Summary
Det protokoll som rapporteras här tillåter en utvärdering av effektiviteten av fotodynamisk terapi (PDT) i cellinjer och en optimering av de PDT-inställningar innan applicering av terapi i djurmodeller.
Abstract
Under senare år har det varit svårt att finna mer effektiva terapier mot cancer med mindre systemiska biverkningar. Därför Fotodynamisk terapi är en ny metod för en mer tumör selektiv behandling.
Fotodynamisk terapi (PDT) som använder sig av en icke-toxisk fotosensibiliserare (PS), vilken vid aktivering med ljus av en specifik våglängd i närvaro av syre, genererar syreradikaler som framkallar en cytotoxisk respons 1. Trots sitt godkännande nästan tjugo år sedan av FDA, är PDT numera endast används för att behandla ett begränsat antal cancertyper (hud, urinblåsa) och nononcological sjukdomar (psoriasis, aktinisk keratos) 2.
Den stora fördelen med användningen av PDT är förmågan att utföra en lokal behandling, vilket förhindrar systemiska biverkningar. Dessutom tillåter den behandling av tumörer vid känsliga platser (t.ex. runt nerver eller blodkärl). Här en intraoperative tillämpning av PDT anses i osteosarkom (OS), en tumör i benet, för att rikta primära tumörsatelliter kvar i tumör omgivande vävnad efter kirurgisk tumörresektion. Behandlingen syftar till att minska antalet återfall och till att minska risken för (postoperativt) metastaser.
I den aktuella studien, presenterar vi in vitro PDT förfaranden för att fastställa den optimala PDT inställningarna för effektiv behandling av vanligt förekommande OS cellinjer som används för att återge den mänskliga sjukdomen i väletablerade intratibial modeller OS mus. Upptaget av PS mTHPC undersöktes med en spektrofotometer och fototoxicitet provocerades med laserljus excitation av mTHPC vid 652 nm för att framkalla celldöd bedömas med en WST-1-analys och genom räkning av överlevande celler. De etablerade tekniker gör det möjligt för oss att definiera de optimala PDT inställningarna för framtida studier i djurmodeller. De är ett enkelt och snabbt verktyg för utvärdering av effekten av PDT
Introduction
Dagens toppmodern behandling av osteosarkom (OS), en primär ben tumör, omfattar en kombination av neo adjuvant kemoterapi och kirurgi. Denna behandlingsregim visade en ökning av överlevnaden hos patienter med lokaliserad sjukdom från ca 20% före användning av kemoterapi, för närvarande mellan 60-70% 3, 4. Men i de senaste två decennierna har den totala överlevnaden av OS patienter med lokal sjukdom plateaued 4, 5. Dessutom, 30-40% av dessa patienter återfaller inom tre år efter diagnos och patienter med metastaserad sjukdom fortsätter att ha en dålig överlevnad på 20-30% 4, 6, 7. För att förbättra resultatet av dessa patienter, nya terapeutiska strategier behöver utvecklas.
Fotodynamisk terapi (PDT), en ganska ny cancerbehandling, använder ljus av en viss våglängd för excitation av en photosensitizer (PS), som ackumuleras i tumörcellerna efter injicering i blodomloppet. Laserljus excitation av PS genererar syreradikaler i närvaro av syre, som inducerar cytotoxiska reaktion i tumörceller och celldöd. Förutom denna primära mekanism, framkallade ytterligare två PDT biologiska processer bidrar till minskad tumörtillväxt: PDT orsakar kärlsammandragning och blodproppsbildning av tumören mikrocirkulation och därmed lokal hypoxi och syrebrist inne i tumören, vilket leder till tumör infarkt. Slutligen skadade PDT och döende tumörceller utlösa ett lokalt immunsvar, en ganska unik egenskap hos PDT. Detta involverar komplementsystemet och aktiveringen av antigenpresenterande dendritiska celler 8. Därmed skapas förutsättningar för att presentera tumörantigener med efterföljande aktivering av lymfoida celler, vilket leder till tumörspecifik immunitet.
