Summary
Utero-tubarico trasferimento di embrioni utilizza la giunzione utero-tubarica come barriera per impedire la fuoriuscita embrione che si può verificare quando si esegue il trasferimento uterino. Maschi vasectomized sono tenuti ad ottenere destinatari pseudopregnant per il trasferimento di embrioni. Entrambe le tecniche sono discusse.
Abstract
Il trasferimento di embrioni preimpianto ad una femmina surrogata è un passo necessario per la produzione di topi geneticamente modificati o per studiare gli effetti delle alterazioni epigenetiche originati durante lo sviluppo preimpianto sul successivo sviluppo ed adulto salute del feto. L'uso di una tecnica di trasferimento di embrioni efficace e coerente è fondamentale per migliorare la generazione di animali geneticamente modificati e per determinare l'effetto di trattamenti diversi su tassi di impianto e sopravvivenza a termine. Embrioni allo stadio di blastocisti vengono generalmente trasmesse mediante trasferimento uterino, eseguendo una puntura nella parete uterina introdurre la pipetta manipolazione embrione. L'orifizio eseguita in utero non viene chiuso dopo la pipetta è stata ritirata, e gli embrioni possono deflusso alla cavità addominale causa della pressione positiva dell'utero. La puntura può anche produrre una emorragia che altera l'impianto, blocca la pipetta di trasferimento e può influenzare embrione dviluppo, soprattutto quando gli embrioni che non vengono trasferiti zona. Di conseguenza, questa tecnica spesso si traduce in tassi di sopravvivenza partire embrione molto variabili e globali. Evitare questi effetti negativi, utero-tubarica trasferimento di embrioni approfittare della giunzione utero-tubarica come una barriera naturale che impedisce all'embrione di deflusso ed evitare la puntura della parete uterina. Maschi vasectomized sono necessari per ottenere i destinatari pseudopregnant. Una tecnica per eseguire vasectomia è descritto come un complemento al trasferimento di embrioni in utero-tubarica.
Introduction
Il trasferimento embrionale è probabilmente la procedura chirurgica più frequente eseguita nel modello murino. Questa tecnica è essenziale per ottenere discendenza di embrioni sottoposti a tecniche di manipolazione in vitro e, di conseguenza, costituisce un passo necessario per lo sviluppo di modelli geneticamente modificati mediante iniezione pronucleo, trasduzione lentivirale, o formazione di chimera. Inoltre, la tecnica consente di studiare gli effetti dello sviluppo di diverse insulti che si verificano durante lo sviluppo preimpianto. L'uso di tecniche di riproduzione artificiale 1 o l'esposizione a concentrazioni anomale di sostanze o metaboliti 2 diversi possono influenzare lo sviluppo embrionale con conseguente impianto o placentation guasti e gli effetti a lungo termine nella prole. Una tecnica di trasferimento di embrioni affidabile e riproducibile è fondamentale per verificare i possibili effetti negativi del trattamento sperimentale per l'impianto e lo sviluppo del feto in un uomo coerenteNER.
Embrioni murini preimpianto possono essere trasferiti ad una femmina destinatario sia in ovidotto tramite le ampolle di 0,5 giorni dopo coitum (DPC) destinatari pseudopregnant (trasferimento oviduct) 3,4 o nell'utero di 2,5 DPC destinatario pseudopregnant (trasferimento uterina) 5,6 a seconda del loro stadio di sviluppo. Embrioni allo stadio di blastocisti, come quelli utilizzati per generare topi chimerici mediante iniezione di cellule staminali pluripotenti embrionali o indotte, vengono di solito trasferite mediante trasferimento uterino. Blastocisti possono anche essere trasferiti a nell'ovidotto di un DPC destinatario 0.5, ma costituisce una prova meno fisiologica per disgregatori di sviluppo, perché l'embrione subisce diapausa e ha 2 giorni per recuperare dalla insulto prima dell'impianto avviene. Trasferimento uterino comporta perforando la parete uterina con un ago stretta in modo da generare una apertura che consente l'accesso di un embrione manipolazione pipetta nelle cavità uterina. Lanche se questa tecnica può produrre buoni risultati, la sopravvivenza a termine (ossia la percentuale di embrioni trasferiti che si sviluppano ad un cucciolo) è spesso bassa e imprevedibile 7,8.
