Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Osteosarkom Hücrelerde Fotodinamik Tedavi sitotoksik etkinliği Published: March 18, 2014 doi: 10.3791/51213
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Laboratory for Orthopedic Research, Balgrist University Hospital, Zurich, Switzerland
* These authors contributed equally

Summary

Burada bildirilen protokol sağlar: fotodinamik hücre hatlarında tedavi (PDT) ve hayvan modellerinde tedavi uygulamadan önce PDT ayarlarının optimizasyonu etkinliğinin değerlendirilmesi.

Abstract

Son yıllarda, daha az sistemik yan etkiler ile, kansere karşı daha etkili bir tedavi bulma zorluğu olmuştur. Bu nedenle Fotodinamik tedavi, daha seçici tümör tedavisi için yeni bir yaklaşımdır.

Oksijen varlığında, belirli bir dalga boyundaki ışık ile aktivasyon üzerine, bir sitotoksik yanıtı ortaya çıkarma 1 oksijen radikal üreten, toksik olmayan bir photosensitizer (PS), kullanan fotodinamik terapi (PDT). FDA tarafından neredeyse yirmi yıl önce onun onayına rağmen, PDT günümüzde sadece kanser türleri (cilt, mesane) ve nononcological hastalıkları (sedef, aktinik keratoz) 2 sınırlı sayıda tedavi etmek için kullanılır.

PDT kullanımının en büyük avantajı, sistemik yan etkileri engelleyen bir lokal tedavi, gerçekleştirmek için yeteneğidir. Ayrıca, (sinirler veya kan damarlarının çapında) örneğin hassas bölgelerde tümörlerin tedavisine izin verir. Burada, bir intraoperatPDT ive uygulama osteosarkom (OS), primer tümör uyduları hedef kemik tümör, cerrahi tümör rezeksiyonu sonrasında dokuyu çevreleyen tümör geride kabul edilir. Tedavi nükslerin sayısını azaltmakta ve (postoperatif) metastaz riskini azaltmayı amaçlamaktadır.

Bu çalışmada, iyi kurulmuş intratibial OS fare modellerinde, insan hastalığı üretmek için kullanılan yaygın olarak kullanılan OS hücre çizgilerinin etkili bir tedavi için uygun PDT ayarlarını elde etmek üzere in vitro PDT işlemleri içinde mevcut. PS mTHPC alımı, bir spektrofotometre ve fototoksisite bir WST-1 deneyi ile ve hayatta kalan hücrelerin sayımı ile değerlendirilen, hücre ölümünü teşvik etmek için 652 nm'de mTHPC lazer ışığı uyarım ile tahrik edilmiştir ile incelenmiştir. Kurulan teknikleri, hayvan modellerinde gelecekteki çalışmalar için uygun PDT ayarları tanımlamak için bize sağlar. Onlar PDT etkinliğinin değerlendirilmesi için kolay ve hızlı bir araçtır vitro, in vivo olarak bir uygulama yapılmıştır.

Introduction

Osteosarkom (OS) sanat tedavi Bugünkü devlet, bir primer kemik tümörü, neo adjuvan kemoterapi ve cerrahi bir kombinasyonunu kapsar. Bu tedavi rejimi, kemoterapi kullanımından önce, yaklaşık% 20 ila lokalize hastalığı olan hastaların hayatta kalma oranı artışı, şu anda 4,% 3, 60-70 arasındadır. Ancak, son iki yılda, yerel hastalığı olan OS hastaların genel sağkalım, 5 4 durmuş durumda. Ayrıca, bu hastaların% 30-40 tan sonra 3 yıl içinde nüks ve metastatik hastalığı olan hastalarda% 20-30 4 kötü bir hayatta, 6, 7, yaşamaya devam. Bu hastaların sonuçlarını iyileştirmek için, yeni tedavi stratejileri geliştirilmesi gerekmektedir.

