マウスモデルにおける子宮卵管胚移植と精管切除

Summary

子宮卵管胚移植は、子宮の転送を実行するときに発生する可能性があり、胚の流出を防止するためのバリアとして子宮卵接合を使用しています。精管切除雄は、胚移植のための偽妊娠レシピエントを得るために必要とされる。両方の技術が議論されている。

Abstract

サロゲートメス着床前の胚の転送は、その後の胎児の発育と成人健康上の着床前の開発中に発信し遺伝子改変マウスを製造するための、またはエピジェネティックな変化の影響を研究するために必要なステップです。効果的かつ一貫性のある胚移植技術の使用は、遺伝子改変動物の発生を増強する用語に移植率及び生存率に対する異なる処理の効果を決定するために重要である。胚盤胞期の胚は、通常、胚操作ピペットを導入するために子宮壁内の穿刺を行い、子宮転送により転送される。ピペットが取り下げられた、胚による子宮の正圧に腹腔へ流出することができた後に子宮に行わオリフィスは閉じません。パンクにも、移植性を損なう出血を生成することができ、ブロック転送ピペットおよび胚Dに影響を与える可能性が透明帯のない胚が転送され、特にevelopment、。従って、この技術は、しばしば非常に可変と全体的に低い胚の生存率をもたらす。これらの負の影響を回避、子宮卵管胚移植、胚流出を妨げる天然バリアとしての子宮卵管接合を利用して、子宮壁の穿刺を避ける。精管切除した雄は、偽妊娠の受信者を取得するために必要とされる。精管切除を行うための技術が子宮卵管胚移植を補完するものとして記載されている。

Introduction

胚移植は、おそらくマウスモデルで実行される最も頻繁な外科的処置である。この技術は、 インビトロでの操作技術に供胚から子孫を得ることが不可欠であり、したがって、前核注入、レンチウイルス形質導入、またはキメラ形成による遺伝的に改変されたモデルの開発のために必要なステップを構成している。しかも、この技術は、着床前の開発中に発生する多様な侮辱の発達への影響の研究を可能にする。人工生殖技術¹または別の物質または代謝物²の異常な濃度への暴露の使用は、移植や胎盤形成の障害と子孫における長期的な効果をもたらした胚の発達に影響を及ぼす可能性があります。信頼性と再現性胚移植技術は、一貫性のある人間に移植すると、胎児の発育に関する実験的治療の可能性のあるマイナスの効果をテストすることが重要であるNER。

マウス着床前胚は、0.5日後に交尾の膨大部（DPC）偽妊娠レシピエント（卵管転送^）3,4または2.5のDPC偽妊娠レシピエントの子宮に（子宮転送^）5,6を経由して卵管にどちらレシピエント雌に転送することができます彼らの発達段階に応じて。このような胚または誘導多能性幹細胞の注入によってキメラマウスを生成するために使用されるもののような胚盤胞段階の胚は、通常、子宮転送により転送される。胚盤胞は、また0.5 DPC受信者の卵管に転送することができますが、胚は休眠を受け、注入が行われる前に発作から回復する2日間を持っているので、それは、発達かく乱にはあまり生理的テストを構成している。子宮内移植は、子宮腔への胚操作ピペットのアクセスを可能にする開口部を生成するために、狭い針で子宮壁に穴をあけることを含む。 Althoughこの技術は良い結果を得ることができ、長期の生存が（ つまり PUPに開発移植胚の割合）は、多くの場合、低および^7,8予測不可能である。

子宮壁の穿刺は、いくつかの有害な副作用を伴う。まず、子宮筋層が高度に血管組織であり、その穿刺は、多くの場合、小さな出血が生じる。血液は胚移植ピペットをブロックしたり、胚の死および/または着床不全の原因となる子宮内腔に侵入​​することができる。血液細胞および破片が割球に取り付けることができるように、 透明帯のない胚は、転送されるとき、これは特に関連する。胚が転送された後第行わ開口は密封しないので、オリフィスを通って流れることができ、大きすぎる体積が子宮内に導入されたときに腹腔に排出される。ここに記載さ子宮卵管胚移植はEMBRを提供するために子宮卵管接合を利用する子宮壁を穿刺し、それによってその有害な結果^9を回避する必要なく、子宮へヨーヨー。

