Summary
Le protocole présenté ici permet l'évaluation de l'efficacité de la thérapie photodynamique (PDT) dans des lignées cellulaires et l'optimisation des paramètres de PDT avant l'application de la thérapie chez des modèles animaux.
Abstract
Au cours des dernières années, on a observé la difficulté de trouver des traitements plus efficaces contre le cancer avec moins d'effets secondaires systémiques. Par conséquent thérapie photodynamique est une nouvelle approche pour un traitement sélectif plus de tumeur.
La thérapie photodynamique (PDT) qui rend l'utilisation d'un photosensibilisateur non toxique (PS), qui, lors de l'activation avec de la lumière d'une longueur d'onde spécifique en présence d'oxygène, génère des radicaux oxygène qui suscitent une réponse cytotoxique 1. Malgré son approbation il ya près de vingt ans par la FDA, PDT n'est plus utilisé que pour traiter un nombre limité de types (de la peau, de la vessie) et les maladies nononcological (psoriasis, la kératose actinique) 2 cancer.
L'avantage majeur de l'utilisation de la PDT est la capacité à effectuer un traitement local, ce qui empêche les effets secondaires systémiques. En outre, il permet le traitement de tumeurs sur des sites sensibles (par exemple autour des nerfs ou des vaisseaux sanguins). Ici, un intraoperative demande de PDT est considéré dans l'ostéosarcome (OS), une tumeur de la moelle, à une cible, les satellites de la tumeur primaire a laissé la tumeur dans les tissus environnants après la résection chirurgicale de la tumeur. Le traitement vise à diminuer le nombre de récidives et à réduire le risque de (post-opératoire) métastase.
Dans la présente étude, nous présentons in vitro procédures PDT à établir les paramètres PDT optimales pour un traitement efficace de lignées cellulaires OS largement utilisés qui sont utilisés pour reproduire la maladie chez l'homme dans les modèles de souris OS intratibial bien établies. L'absorption de la PS mTHPC a été examiné avec un spectrophotomètre et la phototoxicité a été provoqué par une lumière laser excitation de mTHPC à 652 nm pour induire la mort cellulaire évaluée par un test WST-1 et par le comptage des cellules survivantes. Les techniques établies nous permettent de définir les paramètres optimaux PDT pour de futures études sur des modèles animaux. Ils sont un outil simple et rapide pour l'évaluation de l'efficacité de la TPD
Introduction
L'état du traitement de l'art de l'ostéosarcome (OS) d'aujourd'hui, une tumeur osseuse primaire, englobe une combinaison de chimiothérapie néoadjuvante et chirurgie. Ce schéma de traitement a révélé une augmentation du taux de patients avec une maladie localisée à partir d'environ 20% avant l'utilisation de la chimiothérapie de survie, à ce moment entre 60 à 70% 3, 4. Cependant, dans les deux dernières décennies, la survie globale des patients atteints de la maladie d'OS locale a atteint un plateau 4, 5. De plus, 30 à 40% de ces patients rechutent dans les 3 ans après le diagnostic et les patients avec une maladie métastatique continuer à avoir un faible taux de survie de 20 à 30% 4, 6, 7. Pour améliorer les résultats de ces patients, de nouvelles stratégies thérapeutiques doivent être développées.
La thérapie photodynamique (PDT), un lieu nouveau traitement anticancéreux, utilise la lumière d'une longueur d'onde spécifique pour l'excitation d'un photosensibilisanttizer (PS), qui s'accumule dans les cellules tumorales après son injection dans la circulation sanguine. La lumière laser d'excitation de la PS génère des radicaux oxygène en présence d'oxygène, qui induisent une réaction cytotoxique dans les cellules tumorales et la mort cellulaire. Outre ce mécanisme primaire, deux PDT supplémentaire évoquée processus biologiques contribuent à la croissance tumorale réduite: PDT provoque une vasoconstriction et la formation de thrombus de la microvascularisation de la tumeur et, par conséquent, l'hypoxie et l'anoxie locale à l'intérieur de la tumeur, ce qui conduit à un infarctus d'une tumeur. Enfin, PDT blessé et les cellules tumorales meurent déclencher une réponse immunitaire locale, une caractéristique assez unique de PDT. Il s'agit du système du complément et l'activation des cellules dendritiques présentatrices d'antigène 8. Ainsi, des conditions sont créées pour la présentation des antigènes tumoraux avec l'activation subséquente des cellules lymphoïdes, qui conduit à une immunité spécifique de la tumeur.
