ reproduced चित्रा 2) को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. चित्रा 2A एक समय पर निर्भर ढंग से mTHPC के तेज दिखाता है. सेल निलंबन की प्रतिदीप्ति तीव्रता. चित्रा 2B 5 घंटा ऊष्मायन के बाद अस्पताल और 143B कोशिकाओं में खुराक निर्भर mTHPC तेज दिखाता mTHPC के intracellular स्तर का प्रतिनिधित्व करता है. उच्च metastatic सेल लाइन 143B में तेज कम metastatic पैतृक अस्पताल सेल लाइन की तुलना में अधिक हो जाती थी.

डार्क और 143B कोशिकाओं में mTHPC की phototoxicity सेल Metaboli निर्धारण द्वारा मूल्यांकन किया गया था(एक WST-1 परख के साथ) और mTHPC, 230 सेकंड और अंधेरे में 24 घंटे के लिए आगे ऊष्मायन के लिए लेजर प्रकाश के साथ अंधेरे या उपचार में बाद में ऊष्मायन के साथ ऊष्मायन के 5 घंटे के बाद अवशिष्ट कोशिकाओं की संख्या की गणना के द्वारा सी गतिविधि.

खुराक निर्भर अंधेरे विषाक्तता (Reidy एट अल. 11 से अनुमति के साथ reproduced) 3 चित्र में दिखाया गया है. चित्रा 3 में, 143B कोशिकाओं अलग mTHPC dosages के साथ और इलाज कोशिकाओं की तुलना में थे. सेल नंबर और चयापचय गतिविधि की एक खुराक पर निर्भर कमी मनाया गया. में कमी सेल व्यवहार्यता बराबर और 2.5 ग्राम / मिलीलीटर से अधिक एक mTHPC एकाग्रता में मान्यता दी गई थी. MTHPC की खुराक निर्भर phototoxicity 3B चित्रा में सचित्र है. कोशिकाओं को अलग mTHPC खुराक के साथ और बाद में रोशनी (5 जम्मू / 2 सेमी) के साथ इलाज किया गया. सेल परमाणु में कमी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से, (WST परख से मापा) सेल चयापचय क्रिया में एक परिणामी कमीmber मनाया गया. पीडीटी लगाने के बाद सेल संख्या में जिसके परिणामस्वरूप कमी चित्रा 4 में कल्पना है.