胚移植のために使用偽妊娠レシピエント雌を精管切除した雄⁸と自然交配により得られる。雄性不稔で生成精液の分泌物が移植胚を受け入れるになるために子宮のために必要とされる。受信者を取得するには、生後6ヶ月〜8週間の2人の女性の最大は午後精管切除雄と配置されます。翌朝、雌を膣交尾プラグ、雄精液から凝固タンパク質の塊の存在がチェックされます。交配は通常、深夜中に発生するように、膣プラグ検出の日は0.5 DPCであると考えられている。精管切除した雄は、いくつかのベンダーから購入することができますが、ここに記載さの外科的処置は、比較的容易であり、胚移植のために必要とされるよりも、追加の機器を必要としない。

Protocol

全ての動物実験は、米国農務省動物実験ガイドラインに従ってベルツヴィルエリア動物管理使用Comittees（BAACUC 11から015）によって承認された。

1。麻酔および鎮痛（外科的処置の両方に共通）

1. マウスを計量し、27 Gの針を2 1ミリリットルの注射器で、次の麻酔薬や鎮痛剤をロードします。
   1. ケタミン（0.1ミリグラム/グラム：0.01ミリリットル/ 10 mg / mlの溶液）およびキシラジン（0.01ミリグラム/グラム：2 mg / mlの溶液0.005ミリリットル/ g）。
   2. ブプレノルフィン（0.1μgの/ G：0.01 mg / mlの溶液を0.01ミリリットル）。
2. 親指と人​​差し指で、できるだけ顎の近くの首筋を拾っ少しと薬指の間に尾を保持することによって、マウスを固定。
3. 腹腔内にケタミン-キシラジン混合物を注入する。臓器に穿刺を回避するために、マウスを保持してわずかに腰のレベルの下に頭（ 図1A）
4. 親指と人差し指（ 図1B）との間にネックホールドの首筋にブプレノルフィンを皮下注射する。
5. 暖かいステージに（きれいで、他の動物なしで）ケージにマウスを残す。
6. 意識不明たら、（足指のピンチによって確認された） 後足反射の不在を確認してください。目の乾燥を回避し、 眼瞼反射 （ 図1C）がないことをチェックするために眼軟膏を適用します。
7. このプロトコルは、（プロトコル2および3）の下に記載の手順を実行するのに十分な30分の最小ための外科麻酔面を提供する。より長い時間が必要な場合は、1.1.1に記載の投薬量の半分でケタミン+キシラジンの追加の注射を30分後に適用することができる。より速く、不規則なものと呼吸パターンの変化が見よを示す適切な麻酔面のSS。

2。精管切除

1. 実績のある嵌合性能とオスを使用してください。
2. 、手術器具を滅菌手術が行われる表面を洗浄し、70％エタノールで拭いてください。
3. 反射の消失をチェックする、（プロトコル1）以前に詳述されるように麻酔を行う。
4. 暖かいステージにマウスを置き、2架空の横方向の線の間の腹側領域から電気バリカンで毛を取り除く 0.5センチメートルとペニス（ 図2A）上記2.5センチメートルを置いた。
5. 10％ポビドンヨードおよび70％エタノールで連続的なワイピングで剃毛面積を消毒 。
6. 剃毛面積を露出する穴と、滅菌タオルで外科医やカバーに向けた尻尾と仰臥位でマウスを置きます。手術領域を照らす。
7. 10〜15ミリメートル縦肌を実行incisionは約1cmペニス上腹部の内側のラインで。鋸歯状の鉗子をドレッシングしてから（ 図2Aおよび2B）ハサミでカットして肌を保持する。
8. 白線 5〜10mmの縦切開を行う。鋸歯状の鉗子をmicrodissectingで筋肉を持ち、ハサミ（ 図2C）で切断した。
9. 鋸歯状の鉗子を解剖マイクロ片側の睾丸脂肪パッドを取得し、 精巣を露出させ 、それを引っ張って、 輸精管と精巣上体 。 精管が同様の精巣壁に取り付けられていない（精巣に内側に位置しており、それが明確に区別自由チューブです血管が1辺（ 図2D）に沿って走ると精巣上体）。
10. 彼らは赤になるまでのマイクロ解剖鋸歯鉗子、 炎ドレッシング鉗子で輸精管を保持している （ 図2E 図2F）を一度に2点が精管を切断して焼灼するためにそれらを使用して栄>）、および。カットは約5ミリメートルの部分を削除し、2明確に分離焼灼終了する（ 図2G）のままにする必要があります。
11. 戻って腹腔へ睾丸、精巣上体と精管を移動します。
12. 他の睾丸のステップ9から進んでください 。
13. 5/0吸収性縫合糸（ 図2H）で作られた1つまたは2つの水平マットレスステッチで筋肉を縫合 。
14. 1または2の創傷切り（ 図2I）で皮膚を縫合 。
15. vasectomised男性の識別（耳のリング、指の入れ墨を...）、 それは麻酔から回復するまでケージは暖かいステージ上に配置して観察を移動（意識し胸骨横臥を維持）。温かい生理食塩水の0.5〜1ミリリットル皮下注射は、再を改善するcovery。精管切除の転送中に発生する可能性の発生率を記録して、飲料水に抗生物質を追加します。
16. 創傷クリップは、10日間創傷クリッパー除去や歯ピンセットで精管切除後に除去することができる。精管切除の男性で、手術後2週間の交尾できるようになります。
17. 受信者を取得するためにそれを使用する前に、肥沃な雌と交配させることにより精管切除のオスの不妊をテストします 。

