Summary
Utero-Tüp embriyo transferi rahim transferinin gerçekleştirilmesi oluşabilecek embriyo akışını önlemek için bir bariyer olarak utero-tubal kavşak kullanır. Vasektomize erkek embriyo transferi için yalancı alıcıları almaları gerekmektedir. Her iki teknikler tartışılacaktır.
Abstract
Bir taşıyıcı dişi preimplantasyon embriyo transferi epigenetik değişiklikler etkisi takip eden fetal gelişim ve yetişkin sağlığına preimplantasyon gelişimi sırasında kökenli incelemek için genetik olarak modifiye edilmiş fare veya üretimi için gerekli bir adımdır. Etkin ve tutarlı bir embriyo transfer tekniğin kullanılması, genetik olarak tadil edilmiş hayvanların üretimi artırmak ve emplantasyon oranlarının ve dönemde hayatta kalma farklı tedavilerin etkisini tespit etmek önemlidir. Blastokist aşamasında embriyolar genellikle embriyo manipülasyon pipet tanıtmak için rahim duvarında bir delinme performans, rahim transferi ile aktarılır. Pipet geri çekilmesinden sonra, rahim içinde gerçekleştirilen menfez kapatmaz ve bağlı rahim pozitif basınca karın boşluğuna embriyolar çıkış olabilir. Delinme de, implantasyon kanaması bozar üretmek blok transferi pipet ve embriyo d etkileyebilir olabilirzona olmayan embriyolar aktarılır özellikle evelopment. Sonuç olarak, bu teknik genellikle çok değişken ve genel düşük embriyo sağkalım oranları ile sonuçlanır. Bu olumsuz etkileri önledikleri, utero-tubal embriyo transferi, embriyo çıkışı engelleyen doğal bir engel olarak utero-tubal kavşak yararlanmak ve rahim duvarının delinmesi kaçının. Vasektomize erkek yalancı alıcıları elde etmek için gereklidir. Vazektomi gerçekleştirmek için bir teknik utero-tubal embriyo transferi bir tamamlayıcısı olarak tarif edilir.
Introduction
Embriyo transferi muhtemelen fare modelinde yapılan en sık cerrahi prosedürdür. Bu teknik, in vitro manipülasyon tekniklerine tabi embriyolardan yavrular elde etmek için gerekli olan ve bu nedenle, pro-nükleer enjeksiyon, transdüksiyon lentiviral ya da kimera formasyonu ile genetik olarak modifiye edilmiş modellerin geliştirilmesi için gerekli bir adım teşkil etmektedir. Bunun yanı sıra, teknik preimplantasyon gelişimi sırasında meydana gelen akıntılar çeşitli gelişimsel etkileri çalışma sağlar. Yapay üreme teknikleri 1 ya da farklı maddelerin veya metabolitlerinin 2 anormal konsantrasyonlara maruz kalma kullanılması implantasyon veya plasenta başarısızlıkları ve yavrular uzun vadeli etkileri sonucu embriyo gelişimini etkileyebilir. A, güvenilir ve tekrarlanabilir bir embriyo transfer tekniği tutarlı bir insanda emplantasyon ve fetus gelişimi üzerindeki deneysel tedavinin olası olumsuz etkilerini test etmek için çok önemlidirner.
Mürin preimplantasyon embriyolar 0.5 gün sonrası coitum ve ampülleri (DPC) psödopregnant alıcıları (yumurtalığa transferi) 3,4 veya 2,5 DPC psödopregnant alıcının rahim içine (rahim transferi) 5,6 vasıtasıyla yumurta kanalına ya alıcı bir dişiye transfer edilebilir onların gelişim evresine bağlı. Embriyonik veya uyarılmış pluripotent kök hücrelerin enjeksiyonu ile kimerik farelerin üretilmesi için kullanılanlar gibi blastosit aşamasında Embriyolar, genellikle rahim transferi ile aktarılır. Blastosistler, aynı zamanda bir 0,5 DPC alıcının tuba kanalından aktarılabilir, ancak embriyo implantasyonu gerçekleşmeden önce boşaltım kurtarmak için 2 gün diapause uğrar ve sahip olduğu için, gelişim bozucular için daha az fizyolojik testi oluşturmaktadır. Uterus Transfer rahim lümenine bir embriyo manipülasyon pipet erişim sağlayan bir açıklık oluşturmak için dar bir iğne ile delinmesi rahim duvarına içerir. Although bu tekniği iyi sonuçlar verebilir vadede hayatta kalma (yani bir yavru geliştirmek transfer edilen embriyo yüzdesi) genellikle düşük ve 7,8 önceden kestirilemez.
