Summary
Протокол описано, что использует аноксии / голодание в С. Элеганс по моделированию ишемии / реперфузии. Функциональные результаты включают повышенную смертность, видимые отклонения в GFP-меченых нейронов процессов, и нарушение поведенческих реакций, которые требуют функции нейронов.
Abstract
Протоколы для аноксии / голода в генетическая модель организма C. Элеганс имитировать ишемии / реперфузии. Черви отделены от бактериальной пищи и помещен под аноксии в течение 20 часов (имитация ишемия), а затем переехал в нормальной атмосфере с пищей (имитация реперфузии). Это экспериментальные результаты парадигма в повышенной смертности и повреждения нейронов и методов представлены для оценки жизнеспособности организма, изменения в морфологии сенсорный нейрон процессов, а также чувствительность клавиатуры, который представляет собой поведенческий выход функции нейронов. Наконец, метод построения гипоксические инкубаторы использовании контейнеров общая кухня хранения описывается. Добавление блока управления массового расхода позволяет изменения должны быть внесены в газовой смеси в пользовательских инкубаторов, и ванна с циркулирующей водой позволяет как контроль температуры и позволяет легко определить утечки. Этот метод обеспечивает недорогую альтернативу коммерческиединиц измерения.
Introduction
С. Элеганс является нематода, которая была широко принята в качестве многоклеточного эукариотической модельного организма с момента ее введения по Бреннер 1. Это дешевый, простой и универсальной моделью, которая позволяет легко связи между генетическими изменениями и фенотипических изменений 2.
Ишемия характеризуется отсутствием питательных веществ и подачи кислорода к ткани, с последующей реперфузией, когда взрыв активных форм кислорода производится 3 и в большинстве случаев ущерб. В 2002 году модель ишемии / реперфузии (ИК) в С. Элеганс был разработан 4 с участием представления весь червя аноксии, питательной лишений и теплового стресса в течение примерно 20 часов с последующим 24 часов при нормальных условиях. Хотя эта модель технически гипоксия-голодание (АС) состояние, гибель клеток происходит с помощью механизмов, которые сохраняются у млекопитающих, в том числе повреждений, вызванных окислителями при реперфузии <SUP> 5. Кроме того, похоже на ИК млекопитающих, повреждение индуцируется как в C. Элеганс можно предотвратить путем предварительной ишемической 6,7 или анестезирующего предварительной 8,9.
Приведенные ниже протоколы показывают, как имитировать ИК в С. Элеганс с использованием модели AS, как забить морфологические и поведенческие отклонения, возникающие в результате AS, и как адаптировать протокол таким образом, что позволяет эксперимент будет проводиться с меньшей первоначальных инвестиций, используя изготовленный на заказ, легко-построенную камеру альтернативу .
Protocol
1. С. Элеганс Рост
- Подготовка 35 мм нематода Рост СМИ (NGM) агаром засевают OP50 бактерий, как в стандартных методов выращивания 1.
- Синхронизация С. Элеганс путем размещения 6 взрослых беременной на сеяной NGM пластины. Удалить взрослых после ~ 100 яйца были заложены (~ 3 ч).
- Инкубируйте пластин течение 3 дней при 20 ° С, после чего черви разработали для молодой взрослой стадии и оптимальных для данного эксперимента. Альтернативные протоколы для синхронизации C. Элеганс описаны в других 10.
2. Материалы для AS
- M9 буфера (22 мМ KH 2 PO 4, 42 мМ Na 2 HPO 4, 86 мМ NaCl, 1 мМ MgSO 4) должны быть очищены кислорода уравновешивания с N 2 (аргон также могут быть использованы) в течение 30 мин до эксперимента и выдерживают в окружении льда.
- Сделайте небольшое отверстие (3 ммв ширину) в крышке 1,5 мл микропробирок, в котором будут размещены черви во AS. Отверстие позволяет газообмена, не держа крышку открытой, так как это может привести к чрезмерному испарению СМИ.