La puntura della parete uterina comporta alcuni effetti collaterali dannosi. Primo, miometrio è un tessuto altamente vascolarizzato e la sua puntura provoca spesso una piccola emorragia. Il sangue può bloccare la pipetta di trasferimento dell'embrione o invadere il lume uterino causando la morte embrionale e / o guasto dell'impianto. Ciò è particolarmente rilevante quando gli embrioni senza zona vengono trasferiti, come le cellule del sangue e detriti possono allegare i blastomeri. In secondo luogo, l'apertura eseguita non sigilla dopo che gli embrioni sono stati trasferiti, in modo che può rifluire attraverso l'orifizio ed essere espulso alla cavità addominale quando un eccessivo volume è stato introdurre nell'utero. Il trasferimento di embrioni in utero-tubarica qui descritto approfittare della giunzione utero-tubarica per consegnare il embryos nell'utero senza la necessità di bucare la parete uterina e quindi evitando le conseguenze negative 9.
Le femmine destinatario pseudopregnant utilizzati per il trasferimento degli embrioni sono ottenuti per accoppiamento naturale con i maschi vasectomized 8. Le secrezioni seminali prodotti da un maschio sterile sono necessari per l'utero di diventare ricettivo agli embrioni trasferiti. Per ottenere un destinatario, un massimo di 2 femmine di otto settimane a 6 mesi di età sono posti con un maschio vasectomizzato nel pomeriggio. La mattina seguente, le femmine vengono controllati per la presenza di una spina copula vaginale, un ciuffo di proteine coagulate dal liquido seminale maschile. Come accoppiamento avviene di solito durante la mezzanotte, il giorno di rilevazione spina vaginale è considerato 0.5 dpc. Anche se i maschi vasectomized possono essere acquistati presso alcuni fornitori, la procedura chirurgica qui descritta è relativamente facile e non richiede strumenti aggiuntivi di quanto richiesto per il trasferimento degli embrioni.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Beltsville Area cura degli animali ed uso Comitati (BAACUC 11-015) secondo USDA cura degli animali e uso orientamenti.
1. Anestesia e Analgesia (comune per entrambe le procedure chirurgiche)
- Pesare il mouse e caricare i seguenti anestetici e analgesici in due siringhe da 1 ml con 27 aghi G:
- Ketamina (0,1 mg / g: 0,01 ml / g di una soluzione 10 mg / ml) e xilazina (0,01 mg / g: 0.005 ml / g di una soluzione di 2 mg / ml).
- Buprenorfina (0,1 mcg / g: 0,01 ml di una soluzione 0,01 mg / ml).
- Immobilizzare il mouse sollevando la collottola il più vicino alle mascelle il più possibile con il pollice e l'indice e tenendo la coda tra le piccole e anulare.
- Iniettare miscela di ketamina-xylazina intraperitoneale. Al fine di evitare la puntura organi interni, tenere il mouse conla testa leggermente al di sotto del livello dei suoi fianchi (Figura 1A)
- Iniettare buprenorfina per via sottocutanea nella nuca della stiva collo tra il pollice e l'indice (Figura 1B).
- Lasciare il mouse nella gabbia (pulito e senza alcun altro animale) in una fase calda.
- Una volta incosciente, verificare l'assenza di riflesso del piede posteriore (controllato da un pizzico tep). Applicare una pomata oculare per evitare la secchezza degli occhi e per verificare l'assenza di riflesso palpebrale (Figura 1C).
- Questo protocollo fornisce un piano anestesia chirurgica per un minimo di 30 minuti, sufficiente per eseguire le procedure descritte di seguito (protocolli 2 e 3). Se sono necessari tempi più lunghi, un'ulteriore iniezione di ketamina + xilazina con metà della dose descritto in 1.1.1 può essere applicata dopo 30 min. Un cambiamento nel modello di respirazione ad uno più veloce e irregolare indica la loss del piano di anestesia corretta.
2. Vasectomia
- Usare un maschio con una performance comprovata accoppiamento.