Hittills har PDT använts för att behandla flera typer av mjukdelstumörer och hyperplAsiens, såsom aktinisk keratos, Barretts esofagus, endobronkiala tumörer, cancer i urinblåsan, basaliom, och palliativ behandling av huvud-halscancer 2. Den behandling är känd för att inducera lokal, storskalig nekros med endast lite biverkningar, och har sålunda potential att selektivt utrota tumörvävnad. Trots dessa fördelar, förblir tillämpningen av PDT tekniskt mer krävande än administrering av kemoterapeutiska läkemedel. För att uppnå maximal effekt, PS-koncentrationen, ljusexponering och total överföring av ljusenergi behöver optimeras. Detta kan göras i in vivo experiment, men, på grund av det relativa stora antalet parametrar som måste optimeras, är det mer effektivt för att initialt bestämma optimala betingelser in vitro.
I de experiment som beskrivs nedan, testade vi effekten av PDT in vitro med användning av PS 5,10,15,20-tetrakis (meta-hydroxifenyl) chlellervid, förkortat mTHPC (Figur 1A). mTHPC är den aktiva substansen i läkemedlet Foscan, som idag används i kliniken för palliativ behandling av huvud-halscancer. Det är en av de mest potenta PS, inducera massiv cellskada redan vid låga koncentrationer, och det visade sig vara överlägsen andra PS i termer av vävnadspenetration 9, 10. Dess ljus absorptionsspektrum (Figur 1B) visar två framträdande toppar, en vid 417 nm och en andra vid 652 nm, som används för vävnadslokalisering av ackumulera PS och för PDT induktion, respektive.
För närvarande är en liposomal formulering för mTHPC under utveckling. Här beskriver vi de förfaranden för att kvantifiera upptaget av denna liposomal formulering, och att utföra PDT i två humana OS cellinjer, den låga metastaserad HOS och de höga metastaser 143B-celler. En del av de data som presenteras här har rapporterats tidigare 11. The metod som beskrivs här ger oss möjlighet att studera effekten av en metastatisk fenotyp på PDT effekt. 143B-celler, orthotopically injiceras i bakbenen av immun bristfälliga SCID möss orsakar intratibial metastasizing primära tumörer, en modell noga imitera den mänskliga metastaserande sjukdom. Således, de föreslagna in vitro-försök är perfekt lämpade att bedöma de optimala PDT inställningar för att senare användas i in vivo experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Jämförelse av Upptag av mTHPC i respektive låga och mycket Metastatic HOS och 143B OS cellinjer
- Förbered cellodlingsmedium innehållande DMEM, Hams F12 och värmeinaktiverat fetalt kalvserum i ett förhållande 4.5:4.5:1.
Obs: liposomal formulering av PS mTHPC löstes i vatten vid en slutkoncentration av 1,5 mg / ml mTHPC. - Plansch 0,2 x 10 6 HOS och 143B celler / brunn i 6-brunnsplattor (triplikat för varje betingelse) och låta cellerna vidhäfta över natt.
Anm: Antalet måste anpassas till individuella cellinjer. En konfluens av 80-90% är mest lämplig vid tiden för experimentet. - Följande dag, inkubera cellerna med en fast koncentration av mTHPC för olika tidsperioder (beroende upptag tid), eller med ökande koncentrationer av mTHPC under en bestämd tidsperiod (dosberoende upptag).
- Inkubera cellerna med mTHPC för viss tid points eller koncentrationer av mTHPC.
OBS: I denna studie var båda HOS och 143B cellinjer inkuberas med 0,6 ng / ml mTHPC för 0, 2,5, 5, eller 10 timmar, eller med 0, 0,6, 2,5, och 10 mikrogram / ml mTHPC under 5 timmar. De tillämpade tidsperioder och doser kan variera beroende på cellinjen som används. - Kom ihåg att alltid arbeta i mörker eller i dämpad belysning för att förhindra direkt ljusexponering av cellerna.