चित्रा 1
चित्रा 1. MTHPC (ए) की रासायनिक संरचना और प्रकाश अवशोषण स्पेक्ट्रम (बी). आंकड़े BIOLITEC रिसर्च GmbH द्वारा प्रदान किया गया. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. मानव ओएस सेल लाइनों अस्पताल और 143B द्वारा mTHPC का समय और खुराक निर्भर तेज. (ए). अस्पताल (जीआरई में वाई) और 143B (ब्लैक में) (0.2 x 20 6 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) 6 अच्छी तरह प्लेटें में वरीयता प्राप्त थे. रात भर संवर्धन के बाद, कोशिकाओं 0, 2.5, 5, 7.5, और 10 घंटे (ए) के लिए 0.6 माइक्रोग्राम / एमएल mTHPC साथ incubated, या कर रहे थे के साथ 5 घंटे के लिए 0, 0.6, 2.5, और 10 माइक्रोग्राम / एमएल mTHPC (बी) . प्रतिदीप्ति तीव्रता 417 एनएम उत्तेजना पर 652 एनएम पर 20,000 कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति मापने के द्वारा निर्धारित किया गया था. मान की गणना सेल मात्रा और 10 घंटा (ए) में या 10 माइक्रोग्राम / एमएल (बी) के साथ ऊष्मायन के बाद अस्पताल कोशिकाओं की mTHPC तेज करने के लिए सामान्यीकृत थे 100% करने के लिए स्थापित किया गया था. मान तीन स्वतंत्र प्रयोगों के SEM मतलब ± हैं. Reidy एट अल. 11 से अनुकूलित इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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चित्रा 3. डार्क और 143B कोशिकाओं में mTHPC की phototoxicity. प्रकोष्ठों रात भर उपचार से पहले वरीयता प्राप्त और बड़े हो रहे थे. MTHPC खुराक निर्भर अंधेरे विषाक्तता का निर्धारण करने के लिए, 143B कोशिकाओं संकेत mTHPC सांद्रता (ए) की अनुपस्थिति या उपस्थिति में अंधेरे में 5 घंटे के लिए incubated रहे थे. MTHPC खुराक निर्भर फोटो विषाक्तता का निर्धारण करने के लिए, 143B कोशिकाओं संकेत सांद्रता में 5 घंटे के लिए के साथ या mTHPC बिना incubated और फिर 230 सेकंड के लिए 21.88 मेगावाट / 2 सेमी की एक शक्ति के साथ 5 जम्मू / 2 सेमी के साथ प्रकाशित किया गया (बी). WST-1 परख के साथ चयापचय गतिविधि (●) की माप के लिए, 143B कोशिकाओं 3,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से एक घनत्व में 96 अच्छी तरह प्लेटें में वरीयता प्राप्त थे. सेल नंबर (○) 24 अच्छी तरह प्लेटें में अच्छी तरह से 20,000 कोशिकाओं / पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं से गिना रहे थे. मान तीन स्वतंत्र प्रयोगों के SEM मतलब ± हैं. अनुकूलित frओम Reidy एट अल. 11 इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. पीडीटी. कोशिकाओं से पहले और बाद 143B कोशिकाओं के चरण विपरीत छवियों वरीयता प्राप्त थे और प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में रातोंरात पालन करने के लिए छोड़ दिया है. खुराक निर्भर कल्पना, mTHPC प्रकाश विषाक्तता मध्यस्थता, 143B कोशिकाओं, 0 के साथ अंधेरे में 5 घंटे के लिए 0.6, 2.5 incubated रहे थे, और 10 माइक्रोग्राम / एमएल mTHPC (पैनल ई., क्रमशः). कोशिकाओं तो 230 सेकंड के लिए 652 एनएम तरंगदैर्ध्य के 5 जम्मू / 2 सेमी प्रकाश के साथ प्रबुद्ध, और 24 घंटे के बाद फोटो खींच रहे थे. स्केल बार:. 100 माइक्रोन Plइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें आराम.

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Discussion

पीडीटी के जवाब में इष्टतम cytotoxicity प्राप्त करने के लिए, यह सही लेजर प्रकाश सेटिंग्स और ऊष्मायन बार चुनने के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ वर्णित प्रक्रियाओं पुनश्च तेज निर्धारित करने के लिए और इन विट्रो में पीडीटी प्रेरित cytotoxicity यों के लिए लगातार और कुशल हैं. पुनश्च mTHPC की विशिष्ट अवशोषण तरंग दैर्ध्य का उपयोग करना, सेलुलर पुनश्च तेज एक सीधे तरीके से निर्धारित किया जा सकता है, और पी एस साइटोटोक्सिक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों उत्पन्न करने के लिए सक्रिय किया जा सकता है.

इस में इन विट्रो स्थापना का उपयोग कर, जैसे पुनश्च एकाग्रता, दवा प्रकाश अंतराल और लेजर प्रकाश की तीव्रता के रूप में सभी मापदंडों आसानी पी एस की विशेषताओं को समायोजित किया जा सकता है और सेल लाइनों का इस्तेमाल किया. सेल गिनती एक साथ WST-1 परख (चयापचय गतिविधि की निगरानी) के साथ सेल अस्तित्व के लिए एक अच्छा अनुमान देता है, जो जीवित जुड़ी कोशिकाओं के बाहर एक प्रत्यक्ष पढ़ने देता है. हालांकि, प्रस्तुत विधि केवल सेल विषाक्तता यानी, "पहली हिट" मॉडल कर सकते हैंतुरंत पी एस की सक्रियता के बाद से प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों. में विवो बाद वाहिकासंकीर्णन और पूर्ण ट्यूमर उन्मूलन के लिए आवश्यक प्रतिरक्षा प्रणाली के सक्रियण मनाया, केवल जानवरों में जांच की जा सकती है.