- Sterilizzare strumenti chirurgici, pulire le superfici in cui verrà eseguita la chirurgia e asciugarli con il 70% di etanolo.
- Eseguire l'anestesia come precedentemente descritto (Protocollo 1), controllando per la perdita dei riflessi.
- Posizionare il mouse su una fase calda, rimuovere pelliccia con tagliaunghie elettrici dalla zona ventrale tra due linee trasversali immaginarie collocato 0,5 centimetri e 2,5 centimetri al di sopra del pene (Figura 2A).
- Disinfettare la zona rasata pulendo sequenziale con il 10% di povidone iodio e il 70% di etanolo.
- Posizionare il mouse nella posizione supina con la coda verso il chirurgo e coprire con un tovagliolo sterile con un foro di esporre l'area rasata. Illuminare l'area chirurgica.
- Eseguire un incisio pelle longitudinale 10-15 mmn nella linea mediana dell'addome, circa 1 cm sopra il pene. Tenere la pelle con spogliatoio pinza seghettati e poi tagliare con le forbici (Figure 2A e 2B).
- Eseguire una incisione longitudinale 5-10 mm in linea alba. Tenere il muscolo con microdissecting pinze dentellate e tagliare con le forbici (Figura 2C).
- Afferra il cuscinetto adiposo testicolare di un lato con micro dissezione forcipe seghettati e tirarlo per esporre testicolo, deferenti e dell'epididimo. Vasi deferenti si trova mediale al testicolo ed è un tubo libero chiaramente distinguibile (non attaccato al muro testicolo come il epididimo) con un vaso sanguigno che corre lungo un lato (Figura 2D).
- Tenendo il dotto deferente con un micro dissezione seghettato pinze, pinze medicazione fiamma fino a che non diventa rosso (Figura 2E cauterizzare i vasi deferenti in due punti contemporaneamente (Figura 2F). Il taglio dovrebbe rimuovere una porzione di circa 5 mm e lasciare due estremità cauterizzato nettamente separate (Figura 2G).
- Spostare il testicolo, epididimo e deferenti torna alla cavità addominale.
- Procedere dal punto 9 nell'altro testicolo.
- Suturare il muscolo con uno o due punti di sutura materasso orizzontali realizzate con 5/0 sutura riassorbibile (Figura 2H).
- Suturare la pelle con uno o due tagliatori di ferita (Figura 2I).
- Identificare il maschio vasectomizzato (anello di orecchio, dito tatuaggio ...), spostare la gabbia collocata su una fase calda e osservare fino a che non recupera dall'anestesia (cosciente e mantenere decubito sternale). Una iniezione sottocutanea 0,5-1 ml di soluzione salina calda migliora recupero. Registrare le possibili incidenze che si verificano durante il trasferimento vasectomia, aggiungere antibiotico per l'acqua potabile.
- Clip della ferita possono essere rimossi 10 giorni dopo la vasectomia con un dispositivo di rimozione ferita tagliatore o un paio di pinze denti. Il maschio vasectomizzato sarà pronto per accoppiarsi 2 settimane dopo l'intervento chirurgico.
- Provare la sterilità del maschio vasectomizzato da accoppiamento con femmine fertili prima di utilizzarlo per ottenere destinatari.
3. Utero-tubarica Embryo Transfer
- Mouse morule o blastocisti possono essere trasferiti da questa tecnica ad una femmina destinatario pseudopregnant a 2,5 DPC.
- Preparare embrione vetro manipolazione pipetta:
- Lucidare le punte dei capillari di vetro, al fine di evitare danni al titolare pipetta.
- Ammorbidire una porzione centrale del capillare di vetro riscaldando con una bella fiammata mentre leggermente la rotazioneil capillare con entrambe le mani sincrono. Una volta che la sezione capillare diventa morbida e malleabile (colore rosso chiaro), ritirarsi rapidamente dal fuoco e tirare entrambe le estremità per ridurre il suo diametro esterno di 130-150 micron.
- Attendere che il vetro si raffreddi e poi tagliarla con una leggera segnando la parte stretta con una matita a punta di diamante, pietra abrasiva o limetta per unghie e tirando da entrambi i lati. La pausa deve essere pulita e perpendicolare
- Lucidare la punta molto velocemente fiammeggiante, lasciando un'apertura di 100-130 micron. Le pipette possono essere memorizzati per un uso successivo.