3。子宮卵管胚移植

1. マウス桑実胚または胚盤胞は2.5 DPCでの偽妊娠レシピエント雌に、この技術によって転送することができます。
2. 胚操作用ガラスピペットを準備します。
   1. ピペットホルダーの損傷を防ぐために、ガラスキャピラリーの先端を磨く。
   2. 少し回転させながら、細かい炎で加熱することにより、ガラスキャピラリの中央部を柔らかく同期両手で毛細血​​管。キャピラリー部は（光赤色）柔らかく可鍛性になると、炎からすぐにそれを撤回し、130〜150程度に、その外径を狭める両端を引っ張る 。
   3. クールダウンしてから軽くダイヤモンドポイントの鉛筆、砥石や爪やすりで狭い部分を得点し、両側から引っ張って、それをカットするガラスのを待ちます。ブレークがきれいに垂直である必要があり
3. 100〜130ミクロンの開口部を残して、非常に迅速に燃えることで先端を磨く 。ピペットは、後で使用するために保存することができる。
4. 暖かい胚操作メディア （CZBHまたはM2は、説明を参照してください）。
5. 、手術器具を滅菌手術が行われる表面を洗浄し、70％エタノールで拭いてください。
6. 反射の消失をチェックする、（プロトコル1）以前に詳述されるように麻酔を行う。
7. Tを維持彼温かいステージ上でマウス、膝と遠位リブ（ 図3Aと図3B）との間の背側領域から電気バリカンで毛を削除します 。
8. 10％ポビドンヨードおよび70％エタノールで連続的なワイピングで剃毛面積を消毒 。
9. あらかじめ温めておいた胚操作メディアにインキュベーターから胚を移動します 。
10. 実体顕微鏡下で暖かい舞台に受信者を移動し、（その頭を右または外科医の左側に見て）外科医に横方向に発生しやすい位置に配置します。
11. 剃毛面積を露出する孔を、滅菌タオルでエリアをカバーし、手術領域を照らす。
12. 最後の肋骨と腰と背中と腹部（ 図3Aの Aとの間のラインの背⅓の間の線の頭蓋⅓に位置してスポットにおける皮膚中の 1cmの横方向（垂直方向） の切開を行うND 3B）。鋸歯状の鉗子をドレッシングで皮膚を持ち、ハサミ（ 図3C）で切断した。
13. 皮膚が切断されると、卵巣（赤/オレンジ）または卵巣（白色）を囲む脂肪パッドは、体壁を介して視覚化することができる。切開は任意の大血管を切断しないスポットでの卵巣または脂肪パッド上で体壁に 0.3〜0.5センチ、横方向（垂直方向） の切開を行う。マイクロ解剖鋸歯鉗子で筋肉を持ち、ハサミ（ 図3D）で切断した。
14. その頭は外科医に向いているようにマウスを移動します。
15. 胚操作用ピペット （ 図3E）をロードします 。
    1. CZBHメディアが広い部分の約5ミリメートルまでの操作ピペットの狭い部分を通って毛細管現象によって上昇することができます。
    2. 小さな気泡（0.2〜0.5ミリメートル）を取り上げる。
    3. で胚（5-10）を導入メディアの最小量（2-4 mm）である。
    4. 別の小さな気泡（0.2〜0.5ミリメートル）とメディアの少量（0.5〜mm）を取り上げる。
    5. ステップ3.17の準備ができて、口の吸引器ホルダーにまたは手動デバイスに接続されているガラスピペットのままにしておきます。