3. Аноксия / Голод
- Проведение всех экспериментах по крайней мере в трех экземплярах.
- Добавьте 1 мл РТ, кислородом буфер M9 каждому 35 мм пластины, содержащей молодых взрослых червей, выращенных как описано выше. Будьте осторожны, чтобы избежать удаления бактерий из пластины (добавить M9 к краям, где бактерии не были посеяны). После ~ 1 мин черви должны быть купание в M9.
- Пальто с пипетки 1 мл с BSA с помощью пипетки и изгнав стерильный 1% раствор BSA.
- Осторожно наклонить пластину, содержащую червей в M9 буфера, удалите M9 с того же места, где он был добавлен, и поместите подвеску в подготовленных микропробирок. Пусть отдых в лед, пока черви не упали на дно трубок (~ 1-2 Мин).
- Удалить максимальное количество M9 возможное, не нарушая червей из трубки (оставляя вокруг 100 мкл), добавить 1 мл кислорода продутую и льдом M9 и поместите трубку на льду до черви не оседают на дно снова. Повторите последний шаг 3 раза. В последней промывки, удалите M9 до ~ 100 мкл не остается в трубке.
- Поместите пробирки с червями в венозная M9 внутри бескислородной / гипоксического камеры (см. инструкции ниже, раздел 3.6.1) или, наоборот, в пользовательских закрытой посуде (см. инструкцию ниже, раздел 3.6.2).
- Если коммерческий бескислородной / гипоксическая камера будет использоваться, оставить немного очищенный M9 внутри камеры перед началом шаг 3,5 и повторите шаг 3,5 раз черви внутри камеры.
- Если пользовательский камера должна быть использована, подробное описание того, как создать устройство дешевое представлена в конце этого протокола и был описан ранее другой группой 11. Кратко:
- Поместите червей в камеру и уплотнения камеры с использованием крышку.
- Газ с постоянной N 2 потока (100 мл / мин).
- Поместите контейнер внутри водяной бане при 26 ° С. Убедитесь, что выпускная труба хорошо погружен в воду таким образом, никакие воздушные возвращается, и что нет никаких утечек в системе (видимой пузырьками, вытекающих из самой камеры).
4. Имитация Реперфузия
- После 20 часов в условиях, удалите трубки от инкубационной камере в комнатном воздухе.
- Внесите С. Элеганс с наконечником BSA покрытием (как в шаге 3.3) на на OP50 высевают 35 мм NGM пластины. Инкубируйте пластин при 20 ° С в течение 24 часов.После этого, черви будут готовы забито.
5. Выявление Dead Versus живых червей
- Использование платины выбор, следует нажать на верхнюю часть головы червя. Живые черви двигаться в обратном направлении после того, как коснулся. Если черви нечувствительность, забить, как мертвый. Иногда, червь не будет двигаться в обратном направлении, но может проявлять небольшую стороны в сторону движения головы. Хотя технически не мертв, эти черви почти наверняка истекает в течение нескольких часов, и должен быть засчитан, как мертвый. Если один ждет слишком долго, чтобы забить червей, внутренняя штриховка потомства может произойти и эти "мешки-из-червей" может привести к разрыву, что делает обнаружение туши очень сложно.
- Снять оба живые и мертвые червей от пластины, как они подсчитываются, чтобы избежать дубликатов пунктам. Живые черви могут быть перемещены в отдельную тарелку для выполнения поведенческих анализов. Количество живых червей по отношению к общей представлено в виде% от выживших червей (Фиг.1А
6. Прикоснитесь Пробирной Response
- Подробное описание этого протокола была представлена в Харт, Энн С., под ред. Поведение (3 июля 2006), WormBook, изд. С. Элеганс Научно-исследовательское сообщество, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org.