- Warm mezzi di manipolazione di embrioni (CZBH o M2, vedi la discussione).
- Sterilizzare strumenti chirurgici, pulire le superfici in cui verrà eseguita la chirurgia e asciugarli con il 70% di etanolo.
- Eseguire l'anestesia come precedentemente descritto (Protocollo 1), controllando per la perdita dei riflessi.
- Mantenere tegli mouse su una fase calda, rimuovere pelliccia con tagliaunghie elettrici dalla zona dorsale tra le ginocchia e le costole distali (Figure 3A e 3B).
- Disinfettare la zona rasata pulendo sequenziale con il 10% di povidone iodio e il 70% di etanolo.
- Spostare gli embrioni dall'incubatore ai mezzi di manipolazione dell'embrione preriscaldata.
- Spostare il destinatario di una fase calda con lo stereomicroscopio e collocarlo in posizione prona lateralmente al chirurgo (con la testa che guarda a destra oa sinistra del chirurgo).
- Coprire l'area con un asciugamano sterile con un foro di esporre l'area rasata e illuminare la zona chirurgica.
- Eseguire da 1 cm trasversale (verticale) incisione nella pelle in un punto situato sulla cranica ⅓ della linea tra l'ultima costola e fianchi e la ⅓ dorsale della linea tra la schiena e l'addome (Figure 3A unnd 3B). Tenere la pelle con spogliatoio pinze dentellate e tagliare con le forbici (Figura 3C).
- Una volta che la pelle è stata tagliata, ovaio (rosso / arancione) o il pad adiposo che circonda l'ovaio (bianco) possono essere visualizzati attraverso la parete del corpo. Eseguire un 0,3-0,5 cm trasversale (verticale) incisione nella parete del corpo sopra l'ovaio o pad adiposo in un punto in cui l'incisione non taglia qualsiasi grande vaso sanguigno. Tenere il muscolo con micro dissezione pinza dentata e tagliare con le forbici (Figura 3D).
- Muovi il mouse per avere la testa rivolta verso il chirurgo.
- Caricare la manipolazione dell'embrione pipetta (Figura 3E):
- Lasciare i media CZBH di salire per capillarità attraverso la parte stretta della pipetta manipolazione fino a circa 5 millimetri della parte più larga.
- Prendete una piccola bolla d'aria (0,2-0,5 mm).
- Introdurre gli embrioni (5-10) inuna quantità minima di media (2-4 mm).
- Prendete un'altra piccola bolla d'aria (0,2-0,5 mm) e una piccola quantità di materiale (0,5-1 mm).
- Lasciare la pipetta di vetro attaccato al titolare aspirazione bocca o al dispositivo azionati a mano, pronta per il passo 3.17.
- Afferra il pad adiposo che circonda l'ovario con micro dissezione pinza dentata e tirarlo verso la testa del mouse per esporre l'ovaio, ovidotto, e una piccola porzione di utero superiore fuori della cavità addominale (Figure 3F e 3G).
- Tenendo il pezzo aspirazione bocca in bocca, pronto per essere utilizzato, afferrare il pad adiposo con micro dissezione pinza dentata per spostare il ovidotto ed esporre la giunzione utero-tubarica (cioè dove l'ovidotto incontra l'utero).
- Mantenere la giunzione utero-tubarica accessibili, prendere lievi curve micro pinza per dissezione con la mano sinistra (destra se consegnato) e metterli subito sottola giunzione utero-tubarica afferrare nell'ovidotto circa 2 mm sopra quella parte.
- Tenendo la giunzione utero-tubarica con le lievi curve micro pinze dissezione, forare la sezione ovidotto vicino alle pinze con un ago G 27 (Figura 3H).
- Inserire l'embrione manipolazione pipetta nel foro effettuato con l'ago e avanzare verso l'utero attraverso la giunzione utero-tubarica (Figure 3I e 3J). Una volta che la pipetta ha superato la giunzione utero-tubarica (Figura 3K) si infila facilmente. Non progredire molto lontano nell'utero per evitare danni endometriale (non più di 3 mm) e pipetta blocco dai detriti.