16. マイクロ解剖鋸歯ピンセットで卵巣周囲の脂肪パッドを取得し、 卵巣、卵管、および腹腔のうち上部の子宮の小さい部分（ 図3Fおよび3G）を公開するために、マウスの頭の方に引き出します。
17. 卵管を移動し、（卵管が子宮を満たしているIE）子宮卵管接合部を露出させたマイクロ解剖鋸歯鉗子で脂肪パッドをつかむ、使用できるようになり、口の中で吸引器マウスピースを保持している。
18. アクセス可能な子宮卵管接合を維持する（右利きの場合）、左手でわずかに湾曲したマイクロ解剖鉗子を取るとすぐ下に配置しますその部分の上2ミリメートル程度の卵管をつかんで子宮卵管接合。
19. わずかに湾曲したマイクロ解剖鉗子で子宮卵管接合部を保持している、27のG針（ 図3H）を鉗子に近い卵管部分を穿刺 。
20. 子宮卵管接合（ 図3Iおよび3J）を介して子宮に針を事前に実施したオリフィスに胚操作用ピペットを挿入します 。ピペットは子宮卵管接合（ 図3K）を通過すると、簡単にスライドします。破片による子宮内膜の損傷（NO 3mm以下）とピペットブロッキングを防止するために、子宮に非常に遠く進まないでください。
21. 優しく（ 図3L）を吹き込んで子宮に胚を解放します 。両方の気泡が子宮を通過しなければならない。最初のバブルの上にあるメディアの中にはまた、子宮内に放出しますが、着床を妨げる可能性がある、より多くの空気を導入することを避けることができる。
22. 胚が子宮内に放出された直後に、ピペットを削除します 。
23. 脂肪パッドをつかんで戻って腹腔への卵管と卵巣を移動します。
24. 5/0吸収性縫合糸（ 図3M）水平マットレスステッチで筋肉を縫合 。
25. 創傷クリッパー（ 図3N）で皮膚を縫合する 。
26. 必要に応じて反対側にステップ10から続行する。
27. 、受信者（耳のリング、指の入れ墨を...）を特定（ウォームステージ上に配置）、そのケージに移動して、麻酔から回復するまで観察 （意識し胸骨横臥を維持）。
28. 胚移植時に発生する可能性の発生率に注釈や飲料水に抗生物質を追加します。暖かいのSalIの0.5〜1ミリリットルを皮下注射NEのソリューションは、回復を向上させます。
29. 創傷クリップは、10日間創傷クリッパー除去または鉗子（ 図3O）の2つの対を有する胚移植後に除去することができる。受信者は、妊娠を評価し、仔の数を推定するために、その日に計量することができます。 15日胚移植後に受信者に寄り添う材料を提供する。

Representative Results

子宮卵管胚移植は、子宮胚移植^2,9,10に関連する合併症のいくつかを回避子宮に胚を転送する手段を提供する。 表1に、我々は我々が説明したプロトコルに従って、CD1受信者に操作の異なる種類の対象CD1胚盤胞を転送取得しているいくつかの代表的な結果を示す。項（PUP、その結果胚の％）または（レンチウイルス曝露の場合）E15に生存への生存は受精卵の段階（IVC）からin vitroで単純に培養された胚、キメラの仔を生成するために、IPSC注入を受けた胚間で類似しているおよびそれらの帯を有していた胚を除去し、胚移植の前に7時間レンチウイルスに曝露した。したがって、子宮卵管胚移植は、特に、 透明帯を欠いたものなど、複雑でレンチウイルスを培養した胚を転送するための信頼性の高い技術です。