Fotodinamik terapi (PDT), bir çok yeni anti-kanser terapisi, bir photosensi uyarılması için belirli bir dalga boyunda ışık kullanırkan akışı içine enjeksiyonundan sonra tümör hücrelerinde biriken tizer (PS). PS'nin Lazer ışığı uyarım tümör hücreleri ve hücre ölümü ile sitotoksik reaksiyonu meydana oksijen mevcudiyetinde oksijen radikalleri oluşturur. PDT tümör enfarktüs yol açan, vazokonstriksiyon ve tümör mikro-damar trombus oluşumuna neden olan ve, dolayısıyla tümör içinde yerel hipoksi ve anoksi Bu birincil mekanizma yanı sıra, iki ek PDT biyolojik işlemler, daha az tümör büyümesine katkıda uyandırdı. Son olarak, PDT yaralı ve ölen tümör hücrelerinin lokal bir bağışıklık tepkisinin, PDT'nin oldukça benzersiz bir özelliği tetikler. Bu, tamamlayıcı sistemi ve dendritik hücreleri antijen sunan 8 aktivasyonunu içerir. Bu durumda, şartlar tümör spesifik bağışıklık yol açan, lenfoid hücrelerin sonraki aktivasyonu tümör antijenlerin sunumu için oluşturulur.

Şimdiye kadar, PDT, yumuşak doku tümörleri ve hyperpl çeşitli tedavi etmek için kullanılmaktadırasya adlı, örneğin aktinik keratoz, Barrett özofagus, endobronşiyal tümörler, mesane kanseri, bazal hücreli karsinom, baş ve boyun kanseri 2 palyatif tedavi olarak. Tedavi çok az yan etkileri olan, yerel büyük ölçekli nekroza neden olduğu bilinmektedir ve bu yüzden seçici olarak tümör dokusu ortadan kaldırmak için potansiyele sahiptir. Bu avantajlara rağmen, PDT uygulama kemoterapötik ilaçların uygulanması daha teknik olarak daha zor olmaya devam etmektedir. Maksimal etkinlik, PS konsantrasyonu, ışığa maruz kalma süresini ve toplam ışık enerji transferini elde etmek için optimize edilmiş olması gerekir. Bu, in vivo deneyler yapılabilir, ancak Optimize edilmiş gereken parametrelerin görece çok sayıda, bu ilk olarak in vitro en uygun şartları belirlemek için daha etkilidir.

Aşağıda tarif edilen deneylerde, PS 5,10,15,20-tetrakis-(meta-hidroksifenil) CHL kullanan PDT in vitro etkinliği testOrin, mTHPC (Şekil 1A) kısaltılır. mTHPC anda baş ve boyun kanseri hafifletici tedavisi için klinikte kullanılan tıbbi ürün Foscan, aktif maddedir. Düşük konsantrasyonlarda zaten büyük hücre hasarının neden olan, en güçlü PS biridir ve bu doku penetrasyonu 9, 10 açısından diğer PS üstün olduğu gösterilmiştir. Hafif emilme tayfı (Şekil 1 B), sırasıyla PS biriken doku lokalizasyonu ve PDT indüksiyonu için kullanılan iki önemli tepe, 417 nm 'de bir ve 652 nm' de bir ikinci, göstermektedir.

Şu anda, mTHPC için bir lipozomal formülasyon geliştirme aşamasındadır. İşte, biz bu lipozomal formülasyon alımını ölçmek için, ve iki insan OS hücre hatlarında FDT gerçekleştirmek için prosedürleri tarif; düşük metastatik HOS ve yüksek metastatik 143B hücreleri. Burada sunulan verilerin bazıları 11 daha önce rapor edilmiştir. ThBurada anlatılan E yaklaşım PDT etkinliği üzerinde bir metastatik fenotip etkisini araştırmak için bize sağlar. Orthotopically bağışıklık yetersizliği olan SCID farelerinin arka bacaklarda enjekte 143B hücrelerinin metastaz intratibial birincil tümörlerin, yakından insan Metastaz hastalığı taklit eden bir model neden olur. Bu nedenle, önerilen in vitro deneyler uygun PDT ayarlar daha sonra in vivo deneylerde kullanılmak üzere değerlendirmek için mükemmel bir şekilde uygundur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Bulunduğu Low mTHPC arasında Alımı ve Yüksek Metastatik HOS ve 143B OS Hücre Hatlarının Karşılaştırılması