Jusqu'à présent, la PDT a été utilisé pour traiter plusieurs types de tumeurs des tissus mous et hyperplasie du, comme la kératose actinique, l'oesophage de Barrett, une tumeur endobronchique, cancer de la vessie, des carcinomes baso-cellulaires, et le traitement palliatif du cancer tête et cou 2. Le traitement est connu pour provoquer, à grande échelle d'une nécrose locale avec seulement peu d'effets secondaires, et a donc le potentiel pour éliminer de manière sélective du tissu tumoral. Malgré ces avantages, l'application de la PDT reste techniquement plus exigeant que l'administration de médicaments chimiothérapeutiques. Afin d'obtenir une efficacité maximale, la concentration en PS, le temps d'exposition de lumière et de transfert de l'énergie totale de la lumière doivent être optimisés. Cela peut être fait dans des expériences in vivo, mais, en raison du grand nombre relatif de paramètres qui doivent être optimisé, il est plus efficace de déterminer les conditions optimales d'abord in vitro.
Dans les expériences décrites ci-dessous, nous avons testé l'efficacité in vitro de la PDT en utilisant le PS 5,10,15,20-tétrakis-(méta-hydroxyphényl) chlOrin, en abrégé mTHPC (figure 1A). mTHPC est la substance active dans le médicament Foscan, qui est actuellement utilisé en clinique pour le traitement palliatif du cancer tête et cou. Il est l'un des plus puissants PS, induisant des lésions cellulaires massif déjà à de faibles concentrations, et il a été démontré pour être supérieur à l'autre PS en termes de pénétration de tissu 9, 10. Son spectre d'absorption de la lumière (Figure 1B) montre deux pics importants, l'un à 417 nm et une seconde à 652 nm, qui sont utilisés pour la localisation tissulaire de PS et d'accumulation pour la PDT induction, respectivement.
Actuellement, une formulation liposomale pour mTHPC est en cours de développement. Ici, nous décrivons les procédures de quantifier l'absorption de cette formulation liposomale, et pour effectuer des PDT dans deux lignées de cellules humaines OS, le faible HOS métastatique et les cellules métastatiques 143B élevés. Certaines des données présentées ici ont été signalés plus tôt 11. Thapproche e décrit ici nous permet d'étudier l'effet d'un phénotype métastatique sur PDT efficacité. Cellules 143B, orthotopiquement injectés dans les membres postérieurs des souris SCID immunodéficientes provoquent des métastases des tumeurs primaires intratibial, un modèle imitant de près la maladie de métastases humaine. Ainsi, les expériences proposées in vitro sont parfaitement adaptés pour évaluer les paramètres optimaux PDT pour être utilisés plus tard dans des expériences in vivo.
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Protocol
Une. Comparaison de l'absorption de mTHPC dans le respectifs faible et très métastatique HOS et 143B OS lignées cellulaires
- Préparer un milieu de culture cellulaire contenant du DMEM, Ham F12, et inactivé sérum de veau foetal de chaleur dans un rapport 4.5:4.5:1.
Remarque: La formulation liposomale de la PS mTHPC a été dissous dans de l'eau à une concentration finale de 1,5 mg / ml mTHPC. - Plaque de 0,2 x 10 6 cellules HOS et 143B / puits dans des plaques 6 puits (triple pour chaque condition) et laissez les cellules adhèrent nuit.