Rahim duvarının delici bazı zararlı yan etkileri gerektirir. İlk olarak, oldukça yüksek oranda damarlanmış bir miyometriyum dokusu ve delinme genellikle küçük bir kanama ile sonuçlanır. Kan embriyo transfer pipet engellemek ya da embriyonik ölüm ve / veya implantasyon başarısızlığı neden uterus lümen istila edebilir. Kan hücreler ve döküntüler, blastomerlerin eklemek gibi zona olmayan embriyolar, aktarılır, bu özellikle önemlidir. Embriyoların aktarıldıktan sonra, İkinci olarak, gerçekleştirilen açılış mühür etmez, bu nedenle de menfezi içinden geri akabildiği için ve bir çok büyük hacimli rahim içine tanıtmak edildiğinde karın boşluğuna ihraç edilebilir. Açıklanan utero-tubal embriyo transfer Burada embr teslim utero-tubal kavşak yararlanmakrahim duvarına delinmesi ve böylece olumsuz etkileri 9 önleme gerek kalmadan rahim içine yolar.
Embriyo transferi için kullanılan yalancı Alıcı dişiler erkeklerin vasektomize 8, doğal çiftleşme ile elde edilir. Steril erkek tarafından üretilen seminal salgıları embriyo transferi için açık olmak için rahim için gereklidir. Bir alıcı almak için, 6 aylıktan 8 hafta 2 kadın maksimum öğleden sonra bir vazektomize erkek ile yerleştirilir. Sonraki sabah, kadınlarda vajinal birleşme fiş, erkek seminal sıvıdan pıhtılaşmış protein bir yığın varlığı için kontrol edilir. Çiftleşme genellikle gece yarısı sırasında ortaya olarak, vajinal fiş algılama gün DPC 0.5 olarak kabul edilir. Vasektomize erkek bir satıcılardan satın alınabilir, ancak burada tarif edilen bir cerrahi prosedür nispeten kolaydır ve embriyo transferi için gerekli olan başka ilave bir araçları gerektirmez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri USDA Hayvan Bakım ve Kullanım Kılavuzu uyarınca Beltsville'daki Bölgesi Hayvan Bakım ve Kullanım Comittees (BAACUC 11-015) tarafından onaylanmıştır.
1.. Anestezi ve Analjezi (Cerrahi Prosedürleri İkisi için ortak)
- Fare tartılır ve 27 G iğne ile iki 1 ml şırınga aşağıdaki anestezik ve analjezik yük:
- Ketamin (0.1 mg / g: 0.01 ml / a 10 mg / ml çözelti g) ve ksilazin (0.01 mg / g: 2 mg / ml çözeltisi 0.005 ml / g).
- Buprenorfin (0.1 ug / g: bir 0.01 mg / ml çözeltisi 0.01 mi) eklenmiştir.
- Başparmak ve işaret parmakları ile mümkün olduğunca çenelerine kadar yakın da boyun ense toplayıp, küçük ve yüzük parmakları arasında kuyruk tutarak fare hareketsiz.
- Intraperitoneal ketamin-Xylazine karışımı enjekte edilir. Iç organları delinmesiyle önlemek için, fareyi tutunhafifçe kalça seviyesinin altındaki merkez (Şekil 1A)
- Başparmak ve işaret parmakları (Şekil 1B) arasındaki boyun beklemeye ense Buprenorphine subkutan enjekte edilir.
- Sıcak bir sahnede kafes (temiz ve başka bir hayvan olmadan) fareyi bırakın.
- Bilinçsiz bir kez, (ayak tutam tarafından kontrol) arka ayak refleksinin olmaması için kontrol edin. Göz kuruluğu önlemek için ve palpebral refleks (Şekil 1C) yokluğunda kontrol etmek için göz merhemi sürün.
- Bu protokol, aşağıda tarif edilen prosedürleri gerçekleştirmek için yeterli, 30 dakika içinde en az bir cerrahi anestezi düzlemi içerir (Protokoller 2 ve 3). Daha uzun süreler gerekirse, 1.1.1 'de tarif edilen dozajın yarısı ketamin + ksilazin enjeksiyonu ek 30 dakika sonra uygulanabilir. Daha hızlı ve düzensiz bir desen için, solunum bir değişiklik gösterir loUygun anestezi düzleminin ss.
2. Meni kanalı ameliyatı
- Kanıtlanmış bir çiftleşme performans ile bir erkek kullanın.
- , Cerrahi aletlerin sterilize ameliyatı yapılacak yüzeyleri temizlemek ve% 70 etanol ile silin.
- Önceden reflekslerin kaybı için kontrol, (Protokol 1) ayrıntılı olarak anestezi gerçekleştirin.
- Kaldırmak, sıcak bir sahnede fare yerleştirin iki hayali enine çizgi arasındaki ventral alanından elektrik kesme makineleri ile kürk 0.5 cm ve penis üzerinde 2.5 cm (Şekil 2A) yerleştirildi.
- % 10 povidon iyot ve% 70 etanol ile sıralı silinerek traş alanı sterilize.