  1. DMEM, Ham F12 ve bir oranı 4.5:4.5:1 içinde ısı ile inaktive edilmiş fetal dana serumu ihtiva eden hücre kültür ortamı hazırlayın.
    Not: PS mTHPC bir lipozom formülasyonu, 1.5 mg / ml mTHPC bir son konsantrasyonda su içinde çözülür.
  2. Levha 0.2 x 10 6 HOS ve 143B hücre / oyuk, 6 oyuklu tabaklar (her bir durum için kopyaların) ve hücreler gece boyunca uygun sağlar.
    Not: sayısını tek tek hücre çizgileri için ayarlanmalıdır. % 80-90 arasında bir confluency Deney zamanında en çok uygundur.
  3. Ertesi gün farklı zaman dilimlerinde (zamana bağlı alımı) için mTHPC sabit bir konsantrasyonu ile inkübe hücreleri, ya da sabit bir süre (doza bağlı bir uptake) boyunca mTHPC artan yoğunluklarda.
  4. Belirli bir zaman p mTHPC ile hücreleri inkübeoints veya mTHPC konsantrasyonları.
    Not: Bu çalışmada, HOS 143B ve hücre çizgileri, her ikisi için de 0.6 ug / ml ile inkübe edildi mTHPC 0, 2.5, 5, veya 10 saat, ya da 5 saat boyunca 0, 0.6, 2.5 ve 10 ug / ml ile mTHPC. Uygulanan zaman aralıkları ve dozajlar, kullanılan bir hücre hattı ile ilgili olarak değişebilir.
  5. Her zaman hücreleri direkt ışık maruz kalmasını önlemek için karanlık veya karartılmış ışık koşullarında çalışmak unutmayın.
  6. Belirtilen koşullarda hücrelerin inkübasyonundan sonra, ortam aspire ve hücreler PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, 0.5 ml tripsin / EDTA ile hücreleri ayırmak ve hücreleri sayın.
  7. Ayrıldıktan sonra, 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj hücreleri orta aspire ve 200,000 hücre / ml 'lik bir son yoğunluğa kadar PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
  8. Elde edilen hücre süspansiyonu pipetle 100 ul, 96 oyuklu bir plaka içerisinde ve bir floresan spektrofotometrede bu hücrelerin floresan ölçer (örneğin 20.000 hücre). AyarımTHPC floresans ölçümleri için ler vardır: emisyon için 652 nm eksitasyon ve 417 nm.
  9. , Hücre başına içsel mTHPC miktarının hesaplanması aşağıdaki gibi hücre sayısı ve hücre hacmine nispi floresan ünitesi (RFU) normalleştirmek amacıyla:
  10. 0-4 ug / ml (araç kullanımı üç kopyalı ölçüm) ikinci PBS mTHPC farklı konsantrasyonları kullanılarak standart bir eğri hazırlanır. 96 oyuklu bir plaka içerisinde her seyreltme oranından 100 ul pipet ve aşama 1.6 altında tarif ayarları kullanarak kuyuların floresan ölçer.
  11. Kuyuda (ug / ml) mTHPC konsantrasyonunu vermektedir mTHPC, doğrusal standart eğrinin eğimi ile (20,000 hücreler için elde edilmiş) RFU bölün.
  12. (Hücre süspansiyonu 100 ul temsil ug) bir kuyuda mTHPC toplam miktarını almak ve 20,000 hücre hacmi ile bu değeri 10 bölmek için bu mTHPC konsantrasyonu bölün.
  13. X (4/3 x π): Bir kürenin için formülü ile hacmini hesaplayınR3. Mikroskop altında 20 tripsinize edilmiş hücre çapını ölçmek ve bu değeri 2 ile bölünmesiyle elde edilir yarıçapı r.
  14. Son olarak, 10 saat (doza bağlı alımı) saat ya da% 100'e ayarlanmış olan 10 ug / ml mTHPC (zamana bağlı alımı) ile işlem gördükten sonra HOS hücreleri için elde edilenlere tüm değerleri normalize.