- Rilasciare gli embrioni nell'utero soffiando delicatamente (figura 3L). Entrambe le bolle d'aria deve passare attraverso l'utero. Alcuni dei supporti oltre la prima bollapuò anche essere rilasciato in utero, ma evitare di introdurre più aria, in quanto può impedire l'impianto.
- Rimuovere la pipetta appena dopo embrioni sono stati rilasciati nell'utero.
- Spostare il ovidotto e ovaio torna alla cavità addominale afferrando il pad adiposo.
- Suturare il muscolo con un punto materasso orizzontale con 5/0 sutura riassorbibile (Figura 3M).
- Suturare la pelle con un clipper ferita (Figura 3N).
- Procedere dal punto 10 sul lato opposto, se necessario.
- Identificare il destinatario (anello di orecchio, dito tatuaggio ...), spostarlo sua gabbia (posto su una fase calda) e osservare fino a che non recupera dall'anestesia (cosciente e mantenere decubito sternale).
- Annotare le possibili incidenze che si verificano durante il trasferimento di embrioni e aggiungere antibiotico per l'acqua potabile. Una iniezione sottocutanea 0,5-1 ml di sali caldoSoluzione ne migliora il recupero.
- Clip della ferita possono essere rimossi 10 giorni dopo il trasferimento di embrioni con un dispositivo di rimozione ferita tagliatore o due paia di pinze (Figura 3O). Il destinatario può essere pesato in quel giorno per valutare la gravidanza e stimare il numero di cuccioli. Fornire materiale adagiato al beneficiario 15 giorni dopo il trasferimento dell'embrione.
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Representative Results
Utero-tubarica trasferimento di embrioni fornisce un mezzo per trasferire gli embrioni in utero evitare alcune delle complicanze associate uterina trasferimento degli embrioni 2,9,10. Nella Tabella 1 mostriamo qualche risultato rappresentativo abbiamo ottenuto il trasferimento di blastocisti CD1 sottoposti a diversi tipi di manipolazioni ai destinatari CD1 seguendo il protocollo descritto. La sopravvivenza a termine (% di embrioni risultanti in un cucciolo) o sopravvivenza a E15 (nel caso di lentivirus esposto) è simile tra embrioni semplicemente coltivate in vitro dallo stadio di zigote (IVC), embrioni sottoposti a iniezione iPSC per generare cuccioli chimerici e embrioni che avevano la loro zona rimosso e sono stati esposti a lentivirus per 7 ore prima del trasferimento dell'embrione. Pertanto, utero-tubarica trasferimento dell'embrione è una tecnica affidabile per trasferire embrioni particolarmente complicati come quelli privi pellucida zona e incubati con lentivirus.
Figura 1. L'iniezione di anestetici e analgesici. A) iniezione intraperitoneale di ketamina-xylazina. B) L'iniezione sottocutanea di Buprenorfina. C) Applicazione di unguento oculare.
Figura 2. . Protocollo vasectomia A) Il punto di incisione (raffigurato con una "X" rossa) si trova a circa 1 cm al di sopra del pene, togliere la pelliccia 0,5-2,5 cm al di sopra del pene (linee nere) B) incisione della pelle C) Muscolo di incisione... deferente D) Vas (freccia nera) e test diè (*). E) Flaming della pinza per cauterizzazione. F) cauterizzazione dei vasi deferenti, in due punti in una sola volta. deferenti G) Vas nettamente separati in due estremità cauterizzare. H) sutura muscolare. I) sutura della pelle. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 3. Utero-tubarica protocollo di trasferimento di embrioni A, B), dorsale e laterale del punto di incisione (raffigurato con una "X" rossa). Linee nere tra l'ultima costola e anche (A, B) e tra schiena e addome (B) servire come guida. C) incisione della pelle.
