Summary
O protocolo relatado aqui permite a avaliação da eficácia da terapia fotodinâmica (PDT) em linhas de células e a optimização das condições de PDT, antes de aplicar a terapia em modelos animais.
Abstract
Nos últimos anos, tem sido a dificuldade em encontrar terapias mais eficazes contra o câncer com menos efeitos colaterais sistêmicos. Portanto Terapia Fotodinâmica é uma nova abordagem para um tratamento selectivo mais tumor.
Terapia Fotodinâmica (PDT) que faz uso de um fotossensibilizador não tóxico (PS), que, após a activação com luz de um comprimento de onda específico, na presença de oxigénio, gera radicais livres de oxigénio, que provocam uma resposta citotóxica 1. Apesar de sua aprovação há quase vinte anos pelo FDA, PDT hoje é apenas usado para tratar um número limitado de tipos de câncer (de pele, bexiga) e doenças nononcological (psoríase, queratose actínica) 2.
A principal vantagem da utilização da TFD é a capacidade de executar um tratamento local, o que evita os efeitos secundários sistémicos. Além disso, permite o tratamento de tumores em locais delicados (por exemplo, em torno de nervos ou vasos sanguíneos). Aqui, um intraoperataplicação ive do PDT é considerada no osteossarcoma (OS), um tumor do osso, para atingir satélites tumor primário deixado para trás em torno do tecido tumoral após a ressecção cirúrgica do tumor. O tratamento tem como objetivo diminuir o número de recidivas e na redução do risco de (pós-operatório) metástase.
No presente estudo, apresentamos in vitro procedimentos PDT para estabelecer as configurações PDT ideais para o tratamento eficaz de linhas de células do sistema operacional amplamente utilizados que são usados para reproduzir a doença humana em modelos do rato OS intratibial bem estabelecidos. A captação do PS mTHPC foi examinada com um espectrofotómetro e fototoxicidade foi provocado com a luz laser de excitação de mTHPC em 652 nm para induzir a morte celular avaliada com um ensaio de WST-1 e pela contagem de células sobreviventes. As técnicas estabelecidas nos permitem definir as configurações PDT ideais para futuros estudos em modelos animais. Eles são uma ferramenta fácil e rápida para a avaliação da eficácia da TFD
Introduction
Estado da arte do tratamento de osteossarcoma (OS) de hoje, um tumor ósseo primário, abrange uma combinação de quimioterapia adjuvante e neo cirurgia. Este regime de tratamento revelou um aumento na taxa de sobrevivência de pacientes com doença localizada a partir de cerca de 20% antes do uso de quimioterapia, a atualmente entre 60-70% 3, 4. No entanto, nas últimas duas décadas, a sobrevida global dos pacientes com doença do sistema operacional local tem plateaued 4, 5. Além disso, 30-40% dos pacientes com recaída no prazo de 3 anos após o diagnóstico e os pacientes com doença metastática continuam a ter uma fraca sobrevivência de 20-30% 4, 6, 7. Para melhorar o resultado de esses pacientes, novas estratégias terapêuticas têm de ser desenvolvidas.
Terapia Fotodinâmica (PDT), uma terapia anticâncer em vez novela, usa a luz de um comprimento de onda específico para a excitação de um photosensiTizer (PS), que se acumula nas células tumorais após a sua injecção na corrente sanguínea. A luz do laser de excitação do PS gera radicais de oxigénio, na presença de oxigénio, os quais induzem a reacção citotóxica em células tumorais e a morte celular. Além deste mecanismo primário, dois PDT adicional evocado processos biológicos contribuir para o crescimento do tumor reduzido: TFD causa a vasoconstrição e a formação de trombos da microcirculação do tumor e, consequentemente, a hipóxia e anóxia locais no interior do tumor, levando a enfarte do tumor. Finalmente, PDT feridos e moribundos células tumorais desencadear uma resposta imune local, uma característica bastante singular do PDT. Isto envolve o sistema do complemento e a activação das células apresentadoras de antigénios dendríticas 8. Assim, são criadas condições para a apresentação de antígenos tumorais com subsequente ativação de células linfóides, levando a imunidade específica do tumor.