- Чтобы забить для сенсорного ответ, определить червей, которые двигаются и слегка касались сторону головы червя (около средней части глотки) с ресниц киркой (рис. 3).
- Если червь движется назад, набрать как можно реагировать, если нет, то набрать как нечувствительность (рис. 1В). Повторите этот шаг 10-15x для каждого червя с 10-секундными интервалами. Зонд не менее 10 червей в каждой группе, чтобы иметь точные данные. То же анализ может быть использован для оценки изменений вперед локомоторных следующее легкое прикосновение к задней стенке кузова. Будьте уверены, чтобы не коснуться головы или хвоста червя, так как это стимулирует явное поведение.
- Наконец, вкорпоративные штаммы генетического контроля [N2 Бристоль дикого типа для положительного, тес (механосенсорных) мутанта за негативное - например CB1338 тес-3 (e1338) IV] для калибровки сила, с которой трогать червей. Слишком суровая из стимуляции будет вызывать поведенческую реакцию в MEC мутантов, слишком мало не будет вызывать эффект в дикого типа N2 управления.
7. Нейронов Модификации
- Для визуализации пост, как нейронные модификаций, использовать штамм, которая выражает GFP в сенсорных отвечая MEC нейронов 4,5. Эти нейроны имеют длинные процессы, которые запускаются вместе стенки тела и легко забил за морфологических аномалий. Кроме того, морфологический информация может быть интегрирована с поведенческими мерами функции нейронов, как описано выше. Один штамм, который может быть использован для этой цели является TU2583, который доступен от С. Элеганс-генетический центр и содержит uIs25 интегрированный трансген, выразив GFP сюдам в тес-18 промотор, или в качестве альтернативы TU2562, в котором содержится комплексный тес-3 :: GFP синтеза.
- Подготовка агарозном площадку.
- Растопить 2% агарозы в воде, довести до 1x M9 с 10-кратным складе, и поддерживать решение при 70 ° С
- Поместите каплю (~ 20 мкл) этого раствора на предметное стекло (25 мм х 75 мм), который был размещен между двумя другими горками, каждый из которых имеет один кусок ленты на их нижней стороне.
- Поместите окончательного предметное стекло перпендикулярно первому на верхней части 2%-ного раствора агарозы, и дайте ему остыть при комнатной температуре. Это должно образуют прокладку, которая толщина ленты.
- Снимите верхнюю слайд и добавить 10 мкл M9, содержащие 0,1% tetramisole, которые будут иммобилизации червей.
- Перемещение некоторых (~ 10) жить червей на 2% агарозном слайда. Поместите покровное над ними и визуализировать GFP с помощью флуоресцентного микроскопа под цели 100X с соответствующим освещением.
- Поврежденныйнейроны покажет цитозольный мембраны нитка жемчуга узором в процессах, состоит из нескольких Punctum (рис. 2А), и / или аномалии, где процессы в виде прерывистых (рис. 2В). Всего Punctum и аномалии в обоих нейронов для каждого червя, используя в общей сложности не менее 10 червей.
8. Лаборатория производства Гипоксическая палата
- Tupperware стиле, закрывающийся, герметичный контейнер может быть модернизации в качестве бескислородной камере. Позаботьтесь, чтобы выбрать контейнер, который, как малые, как это осуществимо. Небольшой контейнер создает гипоксического среду быстрее и легче, чтобы уместиться в водяной бане (рис. 4).
- Сделать два отверстия на крышке (может быть сделано с помощью отвертки или нагреванием щипцы и заставляя в крышку) и вставить из пластмассы или металла разъем, который подходит трубки (рис. 5А). Используйте клей, который может быть размещен под водой, а также получает жесткий после сушки, избегая движенияразъем и, следовательно, снижает вероятность утечки (рис. 5б).
- Контейнер должен быть помещен в водяной бане так, чтобы он полностью погружен в воду (рис. 4). Чтобы погрузить контейнер, использовать вес бутылки или вес дайвинг.