Remarque: le nombre doit être ajusté à des lignées de cellules individuelles. A une confluence de 80-90% est le plus approprié au moment de l'expérience. - Le jour suivant, incuber les cellules avec une concentration fixe de mTHPC pour différentes périodes de temps (de l'absorption en fonction du temps), ou avec des concentrations croissantes de mTHPC pendant une période de temps fixe (dose d'absorption dépendant).
- Incuber les cellules avec mTHPC pendant p spécifiqueoints ou concentrations de mTHPC.
Nota: Dans cette étude, à la fois le HOS et les lignées de cellules 143B ont été mises en incubation avec 0,6 ug / ml mTHPC pendant 0, 2,5, 5, ou 10 heures, ou avec 0, 0,6, 2,5 et 10 pg / ml mTHPC pendant 5 heures. Les périodes de temps et les doses appliquées peuvent varier en fonction de la lignée cellulaire qui est utilisée. - Rappelez-vous de toujours travailler dans l'obscurité ou dans des conditions de lumière tamisée pour éviter l'exposition de la lumière directe des cellules.
- Après incubation des cellules dans des conditions indiquées, aspirer le milieu et laver les cellules trois fois avec du PBS. Ensuite, détacher les cellules avec 0,5 ml de trypsine / EDTA et compter les cellules.
- Après détachement, centrifuger les cellules à 400 xg pendant 5 minutes, aspirer le milieu et remettre en suspension les cellules dans du PBS à une densité finale de 200 000 cellules / ml.
- Introduire à la pipette 100 ul de la suspension cellulaire obtenue (soit 20 000 cellules) dans une plaque de 96 puits et de mesurer la fluorescence de ces cellules dans un spectrophotomètre à fluorescence. Le paramètres pour les mesures de fluorescence sont mTHPC: 417 nm pour l'excitation et 652 nm pour l'émission.
- Pour calculer la quantité de mTHPC intériorisée par cellule, normaliser l'unité de fluorescence relative (RFU) pour le nombre de cellules et le volume des cellules de la manière suivante:
- Préparer une courbe d'étalonnage en utilisant des concentrations différentes de mTHPC dans du PBS 0-4 pg / ml (mesures en triple utilisation). Introduire à la pipette 100 ul de chaque dilution dans une plaque de 96 puits et de mesurer la fluorescence des puits en utilisant les paramètres décrits dans l'étape 1.6.
- Diviser la RFU (obtenu pour 20 000 cellules) par la pente de la courbe d'étalonnage linéaire de mTHPC, ce qui donne la concentration de mTHPC (en pg / ml) dans le puits.
- Diviser cette concentration mTHPC par 10 pour obtenir le montant total de mTHPC dans un puits (en ug, soit 100 pi de suspension cellulaire) et diviser cette valeur par le volume de 20.000 cellules.
- Calculer le volume de la formule pour une sphère: (4/3 x π) xr 3. Obtenir le rayon r en mesurant le diamètre de 20 cellules trypsinisées sous un microscope, et en divisant cette valeur par deux.
- Enfin, normaliser toutes les valeurs à celles obtenues pour les cellules HOS après 10 h d'incubation (dose d'absorption dépendant) ou traitées avec 10 pg / ml mTHPC (absorption en fonction du temps), ce qui a été défini à 100%.
2. Mesure de la phototoxicité de PS In Vitro
- Fleurs 3000 cellules / puits dans une plaque de 96 puits (triple pour chaque concentration de mTHPC utilisés) et permettent de faire adhérer la nuit. Préparer même une plaque de 96 puits supplémentaires et de traiter les cellules comme décrit ci-dessous, puis les mettre de côté pour l'imagerie de contraste de phase.
Remarque: le nombre doit être ajusté pour chaque ligne de cellule individuelle. A une confluence de 50 à 60% au moment de l'expérience est idéal.- Gardez à l'esprit pour ajouter le contrôle de toxicité dans l'obscurité correspondant de cellules pour chacune des concentrations mTHPC. Lasoi sont des cellules qui seront incubés en l'absence ou en présence de concentrations sélectionnées de mTHPC, mais ne sera pas allumé.