Até agora, a terapia fotodinâmica tem sido utilizada para tratar diversos tipos de tumores de tecidos moles e hyperplásia de, como a ceratose actínica, esôfago de Barrett, tumores endobrônquica, câncer de bexiga, carcinomas basocelulares e tratamento paliativo de câncer de cabeça e pescoço 2. O tratamento é conhecido por induzir a necrose de grande escala local com apenas pequenos efeitos secundários, e, portanto, tem o potencial para eliminar selectivamente o tecido do tumor. Apesar destas vantagens, a aplicação de PDT permanece tecnicamente mais exigente do que a administração de fármacos quimioterapêuticos. A fim de atingir a eficácia máxima, a concentração de PS, o tempo de exposição à luz e de transferência total de energia de luz têm de ser optimizados. Isto pode ser feito em experiências in vivo, mas, por causa do grande número relativo de parâmetros que têm de ser optimizados, é mais eficiente para determinar inicialmente a condições óptimas in vitro.
Nas experiências descritas em seguida, testou-se a eficácia in vitro de PDT utilizando o PS 5,10,15,20-tetraquis-(meta-hidroxifenil) chlorin, abreviado mTHPC (Figura 1A). mTHPC é a substância activa do medicamento Foscan, que é usado atualmente na clínica para o tratamento paliativo de câncer de cabeça e pescoço. É um dos PS mais potente, induzindo enormes danos celulares já em baixas concentrações, e demonstrou-se ser superior a outras PS em termos de penetração do tecido 9, 10. O seu espectro de absorção de luz (Figura 1B) mostra dois picos proeminentes, uma em 417 nm e um segundo de 652 nm, que são utilizados para a localização de tecido de acumulação de PS e para a indução de PDT, respectivamente.
Atualmente, uma formulação lipossomal para mTHPC está em desenvolvimento. Aqui, descrevemos os procedimentos para quantificar a absorção desta formulação lipossomal, e para realizar PDT em duas linhas de células do sistema operacional humanos, o baixo HOS metastático e as células metastáticas 143B altos. Alguns dos dados aqui apresentados foram relatados anteriormente 11. The abordagem aqui descrita permite-nos estudar o efeito de um fenótipo metastático em PDT eficácia. Células 143B, ortotopicamente injetadas nos membros posteriores de ratos SCID imunodeficientes causar tumores primários metástase intratibial, um modelo que imita de perto a doença metástase humana. Assim, as experiências in vitro propostos são perfeitamente adequados para avaliar os ajustes de PDT óptimas para ser usado mais tarde em experiências in vivo.
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Protocol
1. Comparação da absorção de mTHPC no Baixo respectiva e altamente metastático HOS e 143B OS linhas celulares
- Prepare a meio de cultura celular contendo DMEM, F12 de Ham, e inactivado por calor soro fetal de vitelo numa 4.5:4.5:1 proporção.
Nota: A formulação lipossomal do PS mTHPC foi dissolvido em água a uma concentração final de 1,5 mg / ml mTHPC. - Placa de 0,2 x 10 6 e as células HOS 143B / poço em placas de 6 poços (triplica para cada condição) e deixar que as células aderir durante a noite.
Nota: o número não tem de ser ajustada para as linhas de células individuais. A confluência de 80-90% é o mais adequado para o tempo da experiência. - No dia seguinte, incubar as células com uma concentração fixa de mTHPC para diferentes períodos de tempo (tempo de absorção dependente), ou com concentrações crescentes de mTHPC durante um período de tempo fixo (dose de absorção dependentes).
- Incubar as células com mTHPC por tempo específico pontos ou concentrações de mTHPC.
Nota: Neste estudo, ambas as linhas de células HOS e 143B foram incubadas com 0,6 ug / ml mTHPC para 0, 2,5, 5, ou 10 horas, ou com 0, 0,6, 2,5, e 10 ug / ml mTHPC durante 5 horas. Os períodos de tempo aplicados e as dosagens podem variar dependendo da linha de células que é utilizado. - Lembre-se de trabalhar sempre no escuro ou em condições de iluminação se apagaram para evitar a exposição à luz direta das células.
- Após incubação das células com as condições indicadas, aspirar o meio e lava-se as células três vezes com PBS. Em seguida, retire as células com 0,5 ml de tripsina / EDTA e contar as células.