- Один из соединений трубопроводов будет использоваться для введения газовой смеси, а другой труба будет действовать как сброса давления, следовательно, он должен быть оставлен под водой, так что контейнер изолирован от внешней среды (рис. 4).
- Состав воздуха можно модулировать с помощью на заказ газ, Регуляторы расхода газа или любую аппаратуру, которая смешивает нужные газы. Поток газа должны контролироваться, как высокий расход может создать чрезмерное испарение. Например, в контейнере 250 мл, 100 мл / мин газообразного будет обеспечивать хорошее место для червей и подходящий поток.
- Длина трубки должна быть сведена к минимуму, так как они могут быть проницаемыми для газ,llowing вход O 2. Важно, чтобы избежать использования силикон, Tygon трубки, эти материалы являются проницаемыми для газообмена. Мы предпочитаем полипропиленовые или нейлоновые трубки. Стекла или металла труб поддерживать газы хорошо, но также сложнее работать.
Representative Results
Подвергая C. Элеганс до 20 часов по состоянию на 26 ° С в пользовательском лабораторного производства инкубационного камере, как описано (раздел 3.6.2) привели к значительному смертности (рис. 1А) 5. После люминесцентные визуализации Punctum и перерывов в GFP помечены нейронных процессов выживших подтвердили наличие морфологических аномалий (рис. 2). Оставшиеся в живых также ответил на прикосновения неточно света стенки тела (рис. 1В). Эта модель была использована несколько групп, чтобы изучить, как генетическая предрасположенность, фармацевтической вмешательство, и метаболический пластичность влияет как зависимые результаты 4-6,8,9,12,13.
Рисунок 1. С. Элеганс ответ выживание и сенсорный послеAS.) Процент червей, которые обладают 24 ч после AS выживания. Штамм N2 является генетический фон дикого типа, и KWN85 содержит интегрированный трансген, задающий заголовок MEC нейроны с GFP. B) ответ прикоснуться стимулы живых C. Элеганс (N2 Процедить) А.С.. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Сенсорный нейрон изменения А.С.. Сенсорный нейрон (PLML и PLMR) нарушения, такие как извилистых процессов и перерывов (A) или накопление GFP агрегатов в процессах (В) были проверены в сохранившихся анестезии С. eleg ответ А.С..
Рисунок 3. Ресницы выбор. Собраны ресниц выбор. На вставке, деталь ресницы приклеены к зубочистки дерева.
Рисунок 4. Лаборатория производства гипоксическая камера внутри водяной бане. Закрытый контейнер готов начать эксперимент. Стрелки указывают вход газа и выход и вес бутылки используется, чтобы она не плывет.
231fig5.jpg "/>
Рисунок 5. Подробная информация о внутренней и внешней стороне крышки контейнера. A) внешней стороне крышки контейнера, что указывает на трубу и ее разъем прикреплен к предварительно полученным отверстие. B) внешней стороне крышки контейнера, что указывает на Патрубок прикрепленный к предварительно полученным отверстие.
Discussion
Как уже широко используется в С. Элеганс по моделированию ИК травмы. Некоторые ключевые моменты должны быть выделены для этого протокола: C. Элеганс устойчивы к широкому кругу травм, обосновывая необходимость 3 сопутствующих оскорблений (тепло, голодном и гипоксия) для достижения смерть с помощью этой системы. Одна Аноксия не убивает червей в этом окне времени 14. Кроме того, повышение температуры дополнительный стресс, поэтому важно внимательно следить. Строго говоря, голод не вносит значительного вклада со степенью смертности наблюдается 7, по существу, но это, кажется, уменьшает изменчивость среди экспериментальных повторах. Учитывая, что не может быть значительные колебания от изо дня в день, крайне важно, чтобы сравнить образцы запускаются прямо параллельно, и повторить эксперименты на нескольких дней. В общем, результаты измеряются в течение трех отдельных пластин 50-100 червей / экспериментальных условиях, и онин среднем и считается одной экспериментальной репликации. Как правило, от семи до девяти повторов, как представляется, достаточно для достижения или исключить статистической значимости.