図1。眼軟膏の麻酔薬や鎮痛薬を注射。A）ケタミン-キシラジンの腹腔内注射。B）ブプレノルフィンの皮下注射。C）アプリケーション。

図2。 。精管切除プロトコールA）切開点（赤い「X」で示される）約1cmのペニスの上に配置されている】。ペニス上記0.5〜2.5センチ（黒線）から毛皮を取り除くB）皮膚切開C）筋切開。 D） 精管 （黒矢印）とテスト（*）、E）を一度に2点が輸精管の焼灼。 女 ）焼灼用鉗子のフレーミングされている。G）の 精管がはっきりと2焼灼両端に分かれH）筋縫合私 ）皮膚縫合。 こちらをクリック拡大画像を表示します。

図3。子宮卵管胚移植プロトコルA、B）の背側と赤い「X」で示さ切開点の側面図（）;。最後の肋骨と腰の間に黒い線（A、B）とバックと腹部の間に、（B）ガイドとして機能します。C）皮膚切開。 、E）胚操作用ガラスピペットは、F、G）は、（F）または（G）の黄体のない代表卵巣は、黒い矢印で示す。 香港を ）表現のために子宮（*）に近い卵管の子宮卵管胚移植は、0.4％トリパンブルー溶液を用いてガラス操作ピペットのロードを行った。H）穿刺（黒矢印）のシミュレーション。胚操作用ピペットのI）はじめに、J）胚操作用ピペットは、子宮卵管接合を介して進み、以前に実施した。Kオリフィス）胚移植にリリースされたのとトリパンブルー溶液と同等のボリュームは子宮内腔（黒矢印）で排出された。L）に子宮卵管接合によって生成効率的な閉鎖をテストし、すべての操作ピペットの内容は、子宮内に放出された;。子宮卵管接合部（矢印）は、子宮内に放出トリパンブルー溶液（*）M）筋縫合N）皮膚縫合O）クリップ除去の逆流を妨げる。この手法に従って得られた15日間の胚移植後のP）の受信者に材料を寄り添う提供しています。Q）をキメラゴミ。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

治療	転送回数	移植胚	配信の仔	TへのサバイバルERM（％）
IVC	11	110	82	74.5
IPSC注入	3	50	35	70.0
レンチウイルス	6	60	44	73.3

表1。子宮卵管胚移植以下の操作された胚の3つのグループを転送した後に得られた代表的な結果。1）の胚を培養のin vitro（IVC）受精卵の段階から胚盤胞期まで、2） 生体内では 10覚書を注射された胚盤胞を生産キメラマウスを生成する電子IPSC、3） 生体内では 、その透明帯を除去したGFPを発現するレンチウイルスを7時間インキュベートした胚盤胞を産生した。データは、妊娠をさらに進行させるされなかったように、彼らは、10日胚移植後の生存可能な胎児の数を表しているレンチウイルス曝露群を除いて、移植胚数から生まれ仔の数を表す。

Discussion

精管切除は大きな困難を伴わない比較的単純手術法である。ポビドンヨード、エタノールで消毒した場合は、それが腹膜を刺激する可能性がある（エタノールによる）最後の洗浄は、ポビドンヨードを削除していることを確認してください。 輸精管へのアクセスはまた、陰嚢または腹部⁸の横方向の切開を行うことによって達成することができる。陰嚢切開は、必要に応じて、比較的小さく切開し、わずかに優れ、術後の行動¹¹に腹部切開を横方向することが推奨されています。それは二度同じ輸精管を焼灼し、機能的な精管を残してから、初心者の外科医を防ぐ、両方の睾丸から脈輸精管に簡単に、より明確なアクセスを提供しますので、我々は、陰嚢の上腹部切開を好む。両方の腹部技術の間、我々はtransver以上の白線内の縦切開を好むSALそれは腹部ヘルニアの開発を避け、どんな腹部の筋肉の繊維をカットしていないため。しかし、精管切除し、子宮卵管胚移植プロトコルの両方が利用可能な装置、あるいは研究者の個人的な好き嫌いに適合させることができる。例えば、ガラスビーズ滅菌器は、 輸精管を焼灼するために使用される鉗子を加熱するために使用することができる。いずれの場合も、動物福祉を最大化するために、適切な麻酔および鎮痛を提供するために、地域の規制に準拠するために、無菌技術に従うことが重要である。