- Efter inkubering av cellerna vid de angivna förhållandena, aspirera mediet och tvätta cellerna tre gånger med PBS. Härnäst lösgöra cellerna med 0,5 ml trypsin / EDTA och räkna cellerna.
- Efter lösgörande, centrifugera cellerna vid 400 x g under 5 min, aspirera mediet och återsuspendera cellerna i PBS till en slutlig densitet av 200.000 celler / ml.
- Pipettera 100 | il av den erhållna cellsuspensionen (dvs. 20000 celler) i en 96-brunnsplatta och mäta fluorescensen av dessa celler i en fluorescens-spektrofotometer. Inställningens för mTHPC fluorescensmätningar är: 417 nm för excitation och 652 nm för emission.
- För att beräkna hur mycket internaliserad mTHPC per cell, normalisera den relativa fluorescensenheten (RFU) för antalet celler och cellvolym enligt följande:
- Bered en standardkurva med användning av olika koncentrationer av mTHPC i PBS 0-4 | ig / ml (användning tredubbla mätningar). Pipettera 100 | il av varje spädning i en 96-brunnsplatta och mäta fluorescensen av brunnarna med användning av de inställningar som beskrivs under steg 1,6.
- Dividera RFU (erhölls för 20000 celler) av lutningen hos den linjära standardkurvan av mTHPC, vilket ger koncentrationen av mTHPC (i ^ g / ml) i brunnen.
- Dela detta mTHPC koncentration med 10 för att få den totala mängden mTHPC i en brunn (i mikrogram, vilket motsvarar 100 pl cellsuspension) och dividera detta värde med den volym av 20.000 celler.
- Beräkna volymen med formeln för en sfär: (4/3 x π) xr 3. Erhåll radien r genom att mäta diametern av 20 trypsiniserade celler under ett mikroskop, och dividera detta värde med 2.
- Slutligen, normalisera alla värden som de som uppnås för HOS celler efter 10 timmar av inkubation (dosberoende upptag) eller behandlats med 10 mikrogram / ml mTHPC (tidsberoende upptag), som var satt till 100%.
2. Mätning av fototoxicitet i PS In Vitro
- Seed 3000 celler / brunn i en platta med 96 brunnar (triplikat för varje koncentration av mTHPC används) och låta dem vidhäfta över natt. Likaså förbereder ytterligare 96 brunnar och behandla cellerna som beskrivs nedan, men sedan lägga dem åt sidan för faskontrast avbildning.
Anm: Antalet måste justeras för varje enskild cellinje. En konfluens av 50-60% vid tiden för experimentet är idealiskt.- Tänk på att lägga motsvarande mörka toxicitetskontroll av celler för varje mTHPC koncentrationer. DenSO är celler som kommer att inkuberas i frånvaro eller närvaro av utvalda koncentrationer av mTHPC, men kommer inte att lysa.
- Följande dag, inkubera cellerna med olika koncentrationer av mTHPC (0, 0,0001, 0,001, 0,01, 0,03, 0,075, 0,15, 0,3, 0,6, 1,25, 2,5, 5, och 10 mikrogram / ml) beroende på cellinjer och hålla dem i mörker i 5 timmar.
- Se Avsnitt 1.3.2
Anm: Inkubationstiden innan belysningen beror på den cellinje och den PS som används, därför är det lämpligt att testa olika koncentrationer och olika tidpunkter i separata experiment.
- Se Avsnitt 1.3.2
- Efter inkubation under den angivna tidsperioden, tvätta cellerna två gånger med PBS och lägga till nya färskt medium utan mTHPC.
- Lys av cellerna med en 652 nm diodlaser, som är specifik för mTHPC absorptionsspektrum (se figur 1).
- Ställ lasern till 21,88 mW / cm 2 effekt vid en höjd på 13,5 cm distaiou från cellerna, för att få en energi dos av 5 J / cm 2. Belys cellerna för 230 sek. Inte belysa mörka kontroll toxicitet celler (med och utan mTHPC).