- Le jour suivant, incuber les cellules avec des concentrations différentes de mTHPC (0, 0,0001, 0,001, 0,01, 0,03, 0,075, 0,15, 0,3, 0,6, 1,25, 2,5, 5 et 10 pg / ml) en fonction des lignées cellulaires et les garder dans l'obscurité pendant 5 heures.
- Reportez-vous à la section 1.3.2
Remarque: Le temps d'incubation avant l'illumination dépend de la lignée cellulaire et le PS utilisé, par conséquent, il est recommandé de tester des concentrations différentes et de différents points dans le temps dans des expériences séparées.
- Reportez-vous à la section 1.3.2
- Après incubation pendant la période indiquée, laver les cellules deux fois avec du PBS et ajouter de nouvelles du milieu frais sans mTHPC.
- Éclairer les cellules avec une diode laser de 652 nm, spécifique pour le spectre d'absorption mTHPC (voir la figure 1).
- Réglez le laser à 21.88 mW / cm 2 puissance à une hauteur de 13,5 cm distance à partir des cellules, afin d'obtenir une dose d'énergie de 5 J / cm 2. Éclairer les cellules pour 230 sec. Ne pas éclairer les cellules sombres de contrôle de la toxicité (avec et sans mTHPC).
Remarque: Toujours porter des lunettes pour protéger les yeux de la lumière laser utilisée pour l'excitation du PS.
- Réglez le laser à 21.88 mW / cm 2 puissance à une hauteur de 13,5 cm distance à partir des cellules, afin d'obtenir une dose d'énergie de 5 J / cm 2. Éclairer les cellules pour 230 sec. Ne pas éclairer les cellules sombres de contrôle de la toxicité (avec et sans mTHPC).
- Après l'illumination, maintenir les cellules dans l'obscurité à 37 ° C pendant 24 heures. Par la suite, ajouter de l'eau tétrazolium soluble (WST-1) réactif (10 μl/100 ul de milieu).
- Trois heures après l'addition du réactif WST-1, mesurer l'absorbance de chaque puits de la plaque à 96 puits à 415 nm.
- Afin de calculer le pourcentage de cellules survivantes, réglez la moyenne des valeurs obtenues pour les cellules non traitées mTHPC pour chaque condition à 100% (c.-à-éclairés, sans mTHPC et non éclairée, sans mTHPC).
3. Estimation du nombre de cellules par Comptage des cellules
- Semences cellules 20000 / nousll dans une plaque de 24 puits et permettent de faire adhérer la nuit.
- Incuber les cellules pendant 5 heures avec mTHPC (0,001, 0,003, 0,15, 0,6, et 1,25 pg / ml) et de les illuminer, comme décrit ci-dessus.
- Recueillir le milieu, laver les cellules une fois avec du PBS, trypsiniser eux et à leur rassemblement par centrifugation à 400 g pendant 5 min.
- Après centrifugation, aspirer le milieu et remettre en suspension les cellules dans 200 ul de milieu frais.
- Compter les cellules dans une chambre de Neubauer.
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Representative Results
Avec les techniques ici rapportés, nous avons étudié PDT à base de mTHPC dans les cellules du système d'exploitation de l'homme. En premier lieu, l'heure et la dose d'absorption dépendant mTHPC a été étudiée dans le bas HOS métastatique et dans les lignées cellulaires hautement métastatiques 143B OS. mTHPC absorption peut être évaluée en mesurant la fluorescence de mTHPC avec un spectrophotomètre de fluorescence (figure 2, reproduite avec la permission de Reidy et al. 11). figure 2A illustre l'absorption de mTHPC d'une manière dépendante du temps. L'intensité de fluorescence de la suspension cellulaire représente les taux intracellulaires de mTHPC. Figure 2B illustre l'absorption dépendant de la dose de mTHPC dans les cellules HOS et 143B après 5 heures d'incubation. L'absorption dans la lignée cellulaire métastatique haute 143B avait tendance à être plus élevé que dans la ligne métastatique faible de cellules HOS parental.