2. PS in vitro Fototoksisite Ölçümü

  1. 96 oyuklu bir plaka (mTHPC her bir konsantrasyonu için kopyaların kullanılır) içerisinde 3,000 hücre / oyuk tohum ve gece boyu bağlı sağlar. Benzer şekilde ek bir 96 oyuklu plaka hazırlanması ve aşağıda tarif edildiği gibi hücre tedavisi, ancak daha sonra faz kontrastlı görüntüleme için bir kenara koydu.
    Not: sayı her bir hücre hattı için ayarlanmalıdır. Deneyin zamanında% 50-60 arasında bir confluency idealdir.
    1. MTHPC konsantrasyonlarının her biri için hücrelerin gelen karanlık toksisite denetimi eklemek için unutmayın.se mTHPC seçilmiş konsantrasyonlarının varlığında veya yokluğunda inkübe edilecek hücreler, ancak aydınlatılmış olmayacaktır.
  2. Ertesi gün, hücre çizgileri ile ilgili olarak mTHPC (0, 0.0001, 0.001, 0.01, 0.03, 0.075, 0.15, 0.3, 0.6, 1.25, 2.5, 5 ve 10 ug / ml) farklı konsantrasyonları ile inkübe edilir ve hücreleri 5 saat boyunca karanlıkta tutun.
    1. Bölüm 1.3.2 başvurun
      Not: Kuluçka süresi aydınlatma hücre hattı ve kullanılan PS bağlıdır önce, bu nedenle, ayrı deneylerde, farklı konsantrasyonlarda ve farklı zaman noktaları test için tavsiye edilir.
  3. Belirtilen süre için inkübe edildikten sonra, PBS ile iki kez yıkama ve hücreler mTHPC olmadan yeni taze ortam ekleyin.
  4. MTHPC absorpsiyon spektrumu için özel bir 652 nm diyot lazer, (bkz. Şekil 1) ile hücrelerin aydınlatın.
    1. 13.5 cm dista bir yükseklikte, 21.88 mW / cm 2 gücüne lazer ayarlama5 J / cm 2 lik bir enerji dozu elde etmek amacıyla, hücrelerden ım. 230 saniye boyunca hücreleri aydınlatın. (Ve mTHPC olmadan) karanlık toksisite kontrol hücrelerini aydınlatmak etmeyin.
      Not: Her zaman PS uyarma için kullanılan lazer ışıktan gözleri korumak için gözlük.
  5. Aydınlatma sonra, 24 saat boyunca 37 ° C'de karanlıkta hücreleri tutun. Daha sonra, suda çözülebilen tetrazolium (WST-1) reaktif (orta μl/100 10 ul) ekleyin.
  6. Üç saat WST-1 reaktifi ilave edildikten sonra, 415 nm'de, 96 oyuklu plakanın her bir gözeneğine absorbansı ölçülür.
  7. Hayatta kalan hücrelerin yüzdesini hesaplamak için, (örneğin mTHPC olmadan mTHPC ve nonilluminated olmadan aydınlatılmış)% 100 her bir durum için non mTHPC tedavi edilen hücreler için elde edilen değerlerin ortalaması olarak ayarlayın.

3. Hücre Sayım tarafından Hücre sayısı Tahmini

  1. Tohum 20,000 hücre / biz, 24 oyuklu bir plaka içerisinde ll ve onları bir gece boyunca bağlı sağlar.
  2. MTHPC ile 5 saat (0.001, 0.003, 0.15, 0.6 ve 1.25 ug / ml) için hücreler inkübe edin ve yukarıda tarif edildiği gibi, onları aydınlatır.
  3. Orta toplayın, 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj ile, bir kez PBS ile yıkayın hücreleri bunları trypsinize ve bunları toplamak.
  4. Santrifüj işleminden sonra, ortam aspire taze ortam ve 200 ul içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
  5. Bir Neubauer odası içinde hücreleri sayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada bildirilen teknikler ile, insan OS hücrelerinde mTHPC bazlı PDT incelenmiştir. İlk olarak, mTHPC zamana ve doza bağımlı bir alım, düşük metastatik HOS ve yüksek düzeyde metastatik 143B OS hücre hatlarında araştırılmıştır. mTHPC alımı bir floresan spektrofotometre ile mTHPC floresanı (Reidy et al. 11 izni ile yeniden Şekil 2) ölçülmesi ile değerlendirilebilmektedir. Şekil 2A, bir zaman bağlı bir şekilde mTHPC alımını göstermektedir. Hücre süspansiyonunun floresans yoğunluğu. Şekil 2B, 5 saat inkübasyondan sonra, HOS ve 143B hücrelerinde doza bağımlı bir mTHPC alımını göstermektedir mTHPC hücre içi düzeylerini göstermektedir. Yüksek metastatik hücre hattı 143B olarak alım düşük metastaz HOS parental hücre hattına göre daha yüksek olma eğilimindeydi.