- Depois de descolamento, centrifugar as células a 400 xg durante 5 min, aspirar o meio e ressuspender as células em PBS para uma densidade final de 200.000 células / ml.
- Pipete 100 pi da suspensão de células obtida (ou seja, 20.000 células) em uma placa de 96 poços e medir a fluorescência destas células em um espectrofotómetro de fluorescência. A definiçãos para medições de fluorescência mTHPC são: 417 nm para a excitação e 652 nm para a emissão.
- A fim de calcular a quantidade de mTHPC interiorizada por célula, a unidade de normalizar a fluorescência relativa (RFU) para o número de células e volume de células como se segue:
- Prepara-se uma curva padrão, utilizando diferentes concentrações de mTHPC em PBS 0-4 ug / ml (medidas em triplicado) utilização. Pipetar 100 l de cada diluição numa placa de 96 poços e medir a fluorescência dos poços, utilizando as definições descritas no passo 1.6.
- Dividir a RFU (obtido por 20000 células) pela inclinação da curva de calibração linear de mTHPC, que dá a concentração de mTHPC (em ug / ml) no poço.
- Dividir esta concentração mTHPC por 10 para obter a quantidade total de mTHPC num poço (em ug, representando 100 ul de suspensão de células) e dividir esse valor, o volume de 20000 células.
- Calcular o volume com a fórmula para uma esfera: (4/3 x π) xr 3. Obter o raio r medindo o diâmetro de 20 células tratadas com tripsina sob um microscópio, e dividindo esse valor por 2.
- Finalmente, normalizar todos os valores para os obtidos para as células HOS após 10 horas de incubação (dose de absorção dependente) ou tratadas com 10 ug / ml mTHPC (tempo de absorção dependente), que foram definidos como 100%.
2. Medição da fototoxicidade do PS In Vitro
- Semente de 3.000 células / poço numa placa de 96 cavidades (triplicados para cada concentração de mTHPC utilizado) e deixá-los aderir durante a noite. Similarmente preparar uma placa de 96 poços adicional e tratar as células, tal como descrito abaixo, mas, em seguida, colocá-los de lado para a imagem de contraste de fase.
Nota: o número tem que ser ajustada para cada linha celular individual. A confluência de 50-60% no tempo da experiência é ideal.- Tenha em mente para adicionar o correspondente controlo de toxicidade no escuro de células para cada uma das concentrações mTHPC. Ose, são as células que irão ser incubadas na ausência ou na presença de concentrações seleccionadas de mTHPC, mas não irá ser iluminada.
- No dia seguinte, incubar as células com diferentes concentrações de mTHPC (0, 0,0001, 0,001, 0,01, 0,03, 0,075, 0,15, 0,3, 0,6, 1,25, 2,5, 5, e 10 ug / ml), dependendo das linhas de células e mantê-los no escuro por 5 horas.
- Consulte a Seção 1.3.2
Nota: O tempo de incubação antes da iluminação depende da linha celular e do PS usado, por conseguinte, é aconselhável para testar diferentes concentrações e em diferentes pontos de tempo em experiências separadas.
- Consulte a Seção 1.3.2
- Após a incubação para o período de tempo indicado, lavar as células duas vezes com PBS e adicionar novo meio fresco sem mTHPC.
- Iluminar as células com um diodo laser de 652 nm, específico para o espectro de absorção mTHPC (ver Figura 1).
- Defina a laser para 21,88 mW / cm 2 poder a uma altura de 13,5 centímetros distance a partir das células, a fim de obter uma dose de energia de 5 J / cm 2. Iluminar as células para 230 seg. Não iluminar as células controle toxicidade escuras (com e sem mTHPC).
Nota: Use sempre óculos para proteger os olhos da luz do laser usado para a excitação do PS.
- Defina a laser para 21,88 mW / cm 2 poder a uma altura de 13,5 centímetros distance a partir das células, a fim de obter uma dose de energia de 5 J / cm 2. Iluminar as células para 230 seg. Não iluminar as células controle toxicidade escuras (com e sem mTHPC).
- Depois de iluminação, manter as células no escuro a 37 º C por 24 horas. Posteriormente, adicione água de tetrazólio solúvel (WST-1) reagente (10 μl/100 mL de meio).
- Três horas após a adição do reagente WST-1, mede-se a absorvância dos poços individuais da placa de 96 poços a 415 nm.