| Trattamento | Numero di trasferimenti | Embrioni trasferiti | Pups consegnati | Sopravvivenza a term (%) |
| IVC | 11 | 110 | 82 | 74.5 |
| iniezione IPSC | 3 | 50 | 35 | 70.0 |
| Lentivirus | 6 | 60 | 44 | 73.3 |
Tabella 1. Rappresentante risultati ottenuti dopo il trasferimento di tre diversi gruppi di embrioni manipolati seguente utero-tubarica trasferimento di embrioni. 1) Gli embrioni coltivati in vitro (IVC) dallo stadio di zigote allo stadio di blastocisti, 2) In vivo prodotta blastocisti iniettati con 10 mouse iPSC per generare topi chimerici, 3) in vivo prodotto blastocisti che avevano la loro zona rimosso e sono state incubate per 7 ore con un lentivirus che esprimono GFP. I dati rappresentano il numero di cuccioli nati fuori del numero di embrioni trasferiti ad eccezione del gruppo lentivirus esposto, dove rappresentano il numero di feti vivi 10 giorni dopo il trasferimento dell'embrione, in quanto la gestazione non è stata permettono di progredire ulteriormente.
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Discussion
La vasectomia è una tecnica chirurgica in avanti relativamente semplice che non comporta grandi difficoltà. Quando sanificazione con povidone iodio ed etanolo assicurarsi che l'ultimo lavaggio (con etanolo) rimuove povidone iodio, in quanto può irritare il peritoneo. L'accesso al dotto deferente può essere ottenuta anche scroto o eseguendo una incisione trasversale nell'addome 8. Incisione scrotale è stato raccomandato di trasversali incisione addominale dovuto alla incisione relativamente più piccole necessità e un po 'meglio il comportamento post-operatorio 11. Tuttavia, noi preferiamo l'incisione addominale sopra il scrotale perché fornisce una semplice e più chiaro l'accesso alla vasi deferenti da entrambi i testicoli, prevenendo i chirurghi inesperti da cauterizzare due volte lo stesso deferenti e lasciando una vas deferente funzionale. Tra le due tecniche addominali, privilegiamo l'incisione longitudinale in linea alba sopra la Transversal perché non taglia qualsiasi fibra muscolare addominale, evitando lo sviluppo di ernie addominali. Tuttavia, sia vasectomia e protocolli di trasferimento di embrioni in utero-tubarica possono essere adattati alle attrezzature disponibili o ai gusti personali del ricercatore. Per esempio, uno sterilizzatore perle di vetro può essere utilizzata per riscaldare le pinze utilizzati per cauterizzare il dotto deferente. In ogni caso, è indispensabile seguire una tecnica asettica, per fornire un'adeguata anestesia e analgesia al fine di massimizzare il benessere degli animali, e per rispettare le normative locali.
Un altro aspetto suscettibile di modifiche è il protocollo di anestesia. Se l'anestesia inalatoria (isoflurano) è disponibile, noi incoraggiamo l'uso invece di anestesia parenterale (iniettabile), in quanto fornisce un piano di anestesia molto stabile e rapido recupero. Tuttavia, è importante affermare che l'anestesia inalatoria richiede ancora l'uso di un analgesico per il dolore intra e post-operatoria, che dovrebbe essere autoristered prima della chirurgia come premedicazione. La buprenorfina è un oppioide che forniscono analgesia lungo termine nel topo 12. Anestesia parenterale fornisce anche un buon piano anestetico per le procedure brevi come la vasectomia e trasferimento di embrioni. Ketamina-xylazina è una combinazione molto affidabile per la chirurgia del mouse 13 e non abbiamo mai osservato eventuali complicanze anestesiologiche utilizzando questa combinazione in combinazione con una premedicazione con buprenorfina. Altre combinazioni parenterali possono essere usate 12, ma si scoraggiano l'uso della miscela narcotico avertin (tribromoethanol), in quanto solo una singola dose può essere amministrare e più articoli hanno riportato complicazioni diversi associati al suo uso come irritazione locale, scarsa analgesia, ileo , aderenze fibrose nella cavità addominale, necrosi delle fibre muscolari sottoperitoneale e gli organi addominali di superficie, e anche la mortalità 14-18.