Sombre et la phototoxicité de mTHPC en cellules 143B a été évaluée en déterminant la Metaboli cellulairel'activité de c (avec un dosage WST-1) et en comptant le nombre de cellules résiduelles après 5 h d'incubation avec mTHPC, une incubation ultérieure dans l'obscurité ou à un traitement avec une lumière laser de 230 secondes et une incubation supplémentaire pendant 24 h dans l'obscurité.
toxicité dans l'obscurité dépendante de la dose est représentée sur la figure 3 (reproduit avec la permission de Reidy et al. 11). Sur la figure 3A, les cellules 143B ont été traitées avec différentes doses de mTHPC et comparées aux cellules non traitées. Une diminution dose-dépendante du nombre de cellules et l'activité métabolique a été observée. La viabilité des cellules a diminué a été reconnu à une concentration mTHPC égaux et supérieurs à 2,5 pg / ml. Dose dépendante de la phototoxicité mTHPC est illustré sur la figure 3B. Les cellules ont été traitées avec différentes doses et avec mTHPC illumination subséquente (5 J / cm 2). Une diminution corrélative de l'activité métabolique des cellules (mesuré par le test WST), ainsi que d'une diminution de la nu cellulairembre a été observée. La diminution résultante du nombre de cellules après l'application de la PDT est visualisé sur la figure 4.
Figure 1. La structure chimique de mTHPC (A) et le spectre d'absorption de lumière (B). Les chiffres ont été fournis par biolitec Research GmbH. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Temps et de la dose absorption dépend de mTHPC par les lignées de cellules humaines OS HOS et 143B. (A). HOS (en gre y) et 143B (en noir) ont été ensemencées dans des plaques 6 puits (0,2 x 20 6 cellules / puits). Après culture pendant une nuit, les cellules ont été incubées avec 0,6 pg / ml mTHPC pendant 0, 2,5, 5, 7,5 et 10 h (A), ou pendant 5 heures avec 0, 0,6, 2,5 et 10 pg / ml mTHPC (B) . L'intensité de fluorescence a été déterminée en mesurant la fluorescence de 20 000 cellules à 652 nm après excitation à 417 nm. Les valeurs ont été normalisées au volume de cellule calculée et l'absorption mTHPC de cellules HOS à 10 h (A) ou après une incubation avec 10 pg / ml (B) a été fixé à 100%. Les valeurs sont la moyenne ± SEM de trois expériences indépendantes. Adapté de Reidy et al. 11 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3. Sombre et la phototoxicité de mTHPC en cellules 143B. Cellules ont été ensemencées et cultivées pendant une nuit avant le traitement. Pour déterminer la toxicité dose-dépendante sombre mTHPC, les cellules ont été incubées 143B pendant 5 heures dans l'obscurité, en l'absence ou en présence de concentrations mTHPC indiquées (A). Pour déterminer la dose mTHPC photo dépendante toxicité, les cellules 143B ont été incubées avec ou sans mTHPC pendant 5 heures à des concentrations indiquées, puis illuminés avec 5 J / cm 2 avec une puissance de 21,88 mW / cm 2 pendant 230 s (B). Pour les mesures de l'activité métabolique (●) avec le test WST-1, les cellules 143B ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à une densité de 3000 cellules / puits. Les nombres de cellules (○) ont été comptés à partir de cellules ensemencées à 20 000 cellules / puits dans des plaques à 24 puits. Les valeurs sont la moyenne ± SEM de trois expériences indépendantes. Fr Adaptéom Reidy et al. 11 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. des images à contraste de phase de cellules 143B avant et après PDT. cellules ont été ensemencées et laissées adhérer nuit tel que décrit dans le protocole. Pour visualiser dépendent de la dose, la toxicité médiée mTHPC lumière, les cellules ont été incubées 143B pendant 5 heures dans le noir avec 0, 0,6, 2,5 et 10 pg / ml mTHPC (panneaux AD, respectivement). Les cellules ont ensuite été illuminées avec 5 J / cm 2 de lumière de 652 nm de longueur d'onde 230 sec, et photographiées après 24 h. Barre d'échelle:. 100 um PlFacilité cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Pour atteindre la cytotoxicité optimale en réponse à la PDT, il est essentiel de choisir les bons réglages de lumière laser et des temps d'incubation. Les procédures décrites ici sont cohérentes et efficaces pour déterminer PS absorption et de quantifier la cytotoxicité induite par PDT in vitro. En utilisant les longueurs d'onde d'absorption spécifique de la PS mTHPC, l'absorption cellulaire de PS peut être déterminée d'une manière directe, et le PS peut être activé afin de générer des espèces réactives de l'oxygène cytotoxiques.