- A fim de calcular a percentagem de células sobreviventes, definir a média dos valores obtidos para as células não tratadas mTHPC para cada condição de 100% (ou seja iluminado, sem mTHPC e nonilluminated, sem mTHPC).
3. Estimativa de número de celular por contagem celular
- Semente 20.000 células / nósll em uma placa de 24 poços e deixá-los a aderir durante a noite.
- Incubar as células durante 5 horas com mTHPC (0,001, 0,003, 0,15, 0,6 e 1,25 ug / ml) e iluminá-los, tal como descrito acima.
- Recolhe-se o meio, lavar as células uma vez com PBS, trypsinize los e recolhê-las por centrifugação a 400 xg durante 5 min.
- Após a centrifugação, aspirar o meio e ressuspender as células em 200 ul de meio fresco.
- Contar as células em uma câmara de Neubauer.
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Representative Results
Com as técnicas aqui relatadas, investigamos PDT-based mTHPC em células do sistema operacional humanos. Primeiro, o tempo e a dose de absorção dependente mTHPC foi investigada no baixo HOS metastático e nas linhas de células 143B OS altamente metastáticas. mTHPC absorção pode ser avaliada através da medição da fluorescência de mTHPC com um espectrofotómetro de fluorescência (Figura 2, reproduzida com a permissão do Reidy et al. 11). Figura 2A ilustra a absorção de mTHPC de um modo dependente do tempo. A intensidade da fluorescência da suspensão de células representa os níveis intracelulares de mTHPC. Figura 2B ilustra a dose absorção mTHPC dependente em células HOS e 143B após 5 horas de incubação. A absorção na linha de células metastática elevada 143B tendeu a ser mais elevada do que na linha celular parental HOS metastático baixo.
Escuro e fototoxicidade de mTHPC em células 143B foi avaliada pela determinação da célula metabolicamenteactividade de c (com um ensaio de WST-1) e por contagem do número de células residuais depois de 5 horas de incubação com mTHPC, subsequente incubação no escuro ou o tratamento com luz de laser para 230 seg e outra incubação durante 24 horas no escuro.
Dependente da dose toxicidade no escuro é mostrado na Figura 3 (reproduzido com permissão de Reidy et al. 11). Na Figura 3A, as células 143B foram tratadas com diferentes doses mTHPC e em comparação com as células não tratadas. Foi observada uma diminuição dependente da dose do número de células e actividade metabólica. Diminuição da viabilidade celular foi reconhecida com uma concentração igual mTHPC e maior do que 2,5 ug / ml. Dose fototoxicidade dependente de mTHPC é ilustrado na Figura 3B. As células foram tratadas com diferentes doses mTHPC e com iluminação posterior (5 J / cm 2). Uma diminuição consequente da actividade metabólica celular (medido com o ensaio de WST), bem como uma diminuição na nu célulamber foi observada. A resultante diminuição no número de células após a aplicação de PDT é visualizado na Figura 4.