Trasferimento di embrioni richiede una buona gestione di entrambi gli embrioni di und destinatario. Come regola generale per i mammiferi trasferimento di embrioni, lo stadio di sviluppo degli embrioni può essere più avanzata rispetto alla fase pseudogravidanza del destinatario, ma non il contrario. In altre parole, gli embrioni possono aspettare per la madre, ma la madre non possono aspettare gli embrioni, per cui questa tecnica può essere utilizzata per trasferire morule o blastocisti, ma non stadi precedenti. Utero-tubarica trasferimento degli embrioni può essere eseguita due giorni dopo la rilevazione della spina vaginale da mezzogiorno (2,5 DPC) alla sera-notte (3 DPC), quando la giunzione utero-tubarica è aperto per permettere il transito naturale degli embrioni dal oviduct a corna uterine. Considerando che gli embrioni trasferiti potrebbero avere già sofferto di un qualche tipo di manipolazione, movimentazione embrione dovrebbe ridurre al minimo ulteriori danni. Un'ottima guida per la manipolazione del mouse embrione può essere trovato in Nagy et al. 8 I due mezzi di manipolazione dell'embrione più comunemente usati topo, che contengono un pH fisiologico normale amosphere, sono CZBH 19 e M2 20. Anche se in vivo prodotta embrioni di topo in grado di superare l'esposizione al freddo o pH anormale per lunghi periodi di 21, i media di manipolazione devono essere preriscaldata. Se il supporto viene preriscaldata in un piatto di cultura, di evitare il riscaldamento per lunghi periodi (più di 40 min), come l'osmolarità dei media aumenterà a causa dell'evaporazione dell'acqua e che può essere più dannoso che i media manipolazione freddo. Allo stesso modo, il tempo gli embrioni trascorso all'interno della pipetta manipolazione deve essere ridotto al minimo a causa del piccolo volume presente nella pipetta.
L'uso di una pipetta corretta manipolazione embrione è cruciale per il successo del protocollo. Pipette di manipolazione possono essere effettuate da capillari di vetro con una parete di vetro sottile. Pipette Pasteur, spesso utilizzati per gestire grandi embrioni animali, possono anche essere impiegati, ma a causa della sua distanza dalla maniglia alla punta, pipette di manipolazione a base di capillari di vetro sono più comfortable di manovra. L'esposizione alla fiamma e velocità di tirare determinare lo spessore della parete e il diametro interno della pipetta. Anche se pipette manipolazione può essere fatto facilmente a mano dopo possono essere usati anche una certa pratica, estrattore e micro-forge. E 'importante investire tempo nella produzione di vari pipette ottimali di manipolazione. L'apertura pipetta manipolazione deve essere più ampia di un embrione per consentire un flusso regolare, ma abbastanza piccolo per penetrare e progredire attraverso la giunzione utero-tubarica facilmente. Se zona pellucida è stata rimossa prima del trasferimento, blastocisti solito si espandono per un diametro maggiore. In questo caso, si consiglia di rendere più ampi pipette con un diaframma più aperto (130-180 micron) per evitare danni alle cellule trophectoderm. Suggerimento smalto è importante per evitare di danneggiare il ovidotto, parete uterina e l'embrione - soprattutto se zona è stato rimosso, e per evitare la punta della pipetta venga bloccato da detriti. Tuttavia, dopo la lucidatura, l'apertura dovrebbe not essere troppo piccolo rispetto al diametro interno della pipetta, come forte diminuzione di diametro causerà bruschi cambiamenti di velocità del flusso. Il boccaglio aspiratore fornisce un controllo di flusso più precisa e una posizione della mano più comoda rispetto ai dispositivi controllati a mano. Tuttavia, un apparecchio portatile controllata può essere utilizzato, se necessario (ad esempio durante la manipolazione embrioni lentivirus trattati). Per un flusso ottimale e per evitare il trasferimento di olio minerale, è consigliabile utilizzare una nuova pipetta per trasferimento di embrioni invece di quello utilizzato per spostare gli embrioni di terreni di coltura ai media manipolazione. Infine, introducendo la pipetta attraverso l'ovidotto, il capillare deve essere effettuata direttamente, cioè. afferrando il vetro e non il manico in plastica dell'aspiratore, per ottenere una presa salda. L'ingrandimento utilizzato per il trasferimento di embrioni è una questione personale che dipende dalla acuità visiva del chirurgo. Preferiamo utilizzare basso ingrandimento di avere un ampio campo visivo,quindi usiamo un finale di ingrandimento 10X (10X oculare e obiettivo 1X).