चित्रा 2 अपने पैतृक कम metastatic अस्पताल सेल लाइन में से अत्यधिक metastatic 143B में एक उच्च स्तर तक mTHPC का एक समय और खुराक निर्भर तेज का प्रदर्शन किया. 143B ओएस कोशिकाओं में mTHPC की डार्क विषाक्तता केवल उच्च सांद्रता में 5 घंटे के लिए ऊष्मायन (चित्रा 3) के बाद मनाया गया. 143B कोशिकाओं एक mTHPC द्वारा दिखाया पीडीटी के लिए उच्च संवेदनशीलता, और प्रकाश खुराक निर्भर phototoxic प्रभाव दिखाते हैं. एक phototoxic प्रभाव 0.075 ग्राम / एमएल के रूप में कम एक mTHPC एकाग्रता पर पहले से ही मनाया गया, और 0.022 ± 0.006 ग्राम / एमएल के एक आधा अधिक से अधिक घातक एकाग्रता (चित्रा 3) मनाया गया.

पीडीटी कई ट्यूमर के प्रकार के खिलाफ, कम आक्रामक और कुशल हैरोगियों में तकनीक (जैसे. सूजन, पर्विल) लागू करते समय है, मामूली दुष्प्रभाव हो सकता है. इस पुनश्च केवल इन कोशिकाओं में भी पीडीटी के बाद विषाक्तता के कारण, nontumor कोशिकाओं द्वारा यहां दिखाया गया है, ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा उठाया, लेकिन यह भी नहीं है कि इंगित करता है. Triesscheijn एट अल. मानव fibroblasts की तुलना में ट्यूमर कोशिकाओं का एक बढ़ा photosensitivity दिखाने में सक्षम था. इसके विपरीत, मानव microvascular endothelial कोशिकाओं एक उच्च photosensitivity 12 जिसके चलते अन्य परीक्षण किया सेल लाइनों, से mTHPC के एक उच्च तेज दिखाया. इन निष्कर्षों को भी अक्सर 2 मनाया जाता है जो पीडीटी जुड़े विरोधी संवहनी प्रभाव, साथ सहसंबंधी.

वर्णित विधि भी अन्य पुनश्च के लिए लागू किया जा सकता है. ऊष्मायन समय और लेजर प्रकाश तीव्रता पी एस की विशेषताओं को अनुकूलित किया जाना चाहिए. इसके अतिरिक्त, पीडीटी भी केवल सेटिंग्स पद्धति को ही सेल लाइन पर निर्भर है, लेकिन नहीं कर रहे हैं के बाद से, ओएस कोशिकाओं के अलावा अन्य में प्रेरित किया जा सकता है. के रूप में अतिरिक्त READ बहिष्कार, कोशिका मृत्यु तंत्र जैसे, विश्लेषण किया जा सकता है. apoptosis, गल जाना या भोजी में शामिल प्रोटीन के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण करके. इसके अलावा पी एस के subcellular स्थानीयकरण लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग द्वारा जैसे देखे जा सकते हैं.