Karanlık ve 143B hücrelerinde mTHPC arasında fototoksisite hücre Metaboli saptanmasıyla değerlendirildi(a WST-1 deneyi ile) ve mTHPC, 230 saniye ve karanlıkta 24 saat boyunca inkübasyon için daha fazla lazer ışığı ile karanlık veya tedavisinde sonraki kuluçka ile inkübasyon, 5 saat sonra kalan hücrelerin sayısının sayılmasıyla c etkinliği.

Doz bağımlı koyu toksisite (Reidy et al. 11 izni ile yeniden), Şekil 3 'de gösterilmiştir. Şekil 3A'da, 143B hücrelerinin farklı mTHPC dozajları ile muamele edilmiş ve muamele edilmemiş hücreler ile karşılaştırıldığında edilmiştir. Hücre sayısı ve metabolik etkinlik bir doza bağımlı bir azalma gözlenmiştir. Azalmış hücre canlılığı eşit ve 2.5 ug / ml 'den daha yüksek bir mTHPC konsantrasyonda tanındı. MTHPC doza bağlı fototoksisite Şekil 3B'de gösterilmiştir. Hücreler, farklı mTHPC dozlarda ve daha sonra aydınlatma (5 J / cm 2) ile muamele edilmiştir. Hücre nu bir azalma yanı sıra, (WST deneyi ile ölçülen) hücre metabolik aktivite bir netice azalmamber gözlenmiştir. PDT uygulamadan sonra hücre sayısındaki azalma elde Şekil 4 'de görüntülenmiştir.

Şekil 1
Şekil 1. MTHPC (A) kimyasal yapısı ve ışık emme spektrumu (B). Rakamlar biolitec Araştırma GmbH tarafından temin edildi. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2. Insan OS hücre çizgileri HOS ve 143B ile mTHPC saati ve doza bağımlı bir alım. (A). HOS (gre içinde y) ve 143B (siyah) (0.2 x 20 6 hücre / oyuk), 6 oyuklu plakalarda tohumlanmıştır. Gece boyunca yürütülen kültürü sonra hücreler 0, 2.5, 5, 7.5 ve 10 saat (A) ve 0.6 ug / ml ile inkübe mTHPC veya edildi, 5 saat boyunca 0, 0.6, 2.5 ve 10 ug / ml mTHPC (B) . Flüoresans yoğunluğu, 417 nm'de eksıtasyonla 652 nm'de üzerine, 20,000 hücre flüoresanın ölçülmesi ile belirlenmiştir. Değerler hesaplanan hücre hacmi ve 10 saat (A) veya 10 ug / ml (B) ile inkübasyondan sonra, HOS hücrelerin mTHPC alımından normalize edildi% 100 olarak ayarlandı. Değerler üç bağımsız deneyin SEM ± ortalamasıdır. Reidy'nin vd. 11 uyarlanan bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