修正のための感受性の別の側面は、麻酔プロトコルです。吸入麻酔（イソフルラン）が利用可能である場合、それは非常に安定した麻酔プレーンと迅速なリカバリを提供するので、私たちは、その代わりに、非経口（注射）麻酔の使用をお勧めします。しかし、吸入麻酔がまだadminiあるべき内およびポスト·ブルーフェーズの痛みのための鎮痛剤の使用を必要とすることを明記することが重要である前投薬として手術前にstered。ブプレノルフィンは、マウス¹²での長期的な鎮痛を提供するオピオイドである。非経口麻酔はまた、精管切除し、胚移植の短い手順のために良いの麻酔プレーンを提供します。ケタミン-キシラジンは、マウスの手術のために¹³非常に信頼性の組み合わせであり、我々はブプレノルフィンと前投薬と組み合わせて、この組み合わせを使用して任意の麻酔合併症を観察したことがありません。他の非経口の組み合わせは¹²を使用することができるが、我々は（トリブロモエタノール）アベルチン麻酔性混合物の使用を思いとどまら、単一の用量が投与されるように、複数の物品は、例えば、局所刺激、貧弱な鎮痛、イレウスとしてのその使用に関連する多様な合併症が報告されている腹腔、腹膜下筋線維腹部臓器表面の壊死、さらには死亡率^14〜18において、線維性癒着。

胚移植は、両方の胚の適切な管理を必要とするDの受信者。哺乳類の胚移植のための一般的なルールとして、胚の発達段階は偽妊娠のレシピエントの段階ではなく、反対よりも、より高度なことができます。言い換えれば、胚は母親を待つことができますが、初期段階の母は、胚を待つことができないので、この技術は桑実胚または胚盤胞を転送するために使用することができますが、ではない。子宮卵管接合部は卵管から胚の自然な輸送を可能にするために開いているときに子宮卵管胚移植は、2日正午（2.5 DPC）から夕方 - 夜（3 DPC）への膣栓が検出された後に行うことができます子宮角へ。移植胚はすでに操作のいくつかの種類に苦しんでいる可能性があることを考慮すると、胚の取り扱いは、それ以上のダメージを最小限に抑える必要があります。マウス胚の操作のための優れたガイドは、ナジらに記載されています^。8で定期的に生理的pHを保持する二つの最も一般的に使用されたマウス胚操作メディア、mosphereは、CZBH ¹⁹とM2 ²⁰です。 生体内生産マウス胚で長時間²¹低温や異常なpHに露出を克服することができますが、操作メディアは予め温めなければならない。メディアが培養皿に予め温めている場合は、メディアの浸透圧による水の蒸発に増加し、それが冷たい操作メディアよりも有害であることができるように、長い期間（以上40分）のために温暖化を避ける。同様に、胚は操作ピペットの中で費やされた時間は、ピペット内に存在少量に最小限にすべきである。

適切な胚操作用ピペットの使用は、プロトコルの成功のために不可欠である。操作ピペットは、薄いガラス壁を有するガラス毛細管から作製することができる。多くの場合、大型動物の胚を処理するために使用されるパスツールピペットを用いることもできるが、先端ためのハンドルからの短い距離に、ガラス毛細管から作製ピペット操作は、よりCOMFある操縦するortable。引き上げ速度および火炎への暴露は、壁の厚さおよびピペットの内径を決める。ピペット操作を容易にいくつかの練習後に手動で行うことができるが、プラーマイクロ鍛造を用いることもできる。これは、いくつかの最適な操作ピペットの作製に時間を投資することが重要です。ピペット操作用開口は、滑らかな流れを可能にする胚よりも広くすることができるが、容易に浸透し、子宮卵管接合部を経て進行するのに十分に小さい。べき透明帯は、転送前に除去されている場合は、胚盤胞は、通常、より大きな直径に拡張する。この場合には、栄養外胚葉細胞への損傷を避けるために、より広い開口（130〜180ミクロン）で、より広いピペットを作ることをお勧めします。 透明帯が削除されている場合は特に、そして破片によってブロックされるのピペットチップを避けるために-先端ポリッシュは卵管、子宮壁や胚の損傷を避けることが重要である。ただし、研磨後に、開口部は、Nべき直径の急激な減少は、流速の急激な変化の原因となるように、ピペットの内径に比べて小さすぎる可能性がOT。吸引器マウスピースはハンド制御装置と比較して、より正確なフロー制御だけでなく、より快適な手の位置を提供します。 （例えば、レンチウイルス処理した胚を操作するときに）必要に応じてそれにもかかわらず、手の制御機器を使用することができる。最適な流量および鉱油の転送を回避するためには、代わりに、操作メディアに培養培地から胚を移動するために使用されるの胚移植のために新しいピペットを使用することも推奨される。最後に、卵管を通じてピペットを導入しながら、毛細血管、 すなわち 、直接処理する必要があります。しっかりしたグリップを得るために、ガラスとしない吸引装置のプラスチック製のハンドルをつかむ。胚移植のために使用される倍率は、外科医の視力に依存する個人的な問題である。私たちは、広い視野を持つように低倍率を使用することを好む、私たちは10倍最終倍率（10×眼および1X目標）を使用します。