En utilisant cette configuration, in vitro, l'ensemble des paramètres tels que la concentration en PS, l'intervalle de la lumière de la drogue et de l'intensité de la lumière laser peuvent être facilement ajustées à des caractéristiques de la PS et les lignées cellulaires utilisées. Nombre d'éléments donne une lecture directe sur les cellules attachées survivants, qui, avec le WST-1 essai (suivi de l'activité métabolique) donne une bonne estimation de la survie des cellules. Cependant, la méthode présentée peut seulement modéliser le "premier coup", c'est à dire la toxicité cellulaireespèces oxygénées réactives de suite après l'activation du PS. In vivo observé vasoconstriction ultérieure et l'activation du système immunitaire, nécessaire pour l'éradication complète de la tumeur, ne peut être étudié chez les animaux.
La figure 2 montre un temps et dose dépendante de l'absorption mTHPC à un niveau plus élevé dans la 143B hautement métastatiques que dans sa faible lignée cellulaire HOS métastatique parental. MTHPC de toxicité dans l'obscurité dans des cellules OS 143B a été observée après une incubation de 5 heures seulement à des concentrations élevées (Figure 3). 143B cellules montrent une grande sensibilité à la PDT, représenté par le mTHPC et effet phototoxique dépendante de la dose de lumière. Un effet phototoxique a déjà été observé à une concentration mTHPC aussi bas que 0,075 pg / ml et une demi-concentration létale maximale de 0,022 ± 0,006 ng / ml a été observée (figure 3).
Bien que PDT est peu invasive et efficace contre le type de tumeur beaucoups, des effets secondaires mineurs peuvent se produire lors de l'application de la technique chez les patients (p. ex. gonflement, érythème). Ceci indique que le PS est non seulement absorbé par les cellules tumorales, comme montré ici, mais aussi par des cellules non tumorales, ce qui provoque une toxicité après PDT également dans ces cellules. Triesscheijn et al. Était en mesure de montrer une photosensibilité accrue des cellules tumorales par rapport à des fibroblastes humains. En revanche, les cellules endothéliales microvasculaires humaines ont montré une plus grande absorption de mTHPC que les autres lignées cellulaires testées, qui ont conduit à une photosensibilité élevée 12. Ces résultats sont aussi en corrélation avec des effets vasculaires des anti PDT associés, qui sont fréquemment observés 2.
Les méthodes décrites peuvent également être appliquées à d'autres PS. Le temps d'incubation et l'intensité de la lumière laser doivent être adaptés aux caractéristiques de la PS. En outre, la PDT peut aussi être induite dans des cellules autres que du système d'exploitation, étant donné que les paramètres sont la lignée cellulaire dépendante mais pas la méthode elle-même. R En plusaboutissants EAD, les mécanismes de mort cellulaire peuvent être analysés, par exemple. analyse par Western Blot des protéines impliquées dans l'apoptose, la nécrose ou autophagy. En outre la localisation subcellulaire de PS peut être visualisée par exemple par microscopie confocale à balayage laser.