Figura 1. Estrutura química de mTHPC (A) e o espectro de absorção de luz (B). Segundo os dados fornecidos pelo biolitec Research GmbH. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Dose e do tempo de absorção dependente mTHPC pelas linhas celulares humanas OS HOS e 143B. (A). HOS (em gre y) e 143B (em preto) foram semeadas em placas de 6 poços (0,2 x 20 6 células / poço). Após a cultura durante a noite, as células foram incubadas com 0,6 ug / ml mTHPC para 0, 2,5, 5, 7,5 e 10 horas (A), ou durante 5 horas com 0, 0,6, 2,5, e 10 ug / ml mTHPC (B) . A intensidade da fluorescência foi determinada através da medição da fluorescência de 20.000 células em 652 nm após excitação a 417 nm. Os valores foram normalizados para o volume da célula e a absorção calculado mTHPC de células HOS em 10 h (A) ou após a incubação com 10 ng / ml (B) foi definida como 100%. Os valores são a média ± SEM de três experiências independentes. Adaptado de Reidy et al. 11 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3. Escuro e fototoxicidade de mTHPC em células 143B. As células foram semeadas e cultivadas durante a noite antes do tratamento. Para determinar a dose mTHPC dependente toxicidade no escuro, as células 143B foram incubadas durante 5 horas no escuro, na ausência ou presença das concentrações indicadas mTHPC (A). Para determinar a dose mTHPC foto toxicidade dependente, células 143B foram incubadas com ou sem mTHPC durante 5 h nas concentrações indicadas e, em seguida, iluminado com 5 J / cm 2, com uma potência de 21,88 mW / cm 2 para 230 seg (B). Para as medições da actividade metabólica (●) com o ensaio de WST-1, células 143B foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 3000 células / poço. Os números de células (○) foram contados a partir de células semeadas em 20.000 células / poço em placas de 24 poços. Os valores são a média ± SEM de três experiências independentes. Fr Adaptadoom Reidy et al. 11 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Imagens de contraste de fase de células 143B, antes e após a PDT. Células foram semeados e deixados a aderir durante a noite, como descrito no protocolo. Para visualizar dependente da dose, mTHPC toxicidade mediada luz, células 143B foram incubadas durante 5 horas no escuro, com 0, 0,6, 2,5, e 10 ug / ml mTHPC (painéis AD, respectivamente). As células foram então iluminado com 5 J / cm 2, a luz de comprimento de onda de 652 nm para 230 seg, e fotografadas após 24 hr. Barra de escala:. 100 mm Please clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Para alcançar citotoxicidade ideal em resposta a PDT, é fundamental para escolher as configurações de luz de laser direita e tempos de incubação. Os procedimentos aqui descritos são consistentes e eficiente para determinar a absorção de PS e para quantificar a citotoxicidade induzida por PDT, in vitro. Usando os comprimentos de onda de absorção específicas do PS mTHPC, a absorção PS celular pode ser determinada de um modo directo, e o PS pode ser activada para gerar espécies reactivas de oxigénio citotóxicos.
Utilizando esta configuração, in vitro, todos os parâmetros tais como a concentração de PS, intervalo luz droga e a intensidade da luz do laser pode ser facilmente ajustado para as características do PS e das linhas celulares utilizadas. A contagem de células dá uma leitura direta de sobreviventes células aderidas, que juntamente com o ensaio de WST-1 (monitoramento da atividade metabólica) dá uma boa estimativa para a sobrevivência da célula. No entanto, o método apresentado apenas pode modelar o "primeiro hit", isto é, a toxicidade celularespécies reativas de oxigênio de imediatamente após a ativação do PS. A in vivo observada conseqüente vasoconstrição e ativação do sistema imunológico, necessário para a erradicação do tumor completo, só podem ser investigados em animais.
Figura 2 demonstrou um tempo e dose de absorção dependente de mTHPC para um nível superior no 143B altamente metastática do que em seu baixo linha celular HOS metastático dos pais. Toxicidade no escuro de mTHPC em células OS 143B foi observada após incubação durante 5 horas apenas em concentrações elevadas (Figura 3). Células 143B mostram uma alta sensibilidade ao PDT, mostrado pelo mTHPC e dose de luz efeito phototoxic dependente. Um efeito fototóxico foi já observado a uma concentração de mTHPC tão baixa como 0,075 g / ml, e uma metade da concentração letal máxima de 0,022 ± 0,006 ug / ml foi observado (Figura 3).
Embora PDT é minimamente invasivo e eficaz contra o tipo de tumor muitoss, menores efeitos colaterais podem ocorrer quando se aplica a técnica de pacientes (p. ex. inchaço, eritema). Isto indica que o PS não é apenas absorvido pelas células tumorais, como mostrado aqui, mas também por células não tumorais, causando toxicidade após PDT também nestas células. Triesscheijn et al. Foi capaz de demonstrar um aumento de fotossensibilidade das células tumorais em comparação com fibroblastos humanos. Em contraste, as células endoteliais microvasculares humanas mostrou uma maior aceitação das mTHPC do que as outras linhas celulares testadas, o que levou a uma alta fotossensibilidade 12. Estes resultados também se correlacionam com efeitos vasculares anti PDT associados, que são freqüentemente observadas 2.