Стадия развития червей, используемых в эксперименте также должна быть тщательно проверены как восприимчивости разных этапах как повреждения значительно 15,16 меняется. Использование молодых людей является стандартным, и личиночной стадии (L3 и L4) червей, кажется, более устойчивы к разрушающему воздействию AS (неопубликованные данные).
Этот протокол представляет два пути для выполнения экспериментов, один с помощью лабораторного производства аппарата (используя Tupperware типа контейнеров и подачу газа 11) и другие, используя коммерческий гипоксического камеру 4,6. Anoxia может быть достигнуто с помощью других средств, которые потребляют кислород, как описано в другом месте 13,17. Использование альтернативных методов для создания гипоксических окружающей среды может изменить как инкубация время, необходимоечтобы создать нужное количество смерти. Ориентация ~ 20% выживаемости является идеальной отправной точкой для изучения защитных мер, в то время как 80% является так же идеально подходит для мероприятий, которые усугубляют негативные последствия AS. Еще один важный нюанс является время, в которое набирает наблюдателей мертвые / жив черви. Если время для анализа расширяется за пределы 24 часов, данные могут вводить в заблуждение, так как мертвые черви становятся все более трудно определить. Это может быть связано с червь туши становится относительно прозрачной в течение долгого времени, но и с тем, что оплодотворенные эмбрионы могут перерасти в потомства вскрытии внутри туши и нарушить их по мере их появления.
Анализ морфологии нейронов могут быть изменены, чтобы посмотреть на паттернов экспрессии белка 18, ядерной фрагментации 4 и других параметров 19, заменяя червь штамма, который экспрессирует соответствующий генетически закодированного маркер. И последнее предостережение, что визуализациянейронные процессы должно быть сделано не более 30 мин после размещения червей на слайде. Животных, содержащихся под наркозом на слайдах для более длительные сроки могут проявлять AS-независимый ущерб. Отрегулируйте количество животных на слайд в зависимости от времени, необходимого для отслеживания и анализа их.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Рисунки 1 и 2 были ранее опубликованы в Free Radical Biology & Medicine (Queliconi соавт. 5) и имеют Авторское право принадлежит Elsevier. Эта работа была поддержана Fundação де Ампаро à Pesquisa сделать Estado де Сан-Паулу (FAPESP), Национальным институтом Ciencia электронной Tecnologia де Processos Редокс ет Biomedicina, в Nucleo де Apoio à Pesquisa де Processos Редокс эм Biomedicina, USPHS NS064945 (KN) и USPHS GM087483 (KN ). Барбекю является докторант поддерживается общение FAPESP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N2 strain | CGC | Wild type strain. http://www.cbs.umn.edu/CGC/ |
|
| TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP) | CGC | TU2583 | integrated fluorescent transgene used to label touch neurons. http://www.cbs.umn.edu/CGC/ |
| CB1338 mec-3 (e1338)IV | CGC | CB1338 | canonical mec-3 mutant that is touch insensitive. http://www.cbs.umn.edu/CGC/ |
| Microcentrifuge Tube | Eppendorf | 0030 120.086 | |
| Nikon Eclipse TE2000-U Microscope | Nikon USA | TE2000-U | |
| Low Temperature Incubator | Sheldon Manufacturing Inc. | Model 2005 | |
| Eyelash Pick | An eyelash pick can be prepared by attaching an eyelash onto a wooden toothpick, then attaching the toothpick in a glass Pasteur pipette (Figure 3). | ||
| Hypoxic Chamber | Coy | 8307030 | Hypoxic Glove box equipped with paladium catalyst and CO2 controller. |
References
- Brenner, S.