इन विट्रो, लेजर प्रकाश के साथ पी एस और पीडीटी के शामिल होने के साथ कोशिकाओं की यानी ऊष्मायन, में पीडीटी के लिए वर्णित किया गया है कि विभिन्न चरणों का बारीकी से नैदानिक ​​स्थिति के समान है. रोगियों (चतुर्थ या अनुसूचित जाति. लागू) पी एस, और एक अलग दवा प्रकाश अंतराल के बाद, ब्याज (जैसे. ट्यूमर के ऊतक) के क्षेत्र लेजर प्रकाश 13 के साथ प्रकाशित किया जाता है प्राप्त करते हैं. अभी तक ओएस में लागू नहीं है, इसके संभावित लाभ स्पष्ट कर रहे हैं, पीडीटी अक्सर प्राथमिक ट्यूमर के मुख्य रिम के करीब प्राथमिक ट्यूमर सेल समूहों के रूप में विकसित जो ट्यूमर उपग्रहों के intraoperative उपचार के लिए विशेष रूप से आकर्षक माना जाता है और एक पुनरावृत्ति आरंभ हो सकता है एस के दौरान याद किया जबप्राथमिक ट्यूमर के urgical लकीर. यहां तक ​​कि बड़े हड्डीवाला ट्यूमर इस तकनीक से इलाज किया जा सकता है. यह कुत्तों के 14 में एक आशाजनक अध्ययन से दिखाया गया है. इसके अलावा, सर्जरी द्वारा resected नहीं किया जा सकता है कि ट्यूमर कोशिकाओं के उन्मूलन (जैसे कई मेटास्टेसिस ज्यादातर फेफड़ों में होने वाली), भी ओएस metastatic रोग के साथ रोगियों में पीडीटी के संभावित भविष्य के आवेदन का प्रतिनिधित्व कर सकते.

यह प्रयोगों प्रदर्शन करते हुए, देखभाल सामान्य दिन के उजाले में भी mTHPC सक्रिय करने के लिए आवश्यक तरंगदैर्ध्य शामिल सभी के रूप में काम कर कदम, कोशिकाओं के निजी सचिव जोड़ने के बाद कम से कम प्रकाश जोखिम के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं कि लिया जाना चाहिए, कि नोट करना महत्वपूर्ण है. इसी तरह, preclinical मॉडल में vivo में आवेदन के लिए, देखभाल mTHPC इंजेक्शन लगाने के बाद प्रत्यक्ष प्रकाश से जानवरों को ढाल लिया जाना चाहिए. यह भी WST-1 परख केवल कोशिका मृत्यु का एक अप्रत्यक्ष सूचक है, जो ट्यूमर कोशिकाओं के चयापचय क्रिया, का आकलन है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. इसलिए, एक कुल सेल गिनती के साथ एक संयोजन, यहाँ प्रस्तुत है, के रूप में सिफारिश की है.

अंत में, वर्णित विधि (पुनश्च तेज और पीडीटी प्रेरित सेल विषाक्तता) के संयोजन में इन विट्रो में एक पी एस की विषाक्तता गुण विशेषताएँ एक तेजी से और लागत प्रभावी प्रक्रिया प्रदान करता है. इन में इन विट्रो परिणामों के साथ, इष्टतम प्रकाश की तीव्रता और दवा प्रकाश अंतराल की रेंज पीडीटी विवो में लागू किया जा सकता है की एक अच्छा संकेत देता है, जो अनुमान लगाया जा सकता है.

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों या हित के संघर्ष की घोषणा.

Acknowledgments

लेखकों कृपया उनकी मदद और तकनीकी विशेषज्ञता के लिए Susanna GRAFE और Arno Wiehe के लिए विशेष धन्यवाद के साथ, लिपोसोमल mTHPC तैयार करने के साथ हमें प्रदान करने के लिए BIOLITEC रिसर्च जीएमबीएच (जेना, जर्मनी) को धन्यवाद देना चाहूंगा. हम भी परिणाम का एक बड़ा हिस्सा उत्पन्न होता है और इसके प्रकाशन के लिए 11 coresponsible था जो Kerstin Reidy, धन्यवाद देना चाहूंगा.

इस काम Schweizerischer Verein Balgrist, ज्यूरिख विश्वविद्यालय, Krebsliga ज्यूरिख के साथ ही वाल्टर एल और जोहन्ना भेड़िया फाउंडेशन, ज्यूरिख, स्विट्जरलैंड से अनुदान और EuroNanoMed काल नेट / एसएनएफ स्विस से अनुदान द्वारा समर्थित द्वारा अनुदान से किया गया था राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन 31NM30-131004/1. यह काम भी HSM Kanton ज्यूरिख के musculoskeletal कैंसर विज्ञान के लिए (अति विशिष्ट चिकित्सा) कार्यक्रम के द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM PAA GmbH, Freiburg, Germany E15-883
HAM F12 PAA GmbH, Freiburg, Germany E15-817
Heat-inactivated fetal calf serum GIBCO, Basel, Switzerland 10500-064
mTHPC biolitec Research GmbH, Jena, Germany As this liposomal formulation is originating from R&D
no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5 mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; >99% purity)
Spectramax Gemini XS plate reader Molecular Devices, Sunnyvale, CA ID# 861
Microscope Zeiss Observer.Z1 Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany
Ceralas PDT 652 nm Laser biolitec AG, Jena, Germany LD652nm2W400u
Water-soluble tetrazolium (WST) reagent Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland 1644807