Les différentes étapes qui ont été décrites pour la PDT in vitro, c'est-incubation des cellules avec le PS et l'induction de la PDT avec la lumière laser, ressemblent beaucoup à la situation clinique. Les patients reçoivent (iv ou sc. Appliquées) le PS, et après un intervalle de lumière de drogue distinctes, la zone d'intérêt (de tissu tumoral par exemple.) Est éclairé par une lumière laser 13. Bien que pas encore appliquée dans OS, ses avantages potentiels sont évidents; PDT est considéré comme particulièrement attrayant pour le traitement peropératoire de satellites de la tumeur, qui poussent souvent que la tumeur primaire cellulaires groupes proches de la jante principal de la tumeur primaire et peut engager une récidive quand manquer lors deurgical résection de la tumeur primaire. Même les grandes tumeurs osseuses peuvent être traités avec cette technique. Ceci a été démontré par une étude prometteur chez les chiens 14. En outre, l'éradication des cellules tumorales qui ne peuvent être réséquées par chirurgie (par exemple des métastases multiples survenant le plus souvent dans les poumons), peut également représenter une éventuelle application de la PDT chez les patients avec une maladie métastatique OS.
Il est important de noter que, tout en effectuant les expériences, il faut veiller à ce que toutes les étapes de travail sont effectuées sous exposition à la lumière minimale après l'ajout du PS aux cellules, comme la lumière du jour contient également la longueur d'onde nécessaire pour activer mTHPC. De même, pour l'application in vivo dans des modèles précliniques, des précautions doivent être prises pour protéger les animaux de la lumière après l'injection mTHPC. Il doit également être noté que le dosage WST-1 seulement évalue l'activité métabolique des cellules tumorales, ce qui est un indicateur indirect de la mort cellulaire. Donc, Une combinaison avec un nombre total de cellules, tel que présenté ici, est recommandé.
En conclusion, la combinaison des méthodes décrites (PS-absorption et la toxicité cellulaire induite par PDT) prévoit une procédure rapide et rentable pour caractériser les propriétés de toxicité d'un PS in vitro. Avec ces résultats in vitro, la gamme de l'intensité lumineuse optimale et l'intervalle de la lumière de médicament peut être estimée, ce qui donne une bonne indication de la PDT peut être appliqué in vivo.
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Disclosures
Les auteurs déclarent aucun intérêt ou conflits d'intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier biolitec Research GmbH (Jena, Allemagne) d'avoir bien voulu nous communiquer la formulation liposomale de mTHPC, avec des remerciements particuliers à Susanna Gräfe et Arno Wiehe pour leur aide et leur expertise technique. Nous tenons également à remercier Kerstin Reidy, qui a généré une grande partie des résultats et était coresponsable de sa publication 11.
Ce travail a été soutenu par des subventions du Schweizerischer Verein Balgrist, l'Université de Zurich, le Krebsliga Zurich ainsi que par une subvention de la Fondation Walter L. et loup Johanna, Zurich, Suisse et une subvention de EuroNanoMed ERA-NET / SNF suisse National Science Foundation 31NM30-131004/1. Ce travail a également été soutenu par le programme (très médecine spécialisée) de l'appareil locomoteur oncologie du canton de Zurich HSM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | PAA GmbH, Freiburg, Germany | E15-883 | |
| HAM F12 | PAA GmbH, Freiburg, Germany | E15-817 | |
| Heat-inactivated fetal calf serum | GIBCO, Basel, Switzerland | 10500-064 | |
| mTHPC | biolitec Research GmbH, Jena, Germany | As this liposomal formulation is originating from R&D no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5 mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; >99% purity) |
|
| Spectramax Gemini XS plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ID# 861 | |
| Microscope Zeiss Observer.Z1 | Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany | ||
| Ceralas PDT 652 nm Laser | biolitec AG, Jena, Germany | LD652nm2W400u | |
| Water-soluble tetrazolium (WST) reagent | Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland | 1644807 |
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