Os métodos descritos podem também ser aplicados para a outra PS. O tempo de incubação e da intensidade de luz laser têm de ser adaptadas às características do PS. Além disso, a TFD pode também ser induzida em células que não sejam do sistema operacional, uma vez que apenas as definições são a linha celular dependente, mas não o próprio método. R Como adicionalead saídas, os mecanismos de morte celular pode ser analisada, por exemplo. por análise de Western blot de proteínas envolvidas em apoptose, necrose ou autofagia. Além disso, a localização subcelular de PS pode ser visualizada, por exemplo por meio de microscopia confocal de varrimento laser.
Os diferentes passos que têm sido descritos para a TFD in vitro, ou seja, a incubação das células com o PS e indução de PDT com a luz do laser, assemelham-se de perto a situação clínica. Os pacientes recebem (iv ou sc. Aplicada) a PS, e depois de um intervalo de luz distintas de drogas, a área de interesse (por exemplo, o tecido do tumor.) É iluminado com a luz do laser 13. Embora ainda não seja aplicada em SO, os seus potenciais vantagens são evidentes; PDT é considerado ser particularmente atraente para o tratamento de tumores intra-operatória de satélites, que normalmente crescem como aglomerados de células de tumor primário perto da borda principal do tumor primário e pode dar início a uma repetição quando perdeu durante sressecção urgical do tumor primário. Mesmo grandes tumores ósseos podem ser tratados com esta técnica. Isto tem sido demonstrado por um estudo promissor em cães 14. Além disso, a erradicação de células tumorais que não podem ser ressecados por cirurgia (por exemplo, múltiplas metástases ocorrem principalmente nos pulmões), pode também representar uma possível aplicação futura do PDT em pacientes com doença metastática OS.
É importante notar que, durante a execução das experiências, cuidado deve ser tomado para que todas as etapas de trabalho são realizadas sob exposição à luz mínimo após a adição do PS para as células, como a luz do dia normal, também contém o comprimento de onda necessário para activar mTHPC. Da mesma forma, para aplicação in vivo em modelos pré-clínicos, o cuidado deve ser tomado para proteger os animais da luz direta após injetar mTHPC. Também deve ser notado que o ensaio de WST-1 apenas avalia a actividade metabólica das células tumorais, o que é um indicador indirecto da morte celular. Portanto, Uma combinação com uma contagem total de células, como apresentado aqui, é recomendado.
Em conclusão, a combinação dos métodos descritos (PS-absorção e de toxicidade celular induzida por PDT) proporciona um processo rápido e de baixo custo para caracterizar as propriedades de toxicidade de um PS in vitro. Com estes resultados in vitro, a gama da intensidade de luz óptima e o intervalo de luz droga pode ser estimada, o que lhe dá uma boa indicação de como PDT pode ser aplicado in vivo.
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Disclosures
Os autores declaram não competindo interesses financeiros ou conflitos de interesses.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer biolitec Research GmbH (Jena, Alemanha) para gentilmente nos fornecer a formulação lipossomal mTHPC, com um agradecimento especial a Susanna Gräfe e Arno Wiehe pela sua ajuda e conhecimento técnico. Também gostaria de agradecer a Kerstin Reidy, que gerou uma grande parte dos resultados e foi co-responsável por sua publicação 11.
Este trabalho foi financiado por doações do Schweizerischer Verein Balgrist, da Universidade de Zurique, o Krebsliga Zurique, bem como por uma concessão do Walter L. e Johanna Lobo Foundation, Zurich, na Suíça e uma bolsa da EuroNanoMed ERA-NET / SNF suíço National Science Foundation 31NM30-131004/1. Este trabalho também foi apoiado pelo programa (altamente especializada Medicine) para Musculoskeletal Oncology da Kanton Zurich HSM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | PAA GmbH, Freiburg, Germany | E15-883 | |
| HAM F12 | PAA GmbH, Freiburg, Germany | E15-817 | |
| Heat-inactivated fetal calf serum | GIBCO, Basel, Switzerland | 10500-064 | |
| mTHPC | biolitec Research GmbH, Jena, Germany | As this liposomal formulation is originating from R&D no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5 mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; >99% purity) |
|
| Spectramax Gemini XS plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ID# 861 | |
| Microscope Zeiss Observer.Z1 | Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany | ||
| Ceralas PDT 652 nm Laser | biolitec AG, Jena, Germany | LD652nm2W400u | |
| Water-soluble tetrazolium (WST) reagent | Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland | 1644807 |
References
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