- Maine, E. M. Studying gene function in Caenorhabditis elegans using RNA-mediated interference. Briefings Funct. Genom. Proteom. 7 (3), 184-194 (2008).
- Vanden Hoek,, L, T., Shao, Z., Li, C., Zak, R., Schumacker, P. T., Becker, L. B. Reperfusion injury on cardiac myocytes after simulated ischemia. Am. J. Physiol. 270 (4), 1334-1341 (1996).
- Ba Scott,, Avidan, M. S., Crowder, C. M. Regulation of hypoxic death in C. elegans by the insulin/IGF receptor homolog DAF-2. Science. 296 (5577), 2388-2391 (2002).
- Queliconi, B. B., Marazzi, T. B. M., et al. Bicarbonate modulates oxidative and functional damage in ischemia-reperfusion. Free Rad. Biol. Med. 55, 46-53 (2013).
- Wojtovich, A. P., DiStefano, P., Sherman, T., Brookes, P. S., Nehrke, K. Mitochondrial ATP-sensitive potassium channel activity and hypoxic preconditioning are independent of an inwardly rectifying potassium channel subunit in Caenorhabditis elegans. FEBS Lett. 586 (4), 428-434 (2012).
- Dasgupta, N., Patel, A. M., Scott, B. A., Crowder, C. M. Hypoxic Preconditioning Requires the Apoptosis Protein CED-4 in C. elegans. Curr. Biol. 17 (22), 1954-1959 (2007).
- Jia, B., Crowder, C. M. Volatile anesthetic preconditioning present in the invertebrate Caenorhabditis elegans. Anesthesiology. 108 (3), 426-433 (2008).
- Wojtovich, A. P., Sherman, T. A., Nadtochiy, S. M., Urciuoli, W. R., Brookes, P. S., Nehrke, K. SLO-2 is cytoprotective and contributes to mitochondrial potassium transport. PloS One. 6 (12), e28287 (2011).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
- Fawcett, E. M., Horsman, J. W., Miller, D. L. Creating defined gaseous environments to study the effects of hypoxia on C. elegans. J. Vis. Exp. (65), e4088 (2012).
- Butler, J. A., Mishur, R. J., Bokov, A. F., Hakala, K. W., Weintraub, S. T., Rea, S. L. Profiling the anaerobic response of C. elegans using GC-MS. PLoS One. 7 (9), 10-1371 (2012).
- Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. Dephosphorylation of cell cycle-regulated proteins correlates with anoxia-induced suspended animation in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol. Cell. 13 (5), 1473-1483 (2002).
- Jiang, H., Guo, R., Powell-Coffman, J. The Caenorhabditis elegans hif-1 gene encodes a bHLH-PAS protein that is required for adaptation to hypoxia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7916-7921 (2001).
- Twumasi-Boateng, K., Wang, T. W., et al. An age-dependent reversal in the protective capacities of JNK signaling shortens Caenorhabditis elegans lifespan. Aging Cell. 11 (4), 659-667 (2012).
- Wang, Y., Chen, J., Wei, G., He, H., Zhu, X., Xiao, T., Yuan, J., Dong, B., He, S. S. kogerbøG., Chen, R. The Caenorhabditis elegans intermediate-size transcriptome shows high degree of stage-specific expression. Nucleic Acids Res. 39 (12), 5203-5214 (2011).
- Perry, C. N., Huang, C., Liu, W., Magee, N., Carreira, R. S., Gottlieb, R. Xenotransplantation of mitochondrial electron transfer enzyme, Ndi1, in myocardial reperfusion injury. PloS One. 6 (2), e16288 (2011).
- Chai, Y., Li, W., Feng, G., Yang, Y., Wang, X., Ou, G. Live Imaging of Cellular Dynamics During Caenorhabditis elegans Postembryonic Development. Nature Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).
- Nehrke, K. A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span. J. Biol. Chem. 278 (45), 44657-44666 (1074).