- Traş bölgesini açıkta bir delik steril bir havlu ile cerrah ve kapağına doğru kuyruğu ile yatar pozisyonda fare yerleştirin. Cerrahi alanını aydınlatır.
- 10-15 mm boyuna cilt incisio gerçekleştirinn, yaklaşık 1 cm penis üzerinde karın, medial tutulmaktadır. Dişli forseps pansuman ve sonra, (Şekil 2A ve 2B) makasla kesme ile cilt tutun.
- Linea alba, 5-10 mm boyuna kesi yapmak. Tırtıklı forseps Microdissecting ile kas tutun ve makas (Şekil 2C) ile kesti.
- Tırtıklı diseksiyon forseps ile mikro bir tarafta testis yağ pedi kapmak ve testis maruz çekin, vaz deferens ve epididimis. Vas deferens testis medial bulunan ve bu gibi testis duvara bağlı değil açıkça ayırt ücretsiz tüp (bir Bir kan damarı, bir tarafta (Şekil 2D) birlikte çalışan epididimis).
- Onlar kırmızı açmak kadar mikro diseksiyon tırtıklı forseps, alev soyunma forseps ile vas deferens Holding (Şekil 2E (Şekil 2F) aynı anda iki noktada vaz deferens kesmek ve dağlamak için bunları kullanın. Kesilen yaklaşık 5 mm bir bölümünün ayrılması ve iki net bir şekilde ayrı dağlanmış uçları (Şekil 2G) geride bırakmak gerekir.
- Geri karın boşluğuna testis, epididim ve vas deferens taşıyın.
- Diğer testis adım 9 geçin.
- 5/0 emilebilir sütür (Şekil 2H) ile yapılan bir ya da iki yatay yatak dikiş ile kas dikin.
- Bir ya da iki yara kesme makineleri (Şekil 2I) ile cildi dikin.
- , Vasectomised erkek (kulak yüzük, parmak dövme ...) tanımak bir sıcak sahnede yerleştirilen kafes taşımak ve anestezi kurtarır kadar gözlemlemek (bilinçli ve sternum yatma korumak). Sıcak bir tuzlu su çözeltisinden 0.5-1 ml deri altı enjeksiyon yeniden artırırPasa. , Vazektomi aktarımı sırasında meydana gelen olası olaylar kaydedin içme suyuna antibiyotik ekleyin.
- Yara klipleri 10 gün bir yara kesme çıkarıcı ya da diş forseps bir çift ile vazektomi sonrası kaldırılabilir. Vazektomize erkek ameliyattan 2 hafta sonra çiftleşmeye hazır olacaktır.
- Alıcıları elde etmek için kullanmadan önce bereketli dişilerle çiftleşme tarafından vazektomize erkek infertilite sınayın.
3. Utero-tubal Embriyo Transferi
- Fare morulları veya blastosistleri 2.5 DPC bir yalancı alıcı kadın için bu teknikle transfer edilebilir.
- Embriyo manipülasyon cam pipet hazırlayın:
- Pipet tutucu zarar görmesini önlemek amacıyla cam kılcal damarların ipuçlarını parlatın.
- Hafifçe dönerken iyi bir alev ile ısıtılarak cam kılcal bir orta parça yumuşatıreşzamanlı iki elinizle kılcal. Kılcal bölüm yumuşak ve (açık kırmızı renkli) dövülebilir olduktan sonra, alevden hızla çekilme ve 130-150 um dış çapını daraltmak için iki ucunu çekin.
- Cam soğuması ve sonra hafifçe bir elmas nokta kalem, aşındırıcı taş veya tırnak törpüsü ile dar kısmını puanlama ve her iki taraftan çekerek onu kesmek için bekleyin. Mola temiz ve dik olmalıdır
- Bir 100-130 mikron diyafram bırakarak, çok hızlı yanan tarafından ucu parlatın. Pipetler daha sonra kullanılmak üzere saklanabilir.
- Sıcak embriyo manipülasyon medya (CZBH veya M2, tartışmaya bakınız).
- , Cerrahi aletlerin sterilize ameliyatı yapılacak yüzeyleri temizlemek ve% 70 etanol ile silin.
- Önceden reflekslerin kaybı için kontrol, (Protokol 1) ayrıntılı olarak anestezi gerçekleştirin.
- T tutulmasıO sıcak bir sahnede fare, diz ve distal kaburga (Şekil 3A ve 3B) arasındaki sırt bölgesinde elektrik kesme makineleri ile kürk çıkarın.
- % 10 povidon iyot ve% 70 etanol ile sıralı silinerek traş alanı sterilize.
- Prewarmed embriyo manipülasyon medya inkübatör embriyolar taşıyın.
- Stereomicroscope altında sıcak bir aşamaya alıcıyı taşımak ve (başını sağa veya cerrahın sol tarafına bakan) cerraha yanal yüzükoyun pozisyonda yerleştirin.