les/ftp_upload/51213/51213fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51213/51213fig3.jpg "/>
Şekil 3,. Karanlık ve 143B hücrelerinde mTHPC arasında fototoksisite. Hücreler gece boyunca tedavi öncesi tohumlandı ve yetiştirilmiştir. MTHPC doza bağlı bir karanlık toksisitesi belirlemek için, hücreler, 143B mTHPC belirtilen konsantrasyonlarda (A) yokluğunda ya da varlığında, karanlıkta 5 saat inkübe edildi. MTHPC doza bağımlı verilmedi toksisitesi belirlemek için, hücreler, 143B belirtilen konsantrasyonlarda 5 saat ya da mTHPC olmadan inkübe edildi ve daha sonra 230 saniye boyunca 21,88 mW / cm 2 'lık bir gücü olan 5 J / cm 2 ile aydınlatıldı (B). WST-1 deneyi ile metabolik aktivitesi (●) ölçümleri için, 143B hücreler 3000 hücre / oyuk yoğunluğunda 96 oyuklu plakalara tohumlandı. Hücre sayıları (○) 24 oyuklu plakalar içerisinde de 20,000 hücre / oyuk olarak tohumlanır hücrelerinden sayılmıştır. Değerler üç bağımsız deneyin SEM ± ortalamasıdır. Uyarlanmış from Reidy'nin vd. 11. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4. PDT. Hücreler önce ve sonra 143B hücrelerinin Faz kontrast görüntüleri tohumlandı ve protokolde tarif edildiği gibi, gece boyunca uygun bırakılmıştır. Doz bağımlı görselleştirmek için, mTHPC ışık toksisite ettiği, 143B hücreler 0 ile karanlıkta 5 saat 0.6, 2.5, inkübe edildi, ve 10 ug / ml mTHPC (AD paneller, sırasıyla). Hücreler daha sonra 230 saniye boyunca 652 nm dalga boyunda 5 J / cm 2 ışığı ile aydınlatılmış ve 24 saat sonra fotoğraflandı. Ölçek çubuğu:. 100 mikron PlBu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız ease.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PDT cevap olarak uygun bir sitotoksisite elde etmek için, doğru lazer ışığı ayarları ve inkübasyon sürelerini seçmek çok önemlidir. Burada açıklanan işlemler PS alımını belirlemek için in vitro ve in PDT kaynaklı sitotoksisite ölçmek için tutarlı ve etkili. PS mTHPC spesifik soğurma dalga boylarını kullanarak, hücresel alımı PS doğrudan bir şekilde tespit edilebilir ve PS sitotoksik reaktif oksijen türleri oluşturmak için etkinleştirilebilir.

Bu in vitro kurulumu kullanılarak, örneğin PS konsantrasyonu, ilaç ışık aralığının ve lazer ışık yoğunluğu gibi tüm parametreler, PS özelliklerine göre ayarlanabilir ve hücre hatları kullanılabilir. Hücre sayısı bir araya WST-1 deneyi (metabolik aktivitesi gözlenmiştir) ile hücrenin hayatta kalması için iyi bir tahmin veren, kalan bağlı hücre dışına doğrudan okunmasını sağlar. Ancak, sunulan yöntem sadece hücre toksisitesi, yani "birinci hit" modelleyebilirhemen PS aktivasyonu sonra reaktif oksijen türleri. In vivo sonraki vazokonstriksiyon ve tam tümör yok edilmesi için gerekli olan, bağışıklık sisteminin aktivasyonu gözlemlenmiştir, sadece hayvanlarda araştırılabilir.

Şekil 2, düşük metastaz HOS parental hücre hattına göre daha yüksek düzeyde metastatik 143B olarak daha yüksek bir seviyeye mTHPC bir zaman ve doza bağımlı bir alımını gösterdi. 143B OS hücrelerinde mTHPC karanlık toksisitesi sadece yüksek konsantrasyonlarda, 5 saat boyunca inkübasyon (Şekil 3) sonra gözlenmiştir. 143B hücrelerinin bir mTHPC gösterilen PDT için yüksek duyarlılık ve hafif doza bağımlı bir fototoksik etki göstermektedir. Bir fototoksik etki 0.075 ug / ml kadar düşük bir konsantrasyonda daha önce mTHPC gözlendi ve 0.022 ± 0.006 ug / ml 'lik bir yarı-maksimum öldürücü konsantrasyonu (Şekil 3) gözlenmiştir.

PDT birçok tümör türüne karşı minimal invaziv ve etkili olmasına rağmenhastalarda tekniği (örneğin. şişlik, eritem) uygularken s, minör yan etkiler oluşabilir. Bu PS, sadece bu hücrelerde aynı zamanda PDT sonra toksisiteye neden nontumor hücreler tarafından, burada gösterildiği gibi, tümör hücreleri tarafından alınan, ama aynı zamanda olduğunu gösterir. Triesscheijn et al. Insan fibroblastları ile karşılaştırıldığında, tümör hücrelerinin artan bir ışığa göstermek mümkün oldu. Bunun aksine, insan mikrovasküler endotelyal hücreleri, yüksek ışığa 12 yol açan, diğer test edilen hücre çizgileri, daha mTHPC daha yüksek bir alımını göstermektedir. Bu bulgular da sık sık 2 görülmektedir PDT ilişkili anti-vasküler etkileri ile ilişkilidir.