受信者は、少なくとも8週間前のものと27〜40グラムの間で比較検討する必要があります。このようなCD1やスイス·ウェブスターなどのマウスが良い母性行動を表示し、優れた受信者である異系交配。使用されていないものは、2週間で、通常のサイクリング活動を回復するように、それは、余分な受信者を取得するために品種改良を設定することをお勧めします。交配されているにもかかわらず、一部の女性は黄体（ 図3G）を持っていない可能性があり、したがって、移植胚を受容できなくなります。このため、卵巣は2.5でDPCが明らかに卵巣（ 図3F）の赤い鮮やかな構造として識別することができる黄体の存在についてチェックする必要があります。卵巣および子宮の過剰な操作は黄体退行をもたらし得る;手術中にではなく、卵巣脂肪パッドをつかむことにより、生殖器官との接触を最小限にすることが重要である。 manipulatioの導入卵管にn個のピペットは、プロトコルの中で最も複雑なステップです。一部の受信者では、卵管が非常にねじれて子宮との接合部から2ミリメートルストレートストレッチはありません。その場合、卵管を配置し、第1屈曲部に穿刺を行う。上記で詳述したように、素敵な操作ピペットは本当に違いになります。ピペットは、子宮卵管接合部を通過した後は、容易に摺動する。そうでない場合は、ピペットを卵管から外れたと子宮内腔に達していない場合があります。メディアが流れない場合は、一度、子宮の内側に、少し出たり、ピペットを移動し、再試行してください。それでも流れない場合は、ピペット操作メディアで皿の中の内容物を放出し、同じまたは他のピペットをリロードし、子宮からそれを取り出して、目詰まりしている。納期は通常、胚移植後の17日に行われる。共食いを防ぐために、事前に2日間材料を寄り添う提供し、お届け後の最初の日の間にケージを変更しないでください。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	VEDCO	Ketaved ANADA 200-257	To be ordered by a licensed veterinarian.
Xylazine	Lloyd Laboratories	Anased NADA #139-236	To be ordered by a licensed veterinarian.
Buprenorphine	Generic	NDC 400-42-010-01	To be ordered by a licensed veterinarian.
Eye ointment	Novartis	Genteal
Antibiotic	Pfizer	Clavamox NADA #55-101.	Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.
Dressing serrated forceps	ROBOZ	RS-8120	Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.
Microdissecting serrated forceps	ROBOZ	RS-5137	These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred.
Slight curved micro dissection forceps	ROBOZ	RS-5136	This model is particularly useful to hold the oviduct.
Scissors	ROBOZ	RS-5880	Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
27 G needles	Beckton-Dickinson	305136	Smaller needles (30 G) can be also used. 25 G may be a bit too big.
Clip applier	MiKRon	42763
9 mm Clips	MiKRon	427631
Clip remover	MiKRon	7637	Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.
Suture needle holder	ROBOZ	RS-7820
Suture	Dowist Gell	5-0 Dexon S 7204-21	Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.
Glass capillaries	VWR	100 ul calibrated pipettes 53432-921	It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 µm filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in Nagy et al.8
Burner	KISAG AG	Typ 2002	Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.
Stereomicroscope	Leica	MZFLIII	This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot.
Fiber optics ilumination	Dolan Jenner	Fiber lite	To iluminate the surgical area. There are different systems available.
Warm stages	American scope	http://store.amscope.com/tcs-100.html	These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.
Culture dishes for embryo manipulation	Falcon	353001	351008 may be also used; they made narrower drops.