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References

  1. Juarranz, A., Jaen, P., Sanz-Rodriguez, F., Cuevas, J., Gonzalez, S. Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications. Clin. Transl. Oncol. 10, 148-154 (2008).
  2. Agostinis, P., et al. Photodynamic therapy of cancer: an update. CA Cancer. 61, 250-281 (2011).
  3. D'Adamo, D. R. Appraising the current role of chemotherapy for the treatment of sarcoma. Semin. Oncol. 38 Suppl 3, 19-29 (2011).
  4. Allison, D. C., et al. A meta-analysis of osteosarcoma outcomes in the modern medical era. Sarcoma. , (2012).
  5. Anninga, J. K., et al. Chemotherapeutic adjuvant treatment for osteosarcoma: where do we stand. Eur. J. Cancer. 47, 2431-2445 (2011).
  6. Bacci, G., et al. Pattern of relapse in patients with osteosarcoma of the extremities treated with neoadjuvant chemotherapy. Eur. J. Cancer. 37, 32-38 (2001).
  7. Briccoli, A., et al. Resection of recurrent pulmonary metastases in patients with osteosarcoma. Cancer. 104, 1721-1725 (2005).
  8. Milla Sanabria, L., et al. Direct and indirect photodynamic therapy effects on the cellular and molecular components of the tumor microenvironment. Biochim. Biophys. Acta. 1835, 36-45 (2013).
  9. Mitra, S., Foster, T. H. Photophysical parameters, photosensitizer retention and tissue optical properties completely account for the higher photodynamic efficacy of meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin vs Photofrin. Photochem. Photobiol. 81, 849-859 (2005).
  10. Ma, L., Moan, J., Berg, K. Evaluation of a new photosensitizer, meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a comparison of its photobiological properties with those of two other photosensitizers. Int. J. Cancer. 57, 883-888 (1994).
  11. Reidy, K., Campanile, C., Muff, R., Born, W., Fuchs, B. mTHPC-mediated photodynamic therapy is effective in the metastatic human 143B osteosarcoma cells. Photochem. Photobiol. 88, 721-727 (2012).
  12. Triesscheijn, M., Ruevekamp, M., Aalders, M., Baas, P., Stewart, F. A. Comparative sensitivity of microvascular endothelial cells, fibroblasts and tumor cells after in vitro photodynamic therapy with meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin. Photochem. Photobiol. 80, 236-241 (2004).
  13. Triesscheijn, M., Baas, P., Schellens, J. H., Stewart, F. A. Photodynamic therapy in oncology. Oncologist. 11, 1034-1044 (2006).
  14. Burch, S., et al. Treatment of canine osseous tumors with photodynamic therapy: a pilot study. Clin. Orthop. Relat. Res. 467, 1028-1034 (2009).

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चिकित्सा अंक 85 Photodynamic थेरेपी (पीडीटी) 5,10,15,20-tetrakis (मेटा hydroxyphenyl) chlorin (mTHPC) phototoxicity काले विषाक्तता osteosarcoma (ओएस) photosensitizer
ऑस्टियो सार्कोमा कोशिकाओं में Photodynamic थेरेपी के साइटोटोक्सिक प्रभावकारिता<em&gt; इन विट्रो</em
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Meier, D., Campanile, C., Botter, S. … More

Meier, D., Campanile, C., Botter, S. M., Born, W., Fuchs, B. Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (85), e51213, doi:10.3791/51213 (2014).

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