OBS: Använd alltid glasögon för att skydda ögonen från laserljus används för excitation av PS.
- Ställ lasern till 21,88 mW / cm 2 effekt vid en höjd på 13,5 cm distaiou från cellerna, för att få en energi dos av 5 J / cm 2. Belys cellerna för 230 sek. Inte belysa mörka kontroll toxicitet celler (med och utan mTHPC).
- Efter belysning, hålla cellerna i mörker vid 37 ° C i 24 timmar. Därefter tillvattenlösligt tetrazolium (WST-1)-reagens (10 μl/100 pl medium).
- Tre timmar efter tillsatsen av WST-1-reagens, mäts absorbansen för enskilda brunnar i 96-brunnsplatta vid 415 nm.
- För att beräkna andelen överlevande celler, ange medelvärdet av de värden som erhållits för de icke mTHPC behandlade celler för varje tillstånd till 100% (dvs. belysta, utan mTHPC och nonilluminated, utan mTHPC).
3. Uppskattning av cellantal genom cellräkning
- Seed 20.000 celler / vill i en 24-brunnars platta och låta dem vidhäfta över natt.
- Inkubera cellerna i 5 h med mTHPC (0,001, 0,003, 0,15, 0,6 och 1,25 | ig / ml) och som exponerar dem som beskrivits ovan.
- Samla mediet, tvätta cellerna en gång med PBS, trypsinize dem och samla ihop dem genom centrifugering vid 400 xg under 5 min.
- Efter centrifugering, aspirera mediet och återsuspendera cellerna i 200 | il färskt medium.
- Räkna celler i en Neubauer kammare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med de här rapporterade teknikerna undersökte vi mTHPC-baserade PDT i mänskliga OS-celler. Först var den tid och dosberoende upptag av mTHPC undersökts i den låga metastaserad HOS och i de mycket metastaser 143B OS cellinjer. mTHPC upptag kan bedömas genom mätning av fluorescensen av mTHPC med en fluorescensspektrofotometer (Figur 2, som återges med tillstånd från Reidy et al. 11). Figur 2A illustrerar upptagningen av mTHPC på ett tidsberoende sätt. Fluorescensintensiteten av cellsuspensionen representerar de intracellulära nivåerna av mTHPC. Figur 2B illustrerar den dosberoende mTHPC upptag i HOS-och 143B-celler efter 5 timmars inkubering. Upptaget i hög metastatisk cellinje 143B tenderade att vara högre än i låga metastaserad föräldra HOS cellinje.
Mörk och fototoxicitet av mTHPC i 143B-celler bedömdes genom bestämning av cell MetaboliC-aktivitet (med ett WST-1-analys) och genom att räkna antalet kvarvarande celler efter 5 h av inkubation med mTHPC, efterföljande inkubation i mörker eller behandling med laserljus för 230 sek och ytterligare inkubation under 24 h i mörker.
Dosberoende mörk toxicitet visas i Fig. 3 (återgivet med tillstånd av Reidy et al. 11). I figur 3A var 143B-celler behandlade med olika mTHPC doseringar och jämfördes med obehandlade celler. En dosberoende minskning av cellantalet och metabolisk aktivitet observerades. Minskad cellviabiliteten redovisades vid ett mTHPC koncentration som är lika eller högre än 2,5 mikrogram / ml. Dosberoende fototoxiciteten hos mTHPC illustreras i figur 3B. Cellerna behandlades med olika mTHPC doser och med efterföljande belysning (5 J / cm 2). En efterföljande minskning i cell metabolisk aktivitet (mätt med WST-analys), såväl som en minskning i cell number iakttogs. Den resulterande minskningen i cellantal efter applicering PDT visualiseras i fig 4.
Figur 1. Kemisk struktur av mTHPC (A) och ljus-absorptionsspektrum (B). Siffror lämnades av Biolitec Research GmbH. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Tid och dosberoende upptag av mTHPC av de humana OS cellinjer HOS och 143B. (A). HOS (i gre y) och 143B (i svart) ympades i 6-brunnars plattor (0,2 x 20 6 celler / brunn). Efter över natten odling inkuberades cellerna med 0,6 | ig / ml mTHPC för 0, 2,5, 5, 7,5 och 10 h (A), eller efter 5 h med 0, 0,6, 2,5, och 10 | ig / ml mTHPC (B) . Fluorescensintensitet bestämdes genom att mäta fluorescensen av 20000-celler vid 652 nm vid excitering vid 417 nm. Värdena normaliserades till den beräknade cellvolym och mTHPC upptag av HOS-celler vid 10 h (A) eller efter inkubering med 10 | ig / ml (B) ställdes in på 100%. Värdena är medelvärde ± SEM för tre oberoende experiment. Anpassad från Reidy et al. 11 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
les/ftp_upload/51213/51213fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51213/51213fig3.jpg "/>
Figur 3. Mörkt och fototoxicitet av mTHPC i 143B-celler. Cellerna såddes och odlades över natten innan behandlingen. För att bestämma mTHPC dosberoende mörk toxicitet, var 143B-celler inkuberades i 5 timmar i mörker i frånvaro eller närvaro av indikerade mTHPC koncentrationer (A). För att bestämma mTHPC dosberoende fototoxicitet har 143B-celler inkuberades med eller utan mTHPC för 5 timmar vid angivna koncentrationerna och därefter belyses med 5 J / cm 2 med en kraft av 21,88 mW / cm 2 till 230 sek (B). För mätningar av den metaboliska aktiviteten (●) med WST-1-analys gjordes 143B-celler ympades i 96-brunnsplattor vid en densitet av 3000 celler / brunn. Cellantalet (○) räknades från celler ympades vid 20000 celler / brunn i 24-brunnsplattor. Värdena är medelvärde ± SEM för tre oberoende experiment. Anpassad frOM Reidy et al 11. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Fas kontrastbilder av 143B-celler före och efter PDT. Cellerna var seedade och vänster för att hålla sig över en natt som beskrivs i protokollet. Att visualisera dosberoende mTHPC medierad ljus toxicitet var 143B-celler inkuberades under 5 tim i mörker med 0, 0,6, 2,5, och 10 | ig / ml mTHPC (paneler AD, respektive). Cellerna belystes med 5 J / cm 2 ljus av 652 nm våglängd för 230 sekund, och fotograferades efter 24 timmar. Skala bar:. 100 ìm PlEase klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att uppnå optimal cytotoxicitet som svar på PDT, är det viktigt att välja rätt laserljusinställningar och inkubationstider. De här beskrivna förfarandena är konsekvent och effektivt för att bestämma PS upptag och att kvantifiera PDT inducerad cytotoxicitet in vitro. Med hjälp av de specifika absorptions-våglängder av PS mTHPC, kan den cellulära PS upptag bestämmas på ett direkt sätt, och den bärbara telefonen kan aktiveras för att alstra cytotoxiska reaktiva syreradikaler.
Med hjälp av detta in vitro-setup, kan alla parametrar som PS koncentration, drog lätt intervall och laserljusintensitet enkelt anpassas till egenskaperna hos PS och de cellinjer som används. Cellräkning ger en direkt läsning av överlevande vidhäftade celler, som tillsammans med WST-1-analys (övervaka metabolisk aktivitet) ger en god uppskattning av cellöverlevnad. Däremot kan den presenterade metoden endast modellera "första hit", dvs celltoxicitetav reaktiva syreradikaler, omedelbart efter aktivering av den bärbara telefonen. In vivo observerade efterföljande vasokonstriktion och aktivering av immunsystemet, som behövs för full tumör utrotning, endast kan undersökas på djur.
Figur 2 visade en tid och dosberoende upptag av mTHPC till en högre nivå i den mycket metastaser 143B än i sin föräldra låg metastaser HOS cellinje. Mörk toxicitet mTHPC i 143B-OS-celler observerades efter inkubation under 5 h endast vid höga koncentrationer (figur 3). 143B-celler visar en hög känslighet för PDT, visas av mTHPC och ljus dosberoende fototoxisk effekt. En fototoxisk effekt redan observerats vid ett mTHPC koncentration så lite som 0,075 mikrogram / ml, och en halv maximal dödlig koncentration av 0,022 ± 0,006 mikrogram / ml observerades (figur 3).
Trots att PDT är minimalt invasiva och effektivt mot många tumörtyps, kan smärre biverkningar uppträder vid tillämpning av tekniken på patienter (t. ex. svullnad, erytem). Detta tyder på att PS inte bara tas upp av tumörceller, som visas här, men också av nontumor celler, vilket orsakar toxicitet efter PDT även i dessa celler. Triesscheijn et al. Kunde visa en ökad ljuskänslighet av tumörceller jämfört med humana fibroblaster. Däremot humana mikrovaskulära endotelceller uppvisade ett högre upptag av mTHPC än de andra testade cellinjer, vilket ledde till en hög ljuskänslighet 12. Dessa fynd korrelerar också med PDT associerade anti vaskulära effekter, som ofta observerats 2.
De beskrivna metoderna kan även användas för andra PS. Inkubationstiden och laserljusintensitet måste anpassas till egenskaperna hos den bärbara telefonen. Dessutom kan PDT också induceras i annat än OS-celler, eftersom endast de inställningar cellinje beroende men inte själva metoden. Som ytterligare rEAD outs, kan celldödsmekanismer analyseras, t ex. genom Western blot-analys av proteiner involverade i apoptos, nekros eller autophagy. Också den subcellulära lokaliseringen av PS kan visualiseras till exempel genom konfokal laserscanningsmikroskopi.
De olika stegen som beskrivits för PDT in vitro, dvs inkubation av cellerna med PS och induktion av PDT med laserljus, liknar den kliniska situationen. Patienterna får (iv eller sc. Tillämpas) PS, och efter ett distinkt drog lätt intervall, intresseområdet (t ex. Tumörvävnad) belyses med laserljus 13. Även om inte ännu tillämpas i OS, dess potentiella fördelar är uppenbara, PDT anses vara särskilt attraktiv för intraoperativ behandling av tumör satelliter, som ofta växer som primär tumörcellskluster nära den viktigaste kanten av den primära tumören och kan initiera en upprepning när missat under surgical resektion av den primära tumören. Även stora bendefekter tumörer kan behandlas med denna teknik. Detta har visats genom en lovande studie på hundar 14. Dessutom utrota tumörceller som inte kan opererande genom kirurgi (t.ex. multipla metastaser oftast förekommer i lungorna), kan också representera en eventuell framtida tillämpning av PDT hos patienter med OS metastaserad sjukdom.
Det är viktigt att notera att, när de utför experimenten, bör man se till att alla arbetssteg utförs under minimal ljusexponering efter att ha lagt PS till cellerna, som vanligt dagsljus innehåller också våglängden som krävs för att aktivera mTHPC. På samma sätt, för in vivo-applikation i prekliniska modeller, måste man vara noga med att skydda djuren från direkt ljus efter injektion mTHPC. Det måste också noteras att WST-1 assay utvärderar bara den metaboliska aktiviteten hos tumörceller, som är en indirekt indikator på celldöd. Därför, En kombination med ett totalt celltal, som presenteras här, är att rekommendera.
Sammanfattningsvis, kombinationen av de beskrivna metoder (PS upptags och PDT-inducerad celltoxicitet) ger ett snabbt och kostnadseffektivt sätt för att karakterisera toxicitetsegenskaper en PS in vitro. Med dessa in vitro-resultat, kan intervallet för optimal ljusintensitet och läkemedlet ljusintervallet uppskattas, vilket ger en bra indikation på hur PDT kan användas in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen eller intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Biolitec Research GmbH (Jena, Tyskland) för vänligt ger oss den liposomala mTHPC formulering, med särskilt tack till Susanna Gräfe och Arno Wiehe för deras hjälp och teknisk expertis. Vi vill också tacka Kerstin Reidy, som genererade en stor del av resultaten och var coresponsible för dess offentliggörande 11.
Detta arbete har finansierats med bidrag från Schweizerischer Verein Balgrist, universitetet i Zürich, den Krebsliga Zurich samt av ett bidrag från Walter L. och Johanna Wolf Foundation, Zürich, Schweiz och ett bidrag från EuroNanoMed ERA-NET / SNF Swiss National Science Foundation 31NM30-131004/1. Detta arbete stöddes också av HSM (högspecialiserade medicin) program för Musculoskeletal Oncology i Kanton Zürich.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | PAA GmbH, Freiburg, Germany | E15-883 | |
| HAM F12 | PAA GmbH, Freiburg, Germany | E15-817 | |
| Heat-inactivated fetal calf serum | GIBCO, Basel, Switzerland | 10500-064 | |
| mTHPC | biolitec Research GmbH, Jena, Germany | As this liposomal formulation is originating from R&D no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5 mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; >99% purity) |
|
| Spectramax Gemini XS plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ID# 861 | |
| Microscope Zeiss Observer.Z1 | Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany | ||
| Ceralas PDT 652 nm Laser | biolitec AG, Jena, Germany | LD652nm2W400u | |
| Water-soluble tetrazolium (WST) reagent | Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland | 1644807 |
References
- Juarranz, A., Jaen, P., Sanz-Rodriguez, F., Cuevas, J., Gonzalez, S. Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications. Clin. Transl. Oncol. 10, 148-154 (2008).
- Agostinis, P., et al. Photodynamic therapy of cancer: an update. CA Cancer. 61, 250-281 (2011).
- D'Adamo, D. R. Appraising the current role of chemotherapy for the treatment of sarcoma. Semin. Oncol. 38 Suppl 3, 19-29 (2011).
- Allison, D. C., et al. A meta-analysis of osteosarcoma outcomes in the modern medical era. Sarcoma. , (2012).
- Anninga, J. K., et al. Chemotherapeutic adjuvant treatment for osteosarcoma: where do we stand. Eur. J. Cancer. 47, 2431-2445 (2011).
- Bacci, G., et al. Pattern of relapse in patients with osteosarcoma of the extremities treated with neoadjuvant chemotherapy. Eur. J. Cancer. 37, 32-38 (2001).
- Briccoli, A., et al. Resection of recurrent pulmonary metastases in patients with osteosarcoma. Cancer. 104, 1721-1725 (2005).
- Milla Sanabria, L., et al. Direct and indirect photodynamic therapy effects on the cellular and molecular components of the tumor microenvironment. Biochim. Biophys. Acta. 1835, 36-45 (2013).
- Mitra, S., Foster, T. H. Photophysical parameters, photosensitizer retention and tissue optical properties completely account for the higher photodynamic efficacy of meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin vs Photofrin. Photochem. Photobiol. 81, 849-859 (2005).
- Ma, L., Moan, J., Berg, K. Evaluation of a new photosensitizer, meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a comparison of its photobiological properties with those of two other photosensitizers. Int. J. Cancer. 57, 883-888 (1994).
- Reidy, K., Campanile, C., Muff, R., Born, W., Fuchs, B. mTHPC-mediated photodynamic therapy is effective in the metastatic human 143B osteosarcoma cells. Photochem. Photobiol. 88, 721-727 (2012).
- Triesscheijn, M., Ruevekamp, M., Aalders, M., Baas, P., Stewart, F. A. Comparative sensitivity of microvascular endothelial cells, fibroblasts and tumor cells after in vitro photodynamic therapy with meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin. Photochem. Photobiol. 80, 236-241 (2004).
- Triesscheijn, M., Baas, P., Schellens, J. H., Stewart, F. A.
- Burch, S., et al. Treatment of canine osseous tumors with photodynamic therapy: a pilot study. Clin. Orthop. Relat. Res. 467, 1028-1034 (2009).