- Traş bölgesini açıkta bir deliği olan bir steril havluyla alanı kapsayacak ve cerrahi alanını aydınlatır.
- Son kaburga ile kalça ve arka ve karın (Şekiller 3A, arasındaki hattın dorsal ⅓ arasındaki hattın kafatası ⅓ üzerinde bulunan bir nokta deride bir 1 cm enine (dikey) bir kesi yapınnd 3B). Tırtıklı forseps pansuman ile cildi tutun ve makas (Şekil 3C) ile kesti.
- Cilt kesilmiş sonra, yumurtalık (kırmızı / turuncu) veya yumurtalık (beyaz) çevreleyen adipoz ped gövde duvarından görselleştirilebilir. Kesi herhangi bir büyük kan damarı kesmez bir nokta olarak yumurtalık ya da yağ pedi üzerinden gövde duvarında bir 0.3-0.5 cm enine (dikey) bir kesik yapın. Mikro diseksiyon dişli forseps ile kas tutun ve makas (Şekil 3D) ile kesti.
- Onun baş cerrah doğru bakan olması için fareyi hareket ettirin.
- Embriyo manipülasyon pipet (Şekil 3E) yükleyin:
- CZBH ortam daha geniş olan kısmı yaklaşık olarak 5 mm kadar manipülasyon pipet dar kısmı boyunca kapilarite ile yükselmeye izin verir.
- Küçük bir hava kabarcığı (0.2-0.5 mm) kadar sürebilir.
- Embriyolar (5-10) tanıtmakmedya az miktarda (2-4 mm).
- Başka küçük bir hava kabarcığı (0.2-0.5 mm) ve medya küçük bir miktar (0.5-1 mm) kadar sürebilir.
- Ağız aspiratör tutucu ya da adım 3.17 hazır elle çalıştırılan cihaza takılı cam pipet bırakın.
- Mikro diseksiyon dişli forseps ile yumurtalık çevreleyen yağ pedi tut ve yumurtalık, yumurta kanalının, ve karın boşluğundan dışarı üst rahim küçük bir bölümünü (Şekil 3F ve 3G) maruz fare kafasına doğru çekin.
- Yumurta kanalının taşımak ve (yumurtalığa rahim karşılayan yani) utero-tubal kavşak maruz mikro diseksiyon tırtıklı forseps ile yağ pedi kapmak, kullanıma hazır, ağızda aspiratör ağız parçasını tutan.
- Erişilebilir utero-tubal kavşak tutulması, (sağ elini ise) sol elinizle hafif kavisli mikro diseksiyon forseps almak ve hemen altına yerleştirmeko kısmı Yukarıda 2 mm hakkında yumurta kanalının kapma utero-tubal kavşak.
- Hafif kavisli mikro diseksiyon forseps ile utero-tubal kavşak Holding, 27 G iğne (Şekil 3H) ile forseps yakın yumurtalığa bölümü delinme.
- Utero-tubal kavşağı ile rahim iğne ve peşin ile yapılan deliğine embriyo manipülasyon pipet takın (3I ve 3J Şekiller). Pipet utero-tubal kavşak (Şekil 3K) geçtikten sonra kolayca kayar. Enkaz endometrial hasarı (en fazla 3 mm) ve pipet engelleme önlemek için rahim içine çok uzak ilerleme yok.
- Yavaşça (Şekil 3L) üfleme ile rahim içine embriyo bırakın. Hem hava kabarcıkları rahim geçmelidir. İlk baloncuk yukarıdaki ortamın BazıAyrıca rahim içine salınan, ancak implantasyonu engelleyebilir gibi, daha fazla hava tanıtan önlemek olabilir.
- Embriyolar rahim içine serbest bırakıldı hemen sonra pipet çıkarın.
- Yumurta kanalının Taşı ve adipoz ped kapma geri karın boşluğuna yumurtalık.
- 5/0 emilebilir sütür (Şekil 3M) ile yatay bir yatak dikiş ile kas dikin.
- Bir yara makası (Şekil 3N) ile cildi dikin.
- Gerekirse diğer tarafta aşama 10 devam edin.
- , Alıcı (kulak halkası, parmak dövme ...) tanımlamak (sıcak sahnede yerleştirilen) kafesine taşımak ve anestezi kurtarır kadar gözlemlemek (bilinçli ve sternum yatma korumak).
- Embriyo transferi sırasında meydana gelen olası olaylar açıklama ve içme suyuna antibiyotik ekleyin. Sıcak SalI bir 0.5-1 ml deri altı enjeksiyonne çözelti kurtarma geliştirir.
- Yara klipleri 10 gün bir yara kesme çıkarıcı ya da forseps (Şekil 3O) iki çift embriyo transferi sonrası kaldırılabilir. Alıcı gebelik değerlendirmek ve yavruların sayısını tahmin etmek için o gün tartılır olabilir. 15 gün embriyo transferinden sonra alıcıya yavru malzeme sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utero-tubal embriyo transferi rahim embriyo transferi 2,9,10 ilişkili komplikasyonlar bazı kaçınarak rahim embriyo transferi için bir olanak sağlar. Tablo 1 'de, biz tarif edilen protokol takip CD1 alıcıya manipülasyonlar farklı tabi CD1 blastosist transfer edilen bazı temsili bir sonuç göstermektedir. Dönem (bir yavru elde embriyoların%) ya da (lentivirüs maruz durumunda) E15 hayatta kalma hayatta kalma zigot aşama (IVC) in vitro olarak kültürlenmiş embriyolar, sadece, kimerik yavrular elde etmek için iPSC püskürtmeye tabi tutulan embriyolarda arasında benzer olan ve zona kaldırıldı vardı ve embriyo transferinden önce 7 saat lentivirüsünün maruz bırakıldı embriyolar. Bu nedenle, utero-tubal embriyo transferi özellikle, zona pellusida'yı yoksun olanlar gibi karmaşık ve lentivirüsünün ile kuluçkaya embriyo transferi için güvenilir bir tekniktir.
Şekil 1. Ketamin-Xylazine. B) göz merhemi Buprenorphine. C) Uygulama altından enjeksiyon ve anestezik ve analjezik enjeksiyonu. A) intraperitoneal enjeksiyonu.
Şekil 2. . Kırmızı bir "X" ile tasvir Vazektomi protokol A) kesi noktası () yaklaşık 1 cm penis üstüne yerleştirilir;.. Penis üzerinde 0.5-2.5 cm (siyah çizgiler) B) cilt kesi C) kas kesi den kürk çıkarın. D) Vas deferens (siyah ok) ve test(*). E) aynı anda iki noktada vaz deferens koterizasyonu. F) Koterizasyon için forseps Flaming edilir. G) Vas deferens açıkça iki dağlanmış biter ayrılır. H) kas sütür. I) Deri dikiş. buraya tıklayın Daha büyük resmi görmek için.
Şekil 3,. Utero-tubal embriyo transfer protokolü A, B) Sırt ve kırmızı bir "X" ile tasvir kesi noktasının lateral görünümü ();. Son kaburga ve kalça arasındaki siyah çizgiler (A, B) ve sırt ve karın arasında (B) bir rehber. C) Cilt kesi olarak hizmet vermektedir.
| Tedavi | Transferlerin sayısı | Embriyolar transfer | Teslim yavrular | T Survivalerm (%) |
| IVC | 11 | 110 | 82 | 74.5 |
| iPSC enjeksiyon | 3 | 50 | 35 | 70.0 |
| Lentivirüstür | 6 | 60 | 44 | 73.3 |
Tablo 1. Örnek sonuçlar utero-Tüp embriyo transferi aşağıdaki manipüle embriyo üç farklı gruplar aktarma işleminden sonra elde edilmiştir. 1) kültürlenmiş embriyolar in vitro (IVC) zigot aşamasından blastosist evresine, 2) 10 mutabakatnamelere enjekte vivo üretilen blastosistlerie iPSC kimerik fareler üretmek için, 3) in vivo kendi zona çıkarıldı vardı ve GFP ifade eden bir lentivirüs ile 7 saat için kuluçkalanmıştır blastosist üretti. Veri gebelik daha fazla ilerleme için izin değildi onlar, 10 gün embriyo transferi sonrası canlı fetusların sayısını temsil lentivirüstür maruz kalan grupta, dışında transfer edilen embriyo sayısına doğan yavruların sayısını temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vazektomi büyük zorluklar içermeyen nispeten düz ileri bir cerrahi tekniktir. Povidon iyot ve etanol ile sterilize zaman periton tahriş olabilir (etanol) ile son yıkama, povidon iyot kaldırır emin olun. Vas deferens için erişimi de skrotum veya karın 8 bir çapraz kesi gerçekleştirerek elde edilebilir. Skrotal kesi nedeniyle gerekli nispeten daha küçük insizyon ve biraz daha iyi postoperatif davranış 11 abdominal kesi transversal tavsiye edilmiştir. Iki kez aynı vaz deferens cauterizing ve fonksiyonel bir vas deferens bırakarak acemi cerrahlar önlenmesi, hem testislerin vasa deferensiayı daha kolay ve açık erişim sağlar Ancak, biz skrotal üzerinde karın kesi tercih ederim. Hem karın teknikleri arasında, biz TRANSVER üzerinde linea alba içinde uzunlamasına bir kesi lehinesal abdominal herni gelişimini önlemek, herhangi bir karın kas lifi kesmiyor çünkü. Ancak, vazektomi ve utero-tubal embriyo transfer protokolleri hem mevcut ekipman veya araştırmacının kişisel hoşlandığı adapte edilebilir. Örneğin, bir cam boncuk sterilizatör vas deferens yakmak için kullanılan forseps ısıtmak için kullanılabilir. Her durumda, bu bir aseptik teknik takip etmek, hayvan refahı maksimize etmek için uygun anestezi ve analjezi sağlamak için, ve yerel yönetmeliklere uymak esastır.
Değişiklikler için duyarlı bir başka özelliği anestezi protokoldür. Inhalasyon anestezi (izofluran) mevcut ise bu çok kararlı anestezi uçağı ve hızlı iyileşme sağlar gibi, biz, bunun yerine parenteral (enjektabl) anestezi kullanımını teşvik ediyoruz. Ancak, inhalasyon anestezi hala admini olmalı intra-ve post-operatif ağrı için analjezik kullanımını gerektiren devlet önemlidirpremedikasyon olarak ameliyattan önce göstermişlerdir. Buprenorfin fare 12 uzun süreli analjezi sağlayan bir opioid. Parenteral anestezi ayrıca vazektomi ve embriyo transferi gibi kısa işlemler için iyi bir anestezi uçağı sağlar. Ketamin-Xylazine fare ameliyat için 13 çok güvenilir bir kombinasyonudur ve biz buprenorfin ile premedikasyon ile birlikte bu kombinasyon kullanarak herhangi bir anestezi komplikasyon gözlendi hiç. Diğer parenteral kombinasyonlar 12 kullanılabilir, ancak (tribromoethanol) avertin narkotik karışımının kullanılmasını tavsiye etmemektedir, sadece tek bir dozu tatbik edilebilir ve birden fazla Malzemeler, lokal irritasyon, çok zayıf analjezi, ileus olarak kullanımı ile ilişkili çeşitli komplikasyonların bildirmiştir , karın boşluğu, subperitoneal kas lifleri ve karın organlarının yüzey nekrozu, ve hatta ölüm 14-18 fibröz yapışıklıklar.
Embriyo transferi iki embriyoların iyi yönetilmesini gerektiren bird alıcı. Memeli embriyo transferi için genel bir kural olarak, embriyo gelişim aşamasında daha fazla alıcının yalancı gebelik aşamasında daha ileri değil, tam tersi olabilir. Diğer bir deyişle, embriyolar anne beklemek, ancak anne embriyolar beklemek değildir, bu nedenle bu teknik, molula-lar ya da blastosist transfer etmek için kullanılabilir, fakat daha erken aşamalarında değil. Utero-Tüp embriyo transferi iki gün utero-tubal birleşme tuba kanalından embriyoların doğal geçişine izin vermek için açık olan akşam-TL öğlen (2.5 DPC) için vajinal tıpanın tespiti (3 DPC), sonra yapılabilir rahim boynuzları. Transfer embriyolar zaten manipülasyon çeşit acı olabilir göz önüne alındığında, embriyo kullanımı daha fazla zarar görmesini en aza indirmek gerekir. Fare embriyosu işlemler için mükemmel bir kılavuz Nagy ve ark bulunabilir. 8 'normal fizyolojik bir pH değerine sahip iki en yaygın olarak kullanılan fare embriyosu işleme ortamı,mosphere, CZBH 19 ve M2 20 vardır. Vivo üretilen fare embriyolarında uzun süre 21 soğuk sıcaklıkta veya anormal pH'a maruz üstesinden de, manipülasyon ortam önceden ısıtılmış olmalıdır. Medya bir kültür çanak prewarmed ise medyanın ozmolaritesi nedeniyle su buharlaşma artacak ve soğuk manipülasyon medya daha zararlı olabilir gibi, uzun süre (fazla 40 dk) için ısınma kaçının. Benzer şekilde, embriyolar manipülasyon pipet içindeki harcanan zaman nedeniyle pipet içinde mevcut olan küçük bir hacme kadar en aza indirilmelidir.
Uygun bir embriyo manipülasyon pipetin kullanılması protokol başarısı için çok önemlidir. Manipülasyon pipetler ince bir cam duvar cam kılcal yapılabilir. Genellikle büyük hayvan embriyolar işlemek için kullanılan Pasteur pipetler, de kullanılabilir, ancak nedeniyle ucu sap onun daha kısa bir mesafe için, cam kılcal yapılan manipülasyon pipetler fazla olan bir değer!manevra ortable. Çekme ve alev hızına maruz duvar kalınlığı ve pipet iç çapı belirler. Bazı uygulama, çektirme ve mikro-Demirci de kullanılıyor olabilir sonra manipülasyon pipetler elle kolaylıkla yapılabilir rağmen. Birkaç optimum manipülasyon pipetler üretiminde zaman yatırım yapmak önemlidir. Manipülasyon pipet diyafram düzgün akışını sağlamak için bir embriyo daha geniş olabilir, ama kolayca nüfuz ve utero-tubal kavşak yoluyla ilerleme için yeterli küçük. Gerekir Zona pellucida transfer öncesinde kaldırılmışsa, blastosistleri genellikle daha büyük bir çapa genişletin. Bu durumda, bu trofoektoderm hücrelere herhangi bir zarar görmemesi için daha geniş bir diyafram (130-180 mikron) ile geniş pipetler yapmak için tavsiye edilir. Zona kaldırıldı, özellikle ve enkaz tarafından engellenmiş pipet önlemek için - İpucu lehçe yumurta kanalının, rahim duvarı ve embriyo zarar görmesini önlemek için önemlidir. Ancak, parlatma sonra, diyafram n gerektiğiçapında keskin bir düşüş akış hızındaki ani değişikliklere neden olacak gibi ot, pipet iç çapı ile karşılaştırıldığında çok küçük. Aspiratör ağızlık daha kesin bir akış kontrolü hem de elle kontrol cihazları ile karşılaştırıldığında daha rahat bir el olarak görünmektedir. (Örneğin, lentivirüs ile muamele edilmiş embriyoların işlenirken) gerekirse Bununla birlikte, elle kontrol edilen bir cihaz kullanılabilir. Uygun bir akış ve petrol transferini önlemek için, bunun yerine manipülasyon ortama kültür ortamından embriyolar taşımak için kullanılan embriyo transferi için yeni bir pipet kullanın için de tavsiye edilir. Son olarak, yumurta kanalı yoluyla pipet getirerek ise, kılcal yani, doğrudan ele alınmalıdır. bir tutuş elde etmek için, cam değil aspiratör plastik kulp kapma. Embriyo transferi için kullanılan büyütme cerrahın görme keskinliği bağlıdır kişisel bir konudur. Biz geniş bir görsel alana sahip, düşük büyütme kullanmayı tercih,bu yüzden bir 10X nihai büyütme (10X oküler ve 1X objektif) kullanın.
Alıcıların en az 8 haftalık olacak ve 27-40 g arasında tartmak gerekir. Böyle CD1 veya İsviçre Webster gibi fareler bir iyi maternal davranışlar göstermesi ve mükemmel alıcıları vardır outbreed. Kullanılmayan bu iki hafta içinde normal bisiklet aktivitesini iyileşir gibi, ekstra alıcılar almak için üreme kurmak için tavsiye edilir. Evlendirilen olmasına rağmen, bazı kadınlarda korpus lutea (Şekil 3G) sahip olmayabilir ve bu nedenle transfer edilen embriyo için alıcı olmayacaktır. Bu nedenle, yumurtalık 2.5 de DPC açıkça yumurtalık (Şekil 3F) parlak kırmızı yapılar olarak tanımlanabilir korpus lutea, varlığı kontrol edilmelidir. Yumurtalık ve rahim fazla manipülasyon luteolizis sonuçlanabilir; Ameliyat sırasında yerine yumurtalık yağ pedi kapma üreme sistemi ile temas en aza indirmek için önemlidir. Manipulatio girişyumurta kanalı içine n pipet protokol en karmaşık adımdır. Bazı alıcılarda, yumurtalığa çok bükülmüş ve rahim ile kavşağına 2 mm düz streç yoktur. Bu durumda yumurta kanalının düzenlemek ve ilk viraj ponksiyon. Yukarıda ayrıntılı olarak, güzel bir manipülasyon pipet gerçekten bir fark yaratıyor. Pipet utero-tubal birleşme içinden geçtikten sonra, bu kolayca kayar. Değilse, pipet tubada sapmış ve rahim lümen ulaşamamış olabilir. Medya akış değilse bir kez rahim içinde, hafifçe veya pipet taşımak ve yeniden deneyin. Hala akmıyorsa, pipet manipülasyon medya ile çanak içeriği bırakın ve aynı veya başka bir pipet yeniden, rahim onu çıkarmak, tıkanmış. Teslim genellikle embriyo transferi 17 gün sonra gerçekleşir. Yamyamlık önlemek için, önceden 2 gün malzemeyi yavru sağlamak ve doğumdan sonraki ilk günlerde kafesi değişmez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.
Acknowledgments
Bu çalışma BT Hayvan ve Kuş Bilimleri Bölümü fonları tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | VEDCO | Ketaved ANADA 200-257 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | Anased NADA #139-236 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Buprenorphine | Generic | NDC 400-42-010-01 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Eye ointment | Novartis | Genteal | |
| Antibiotic | Pfizer | Clavamox NADA #55-101. | Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water. |
| Dressing serrated forceps | ROBOZ | RS-8120 | Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work. |
| Microdissecting serrated forceps | ROBOZ | RS-5137 | These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred. |
| Slight curved micro dissection forceps | ROBOZ | RS-5136 | This model is particularly useful to hold the oviduct. |
| Scissors | ROBOZ | RS-5880 | Any regular surgical grade steel small straight scissors will work. |
| 27 G needles | Beckton-Dickinson | 305136 | Smaller needles (30 G) can be also used. 25 G may be a bit too big. |
| Clip applier | MiKRon | 42763 | |
| 9 mm Clips | MiKRon | 427631 | |
| Clip remover | MiKRon | 7637 | Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead. |
| Suture needle holder | ROBOZ | RS-7820 | |
| Suture | Dowist Gell | 5-0 Dexon S 7204-21 | Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle. |
| Glass capillaries | VWR | 100 ul calibrated pipettes 53432-921 | It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 µm filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in Nagy et al.8 |
| Burner | KISAG AG | Typ 2002 | Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame. |
| Stereomicroscope | Leica | MZFLIII | This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot. |
| Fiber optics ilumination | Dolan Jenner | Fiber lite | To iluminate the surgical area. There are different systems available. |
| Warm stages | American scope | http://store.amscope.com/tcs-100.html | These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked. |
| Culture dishes for embryo manipulation | Falcon | 353001 | 351008 may be also used; they made narrower drops. |
References
- Fernandez-Gonzalez, R., et al. Long-term effect of in vitro culture of mouse embryos with serum on mRNA expression of imprinting genes, development, and behavior. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 101, 5880-5885 (2004).
- Bermejo-Alvarez, P., Roberts, R. M., Rosenfeld, C. S. Effect of glucose concentration during in vitro culture of mouse embryos on development to blastocyst, success of embryo transfer, and litter sex ratio. 79, 329-336 (2012).
- Tarkowski, A. K. Experiments on the development of isolated blastomers of mouse eggs. Nature. 184, 1286-1287 (1959).
- Whittingham, D. G. Fertilization of mouse eggs in vitro. Nature. 220, 592-593 (1968).
- McLaren, A., Biggers, J. D. Successful development and birth of mice cultivated in vitro as early as early embryos. Nature. 182, 877-878 (1958).
- McLaren, A., Michie, D. Studies on the transfer of fertilized mouse eggs to uterine foster-mothers. I. Factors affecting the implantation and survival of native and transferred eggs. J. Exp. Biol. 33, 394-416 (1956).
- Goto, Y., et al. The fate of embryos transferred into the uterus. J. Assist. Reprod. Gen. 10, 197-201 (1993).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2003).
- Chin, H. J., Wang, C. K. Utero-tubal transfer of mouse embryos. Genesis. 30, 77-81 (2001).
- Ramirez, M. A., Fernandez-Gonzalez, R., Perez-Crespo, M., Pericuesta, E., Gutierrez-Adan, A. Effect of stem cell activation, culture media of manipulated embryos, and site of embryo transfer in the production of F0 embryonic stem cell mice. Biol. Reprod. 80, 1216-1222 (2009).
- Miller, A. M., Wright-Williams, S. L., Flecknell, P. A., Roughan, J. V. A comparison of abdominal and scrotal approach methods of vasectomy and the influence of analgesic treatment in laboratory mice. Lab. Anim. 46, 304-310 (2012).
- Flecknell, P. A. Laboratory Animal Anaesthesia. , Academic Press. Oxford, UK. (2009).
- Erhardt, W., Hebestedt, A., Aschenbrenner, G., Pichotka, B., Blumel, G. A comparative study with various anesthetics in mice (pentobarbitone ketamine-xylazine,carfentanyl-etomidate). Res. Exp. Med. 184, 159-169 (1984).
- Tarin, D., Sturdee, A. Surgical anaesthesia of mice: evaluation of tribromo-ethanol, ether, halothane and methoxyflurane and development of a reliable technique. Lab. Anim. 6, 79-84 (1972).
- Zeller, W., Meier, G., Burki, K., Panoussis, B. Adverse effects of tribromoethanol as used in the production of transgenic mice. Lab. Anim. 32, 407-413 (1998).
- Lieggi, C. C., et al. Efficacy and safety of stored and newly prepared tribromoethanol in ICR mice. Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 17-22 (2005).
- Lieggi, C. C., et al. An evaluation of preparation methods and storage conditions of tribromoethanol. Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 11-16 (2005).
- Meyer, R. E., Fish, R. E. A review of tribromoethanol anesthesia for production of genetically engineered mice and rats. Lab. Anim. 34, 47-52 (2005).
- Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biol. Reprod. 42, 432-440 (1990).
- Quinn, P., Barros, C., Whittingham, D. G. Preservation of hamster oocytes to assay the fertilizing capacity of human spermatozoa. J. Reprod. Fertil. 66, 161-168 (1982).
- Dios Hourcade, de, Perez-Crespo, J., Serrano, M., Gutierrez-Adan, A., A,, Pintado, B. In vitro and in vivo development of mice morulae after storage in non-frozen conditions. Reprod. Biol. Endocrinol. 10, 62 (2012).