Tarif edilen yöntemler, aynı zamanda diğer PS için uygulanabilir. İnkübasyon süresi ve lazer ışık yoğunluğu PS karakteristiklerine adapte edilmesi gerekmektedir. Buna ek olarak, aynı zamanda PDT yalnızca ayar yöntem kendisi hücre hattı bağımlı değil, çünkü, OS hücre dışındaki indüklenebilir. Gibi ek rEAD çıkışları, hücre ölüm mekanizmaları, örneğin, analiz edilebilir. apoptoz, nekroz ya da Otofaji katılan proteinlerin Western Blot analizi ile. Ayrıca PS hücre içi lokalizasyonu odaklı lazer tarama mikroskobu ile örneğin görselleştirilebilir.

In vitro, lazer ışığı ile PS ve PDT indüksiyonu ile hücrelerin, yani inkübasyon, PDT için tarif edilmiş, farklı adımlar yakından klinik durum benzer. Hastalar (iv ya da sc. Uygulamalı) PS, ve ayrı bir ilaç hafif bir aralıktan sonra, ilgi (örneğin,. Tümör dokusu) alanı lazer ışığı 13 ile aydınlatılır alır. Henüz OS uygulanan olmasa da, potansiyel avantajları ortada; PDT sık sık primer tümörün ana kenarına yakın primer tümör hücre kümeleri olarak büyür tümör uyduların intraoperatif tedavisi için özellikle çekici olarak kabul edilir ve bir tekrarını başlatabilir s sırasında cevapsızprimer tümörün urgical rezeksiyonu. Hatta büyük kemik tümörleri bu teknik ile tedavi edilebilir. Bu durum, köpeklerin 14 gelecek vaat eden bir çalışma ile gösterilmiştir. Buna ek olarak, cerrahi ile rezeke edilemeyen tümör hücrelerinin yok edilmesi (örneğin, birden fazla metastaz çoğunlukla akciğerlerde meydana gelen), aynı zamanda OS metastatik hastalığı olan hastalarda FDT gelecekteki olası bir uygulamasını temsil edebilir.

Bu deneyler yaparken, bakım, normal gündüz de mTHPC etkinleştirmek için gerekli dalga boyu içerdiği gibi tüm çalışma basamakları, hücrelere PS ekledikten sonra minimal ışığı altında yapılmaktadır ki alınmalı, dikkat etmek önemlidir. Aynı şekilde, klinik öncesi modellerde in vivo uygulama için, bakım mTHPC enjekte sonra doğrudan ışıktan hayvanları korumak için alınması gerekmektedir. Ayrıca, WST-1 analizi sadece hücre ölümü dolaylı bir göstergesi olan tümör hücrelerinin metabolik aktivitesini değerlendirir dikkat edilmesi gerekmektedir. Bu nedenle, Toplam hücre sayımı ile bir arada, burada gösterildiği gibi, tavsiye edilmektedir.

Sonuç olarak, tarif edilen yöntemler (PS-alımı ve PDT ile uyarılan hücre toksisitesi ile karşılaştırıldı) kombinasyonu in vitro olarak bir PS toksisite özelliklerini karakterize etmek için, hızlı ve uygun maliyetli bir prosedür sağlamaktadır. Bu in vitro sonuçlar ile, en iyi ışık yoğunluğu ve ilaç ışık aralığının aralık PDT in vivo olarak uygulanabilir ne kadar iyi bir gösterge veren, tahmin edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını veya çıkar çatışması beyan ederim.

Acknowledgments

Yazarlar nazik onların yardım ve teknik uzmanlık için Susanna GRAFE ve Arno Wiehe özel sayesinde, lipozomal mTHPC formülasyonu ile bize sağlamak için biolitec Araştırma GmbH ile (Jena, Almanya) teşekkür etmek istiyorum. Biz de sonuçları büyük bir bölümünü oluşturulan ve yayımı 11 coresponsible oldu Kerstin Reidy, teşekkür etmek istiyorum.