I beneficiari dovrebbero essere almeno 8 settimane di vita e pesano tra i 27-40 g. Outbreed topi come il CD1 o svizzero Webster mostrano un buon comportamento materno e sono ottimi destinatari. Si consiglia di impostare l'allevamento per ottenere destinatari aggiuntivi, come quelli non utilizzati si riprenderà la sua normale attività ciclistica in due settimane. Nonostante sia accoppiato, alcune femmine non possono avere corpo luteo (Figura 3G) e quindi non saranno ricettivi agli embrioni trasferiti. Per questo motivo, le ovaie devono essere controllati per la presenza di corpi lutei, che a 2,5 DPC può essere chiaramente identificato come strutture rosso brillante nell'ovaio (Figura 3F). Durante l'intervento è importante ridurre al minimo il contatto con il tratto riproduttivo afferrando pad adiposo ovarica invece; manipolazione eccessiva delle ovaie e dell'utero può provocare luteolisi. L'introduzione del manipulation pipetta nel ovidotto è il passo più complicato del protocollo. In alcuni destinatari, l'ovidotto è molto contorta e non c'è un rettilineo 2 mm dal bivio con l'utero. In tal caso organizzare ovidotto ed eseguire la puntura nella prima curva. Come indicato in precedenza, un bel manipolazione pipetta fa davvero la differenza. Una volta che la pipetta è passato attraverso la giunzione utero-tubarica, si infila facilmente. Se non lo fa, la pipetta potrebbe aver deviato dalla ovidotto e non ha raggiunto il lume uterino. Una volta dentro l'utero, se il supporto non scorre, spostare la pipetta leggermente fuori o dentro e riprovare. Se ancora non scorre, la pipetta è intasato, prendere fuori dall'utero, rilasciare il contenuto nel piatto con mezzi di manipolazione e ricaricare la stessa o altra pipetta. La consegna avviene solitamente 17 giorni dopo il trasferimento dell'embrione. Per evitare il cannibalismo, fornire il materiale immerso 2 giorni in anticipo e non cambiano la gabbia durante i primi giorni dopo il parto.
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Disclosures
Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da fondi del Dipartimento di Scienze Animali e aviaria a BT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | VEDCO | Ketaved ANADA 200-257 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | Anased NADA #139-236 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Buprenorphine | Generic | NDC 400-42-010-01 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Eye ointment | Novartis | Genteal | |
| Antibiotic | Pfizer | Clavamox NADA #55-101. | Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water. |
| Dressing serrated forceps | ROBOZ | RS-8120 | Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work. |
| Microdissecting serrated forceps | ROBOZ | RS-5137 | These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred. |
| Slight curved micro dissection forceps | ROBOZ | RS-5136 | This model is particularly useful to hold the oviduct. |
| Scissors | ROBOZ | RS-5880 | Any regular surgical grade steel small straight scissors will work. |
| 27 G needles | Beckton-Dickinson | 305136 | Smaller needles (30 G) can be also used. 25 G may be a bit too big. |
| Clip applier | MiKRon | 42763 | |
| 9 mm Clips | MiKRon | 427631 | |
| Clip remover | MiKRon | 7637 | Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead. |
| Suture needle holder | ROBOZ | RS-7820 | |
| Suture | Dowist Gell | 5-0 Dexon S 7204-21 | Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle. |
| Glass capillaries | VWR | 100 ul calibrated pipettes 53432-921 | It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 µm filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in Nagy et al.8 |
| Burner | KISAG AG | Typ 2002 | Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame. |
| Stereomicroscope | Leica | MZFLIII | This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot. |
| Fiber optics ilumination | Dolan Jenner | Fiber lite | To iluminate the surgical area. There are different systems available. |
| Warm stages | American scope | http://store.amscope.com/tcs-100.html | These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked. |
| Culture dishes for embryo manipulation | Falcon | 353001 | 351008 may be also used; they made narrower drops. |
References
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