Bu çalışma Schweizerischer Verein Balgrist, Zürih Üniversitesi, Krebsliga Zürih yanı sıra Walter L. ve Johanna Kurt Vakfı, Zürih, İsviçre hibe ve EuroNanoMed ERA-NET / SNF İsviçreli bir hibe ile hibe tarafından desteklenmiştir Ulusal Bilim Vakfı 31NM30-131004/1. Bu çalışma aynı zamanda HSM Kanton Zürih Muskuloskeletal Onkoloji (Yüksek İhtisas Tıp) programı tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM PAA GmbH, Freiburg, Germany E15-883
HAM F12 PAA GmbH, Freiburg, Germany E15-817
Heat-inactivated fetal calf serum GIBCO, Basel, Switzerland 10500-064
mTHPC biolitec Research GmbH, Jena, Germany As this liposomal formulation is originating from R&D
no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5 mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; >99% purity)
Spectramax Gemini XS plate reader Molecular Devices, Sunnyvale, CA ID# 861
Microscope Zeiss Observer.Z1 Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany
Ceralas PDT 652 nm Laser biolitec AG, Jena, Germany LD652nm2W400u
Water-soluble tetrazolium (WST) reagent Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland 1644807

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Juarranz, A., Jaen, P., Sanz-Rodriguez, F., Cuevas, J., Gonzalez, S. Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications. Clin. Transl. Oncol. 10, 148-154 (2008).
  2. Agostinis, P., et al. Photodynamic therapy of cancer: an update. CA Cancer. 61, 250-281 (2011).
  3. D'Adamo, D. R. Appraising the current role of chemotherapy for the treatment of sarcoma. Semin. Oncol. 38 Suppl 3, 19-29 (2011).
  4. Allison, D. C., et al. A meta-analysis of osteosarcoma outcomes in the modern medical era. Sarcoma. , (2012).
  5. Anninga, J. K., et al. Chemotherapeutic adjuvant treatment for osteosarcoma: where do we stand. Eur. J. Cancer. 47, 2431-2445 (2011).
  6. Bacci, G., et al. Pattern of relapse in patients with osteosarcoma of the extremities treated with neoadjuvant chemotherapy. Eur. J. Cancer. 37, 32-38 (2001).
  7. Briccoli, A., et al. Resection of recurrent pulmonary metastases in patients with osteosarcoma. Cancer. 104, 1721-1725 (2005).
  8. Milla Sanabria, L., et al. Direct and indirect photodynamic therapy effects on the cellular and molecular components of the tumor microenvironment. Biochim. Biophys. Acta. 1835, 36-45 (2013).
  9. Mitra, S., Foster, T. H. Photophysical parameters, photosensitizer retention and tissue optical properties completely account for the higher photodynamic efficacy of meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin vs Photofrin. Photochem. Photobiol. 81, 849-859 (2005).
  10. Ma, L., Moan, J., Berg, K. Evaluation of a new photosensitizer, meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a comparison of its photobiological properties with those of two other photosensitizers. Int. J. Cancer. 57, 883-888 (1994).
  11. Reidy, K., Campanile, C., Muff, R., Born, W., Fuchs, B. mTHPC-mediated photodynamic therapy is effective in the metastatic human 143B osteosarcoma cells. Photochem. Photobiol. 88, 721-727 (2012).
  12. Triesscheijn, M., Ruevekamp, M., Aalders, M., Baas, P., Stewart, F. A. Comparative sensitivity of microvascular endothelial cells, fibroblasts and tumor cells after in vitro photodynamic therapy with meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin. Photochem. Photobiol. 80, 236-241 (2004).
  13. Triesscheijn, M., Baas, P., Schellens, J. H., Stewart, F. A. Photodynamic therapy in oncology. Oncologist. 11, 1034-1044 (2006).
  14. Burch, S., et al. Treatment of canine osseous tumors with photodynamic therapy: a pilot study. Clin. Orthop. Relat. Res. 467, 1028-1034 (2009).

Tags

Tıp Sayı 85 Fotodinamik Tedavi (PDT) 5,10,15,20-tetrakis (meta-hidroksifenil) klorin (mTHPC) fototoksisitenin koyu-toksisite osteosarkom (OS) foto-
Osteosarkom Hücrelerde Fotodinamik Tedavi sitotoksik etkinliği<em&gt; In Vitro</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meier, D., Campanile, C., Botter, S. … More

Meier, D., Campanile, C., Botter, S. M., Born, W., Fuchs, B. Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (85), e51213, doi:10.3791/51213 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter