Ein Anoxia-Hunger-Modell für Ischämie / Reperfusion in Published: March 11, 2014 doi: 10.3791/51231

DOI

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Bruno B. Queliconi¹, Alicia J. Kowaltowski¹, Keith Nehrke²

¹Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, ²Department of Medicine, Nephrology Division, University of Rochester Medical Center, School of Medicine and Dentistry

Summary

Ein Protokoll beschrieben, das Anoxie / Hunger in C verwendet elegans zu modellieren Ischämie / Reperfusion. Funktionelle Ergebnisse sind eine erhöhte Sterblichkeit, sichtbare Veränderungen in GFP-markierten neuronalen Prozesse und die Beeinträchtigung der Verhaltensreaktionen, die neuronale Funktion benötigen.

Abstract

Protokolle für Anoxie / Hunger in der genetischen Modellorganismus C. elegans simulieren Ischämie / Reperfusion. Würmer sind aus Bakterien Nahrung für 20 Stunden (simulierten Ischämie) abgetrennt und unter Sauerstoffmangel angeordnet ist, und anschließend zu einer normalen Atmosphäre mit Lebensmitteln (simulierte Reperfusion) bewegt. Diese experimentelle Paradigma führt zu einer erhöhten neuronalen Schäden und Tod und Techniken werden vorgestellt, um die Lebensfähigkeit der Organismen, Änderungen der Morphologie von Touch-Neuron Prozesse sowie Berührungsempfindlichkeit, die die Verhaltensleistung von neuronalen Funktion stellt beurteilen. Schließlich wird ein Verfahren zur Konstruktion hypoxischen Inkubatoren mit Gemeinschaftsküche Lagerbehälter beschrieben. Der Zusatz eines Massenstrom-Steuereinheit ermöglicht Änderungen an dem Gasgemisch in den benutzerdefinierten Inkubatoren hergestellt werden, und ein zirkulierendes Wasserbad ermöglicht sowohl Temperatursteuerung und macht es leicht, Lecks zu identifizieren. Dieses Verfahren stellt eine kostengünstige Alternative handelsverfügbaren Einheiten.

Introduction

C. elegans ist ein Fadenwurm, die weithin als eines vielzelligen eukaryontischen Modellorganismus seit der Einführung von Brenner ¹ angenommen. Es ist eine billige, einfache und vielseitiges Modell, das einfach Verbindungen zwischen genetischen Veränderungen und phänotypische ändert ² ermöglicht.

Ischämie wird durch einen Mangel an Nährstoffen und Sauerstoffversorgung eines Gewebes, gefolgt von Reperfusion, wenn ein Burst von reaktiven Sauerstoffspezies erzeugt wird, ³ und das meiste Schaden entsteht dadurch. Im Jahr 2002, ein Modell der Ischämie / Reperfusion (IR) in C. elegans entwickelt ⁴ mit der Abgabe der ganze Wurm zu Sauerstoffmangel, Nährstoffmangel und Hitzestress für ca. 20 Stunden, gefolgt von 24 Stunden unter normalen Bedingungen. Obwohl dieses Modell ist technisch eine Sauerstoffmangel-Hunger (AS) Zustand tritt Zelltod durch Mechanismen, die bei Säugetieren konserviert sind, einschließlich der Schäden durch Oxidationsmittel während der Reperfusion induzierte <sup> 5. Außerdem ähnlich Säugetier IR, Schäden, die durch AS in C induziert elegans kann durch ischämische Präkonditionierung ^6,7 oder ^8,9 Betäubung Vorbehandlung verhindert werden.

Die folgenden Protokolle zeigen, wie man in C IR imitieren elegans mit dem AS-Modell, wie man morphologische und Verhaltensauffälligkeiten, die von AS führen punkten, und wie das Protokoll in einer Weise, die das Experiment mit einer niedrigeren Anfangsinvestitionen mit einem maßgeschneiderten, leicht konstruiert Kammer Alternative durchgeführt werden können anpassen .

Protocol

1. C elegans Wachstum

1. Bereiten 35 mm Nematode Growth Medien (NGM)-Agar-Platten mit OP50 Bakterien geimpft, nach Norm Anbaumethoden ^ein.
2. Synchronisieren von C. elegans, indem 6 schwangeren Erwachsenen auf eine Platte ausgesät NGM. Entfernen Sie die Erwachsenen nach ~ 100 Eier gelegt (~ 3 h).
3. Die Inkubation für 3 Tage bei 20 ° C, an welchem ​​Punkt die Würmer zu jungen erwachsenen Stadium entwickelt und sind optimal für dieses Experiment. Alternative Protokolle C. synchronisieren elegans sind an anderer Stelle ¹⁰ beschrieben.

2. Materialien für AS

1. M9-Puffer (22 mM KH ₂ PO _4, 42 mM Na ₂ HPO _4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO ₄₎ sollte von Sauerstoff durch Äquilibrieren mit N ₂ gespült werden vor dem Experiment (Argon können ebenfalls verwendet werden) während 30 min gehalten und umgeben von Eis.
2. Machen Sie ein kleines Loch (3 mmbreit) in dem Deckel von 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, in dem die Würmer während AS gelegt werden. Das Loch für den Gasaustausch ermöglicht, ohne den Deckel offen halten, da dies zu übermäßiger Verdunstung Medien führen.

3. Anoxia / Starvation

1. Führen Sie alle Experimente mindestens in dreifacher Ausfertigung.
2. 1 ml der RT, sauerstoff M9-Puffer zu jedem 35 mm-Platte mit jungen erwachsenen Würmer gewachsen wie oben beschrieben. Seien Sie vorsichtig, um zu vermeiden, Entfernung von Bakterien von der Platte (Add M9 an den Rändern, wo Bakterien wurden nicht geimpft). Nach ca. 1 min sollte die Würmer schwimmen in der M9.
3. Mantel einer 1 ml Pipettenspitze mit BSA durch Pipettieren und Ausstoßen eines sterilen 1% BSA-Lösung.
4. Die Platte mit den Würmern in M9-Puffer vorsichtig neigen, entfernen Sie die M9 aus dem gleichen Ort, wo es aufgenommen wurde, und legen Sie die Suspension in die vorbereiteten Mikrozentrifugenröhrchen. Ruhen lassen, auf Eis bis die Würmer zu der Unterseite der Rohre fallen gelassen (~ 1-2 Min).
5. Entfernen Sie die maximale Höhe der M9 möglich, ohne die Würmer aus der Röhre zu stören (Abfahrt ca. 100 ul), 1 ml des Sauerstoff gespült und vereist M9 und das Reagenzglas auf Eis, bis die Würmer wieder setzen sich am Boden. Wiederholen Sie den letzten Schritt 3x. In der letzten Waschung, entfernen Sie die M9 bis ~ 100 ul in der Röhre bleibt.
6. Die Röhrchen mit den Würmern in sauerstoffarmes M9 innerhalb einer anoxischen / hypoxischen Kammer (siehe Anleitung unten, Abschnitt 3.6.1) oder alternativ in einem benutzerdefinierten verschlossenen Behälter (siehe unten Anleitungen, Abschnitt 3.6.2).
   1. Wenn ein Handels anoxischen / hypoxischen Kammer verwendet werden soll, verlassen einige gespült M9 in der Kammer, bevor Schritt 3.5 und 3.5 wiederholen Schritt, wenn die Würmer sind in der Kammer.
   2. Wenn eine benutzerdefinierte Kammer verwendet werden soll, ist eine detaillierte Beschreibung, wie man eine Low-Cost-Gerät zu erstellen am Ende dieses Protokolls vorgestellt und wurde von einer anderen Gruppe zuvor ¹¹ beschrieben. Kurz: Machen Sie zwei Löcher in einem 250 ml Tupperware-Typ Behälterdeckel und fügen Rohrverbinder zu ihnen. Einer wird verwendet, um das Gasgemisch zu injizieren, während die andere wird der Gasaustritt in ein Wasserbad sein.
   3. Zeigen die Würmer in die Kammer und Abdichten der Kammer mit dem Deckel.
   4. Gas mit konstantem N ₂ Fluss (100 ml / min).
   5. Stellen Sie den Behälter in einem Wasserbad bei 26 ° C Sicherzustellen, dass das Ausgangsrohr ist in Wasser eingetaucht, so dass keine Luft zurückkehrt und dass keine Lecks in dem System (scheinbare durch Blasen aus der Kammer selbst).

Die Würmer Inkubieren bei 26 ° C für 20 Stunden.

4. Simulierte Reperfusion

1. Nach 20 Stunden unter AS Bedingungen in der Raumluft entfernen Sie die Rohre aus dem Brutraum.
2. Pipette C. elegans mit einer BSA-beschichtete Spitze (wie in Schritt 3.3) auf ein OP50 ausgesät 35 mm NGM Platte. Die Inkubation bei 20 ° C für 24 Stunden.Danach werden die Würmer bereit, erzielt werden kann.

5. Identifizieren Toten Versus Live-Worms

1. Mit einem Platin-Pick, leicht berühren, die oben auf dem Kopf des Wurms. Live-Würmer werden nach berührt rückwärts bewegen. Wenn die Würmer nicht reagierender, zu zählen, wie tot ist. Gelegentlich wird ein Wurm nicht rückwärts bewegen, aber eine leichte Seite-an-Seite Kopfbewegung zu zeigen. Obwohl technisch nicht tot ist, sind diese Würmer fast sicher, innerhalb von Stunden ablaufen und sollte als tot gewertet. Wenn man zu lange, um die Würmer Tor wartet, können interne Schlüpfen der Nachkommen auftreten und diese "Taschen-of-Würmer" reißen können, was Erfassung der Tierkörper sehr schwierig.
2. Entfernen Sie die beiden lebenden und toten Würmer von der Platte, wie sie gezählt werden, um doppelte Zählungen zu vermeiden. Die Live-Würmer können auf einer separaten Platte bewegt, um Verhaltenstests durchzuführen. Die Menge an lebenden Würmer bezogen auf das Gesamt als% der überlebenden Schnecken dargestellt (Figur 1A

6. Touch Response Assay

1. Eine ausführliche Beschreibung dieses Protokolls ist in Hart, Anne C., Hrsg. vorgestellt. Verhalten (3. Juli 2006), WormBook, hrsg. Die C. elegans Forschungsgemeinschaft, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org.
   1. Um Touch-Reaktion zählen, identifizieren Würmer, die sich bewegen und berühren Sie leicht die Seite der Kopf des Wurms (in der Nähe des mittleren Teil des Rachens) mit einem Wimpern Pick (Abbildung 3).
   2. Wenn der Wurm sich rückwärts bewegt, Partitur so reagieren, wenn nicht, schieße so nonresponsive (Abbildung 1B). Wiederholen Sie diesen Schritt 10-15x für jeden Wurm mit 10 Sekunden-Intervallen. Sonde mindestens 10 Würmer in jeder Gruppe, um genaue Daten haben. Der gleiche Test kann verwendet folgende leichte Berührung mit der hinteren Körperwand nach vorne zu beurteilen Bewegungs Veränderungen werden. Achten Sie darauf, den Kopf oder Schwanz der Wurm nicht zu berühren, da dies einen deutlichen Verhalten stimuliert.
   3. Schließlich wird inUnternehmens genetische Kontrollstämme [N2 Bristol-Wildtyp-positiv, mec (mechanosensorischen) für negative Mutante - zB CB1338 mec-3 (e1338) IV], um die Kraft, mit der die Würmer berühren kalibrieren. Zu hart eines Stimulations eine Verhaltensreaktion in mec Mutanten zu entlocken, zu wenig wird eine Wirkung in Wildtyp N2 Kontrollen nicht zu entlocken.

7. Neuronale Änderungen

1. Um nach AS neuronalen Veränderungen sichtbar zu machen, verwenden Sie einen Stamm, der GFP in den Touch-Neuronen reagieren mec ^4,5 ausdrückt. Diese Neuronen haben lange Prozesse, die an der Körperwand laufen und sind leicht für morphologische Auffälligkeiten erzielt. Darüber hinaus kann die morphologische Information mit Verhaltensmaßnahmen der neuronalen Funktion integriert werden, wie oben beschrieben. Ein Stamm, der für diesen Zweck verwendet werden kann, ist TU2583, die erhältlich ist von der C elegans Genetics Center und enthält die uIs25 integrierte Transgen exprimieren GFP herm die mec-18-Promotor, oder alternativ TU2562, die eine integrierte mec-3 :: GFP-Fusions enthält.
2. Bereiten Sie eine Agarose-Pad.
   1. Melt 2% Agarose in Wasser, bringen M9 mit einem 10fach-1x und Wartung der Lösung bei 70 ° C
   2. Einen Tropfen (~ 20 &mgr; l) dieser Lösung auf einen Objektträger (25 mm x 75 mm), die zwischen zwei anderen Folien, von denen jede ein einziges Stück Klebeband auf ihrer Unterseite platziert ist.
   3. Legen Sie eine abschließende Glasobjektträger senkrecht zu der ersten auf dem 2% igen Lösung, und lassen Sie es bei Raumtemperatur abkühlen. Dies sollte eine Unterlage, die die Dicke des Bandes zu bilden.
   4. Entfernen Sie die obere Folie und fügen Sie 10 ul der M9 mit 0,1% Tetramisol, die die Würmer zu immobilisieren wird.
3. Bewegen Sie einige (~ 10) leben Würmer auf den 2% igen Rutsche. Legen Sie ein Deckglas über sie und visualisieren GFP mit einem Fluoreszenzmikroskop unter einem 100X Ziel mit der entsprechenden Beleuchtung.
4. BeschädigtNeuronen eine cytosolische Membranperlenmuster in den Prozessen von mehreren punctum (2A) besteht, und / oder Anomalien, wo die Prozesse scheinen gebrochen zu werden (2B) zu zeigen. Zählen Punctum und Anomalien in beiden Neuronen für jede Schnecke, unter Verwendung von insgesamt mindestens 10 Würmer.

8. Lab hergestellt Hypoxic Kammer

1. Eine Tupperware-Stil, siegelfähige, luftdichten Behälter kann als anoxischen Kammer nachgerüstet werden. Achten Sie darauf, einen Behälter, der so klein wie möglich ist, zu wählen. Ein kleiner Behälter erzeugt eine hypoxische Umgebung schneller und einfacher ist, im Wasserbad (Abbildung 4) passen.
2. Machen Sie zwei Löcher auf dem Deckel (kann mit einem Schraubendreher oder durch Erhitzen Pinzette und zwingt in den Deckel gemacht werden) und legen Sie eine Kunststoff-oder Metallstecker, die den Schlauch (5A) passt. Benutzen Sie Klebstoff, die unter Wasser gesetzt werden kann, und wird hart nach dem Trocknen zu vermeiden Bewegung auchder Stecker und damit die Möglichkeit einer Leckage (Fig. 5B) verringert wird.
3. Der Behälter sollte in das Wasserbad gestellt werden, so dass sie vollständig (Fig. 4) eingetaucht. Um den Behälter eintauchen, mit einem Flaschengewicht oder ein Tauchgewicht.
4. Einer der Rohrverbindungen werden verwendet, um eine Gasmischung einzuführen und die andere Röhre wird als Überdruck wirken, daher sollte es unter Wasser gelassen, so dass der Behälter von der äußeren Umgebung (4) abgedichtet werden.
5. Die Luftzusammensetzung kann durch maßgeschneiderte Gas, Massendurchflussregler oder ein Gerät, das die gewünschten Gase mischt moduliert werden. Der Gasfluss sollte kontrolliert werden, da hohe Strömungs können übermäßige Verdunstung erstellen. Beispielsweise in einem 250 ml-Behälter mit 100 ml / min Gas gute Raum für die Würmer und einen geeigneten Fluß bereitzustellen.
6. Die Länge der Rohrleitung auf einem Minimum gehalten werden, da sie durchlässig für Gas, eine sein kann,llowing der Eingang von O _2. Es ist wichtig, zu vermeiden, mit Silikon, Tygon-Röhren als diese Materialien sind durchlässig für den Gasaustausch. Wir bevorzugen Polypropylen oder Nylon Rohre. Glas-oder Metallrohre halten die Gase gut, sind aber auch schwieriger zu verarbeiten.

Representative Results

Unterziehen C. elegans zu 20 Stunden von AS bei 26 ° C in einem benutzerdefinierten Labor hergestellten Brutraum, wie beschrieben (Abschnitt 3.6.2) führte zu einer signifikanten Mortalität (Abbildung 1A) ^5. Anschließende Fluoreszenzabbildung von Punctum und Brüche in den GFP-markierten neuronalen Prozesse von Überlebenden bestätigte die Anwesenheit von morphologischen Veränderungen (Abbildung 2). Die Überlebenden reagiert auch schlecht auf die Lichtkörperwand touch (Abbildung 1B). Dieses Modell wurde von mehreren Gruppen verwendet worden, um zu untersuchen, wie genetische Veranlagung, pharmazeutische Interventionen und metabolische Plastizität betrifft AS abhängig Ergebnisse ^{4-6,8,9,12,13.}

1. C elegans Überleben und die Touch-Reaktion nachAS. A) Prozentualer Anteil der Würmer, die 24 Stunden nach der AS Überleben zeigen. Die N2-Stamm der Wildtyp genetischen Hintergrund und KWN85 enthält eine integrierte Transgen, das mec Neuronen mit GFP. B-Etiketten) Reaktion auf Reize des Lebens berühren C. elegans (N2-Stamm) nach AS. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

2. Berühren Neuron Änderungen, die nach AS. Touch-Neuron (PLML und PLMR) Anomalien wie verschlungenen Prozesse und Pausen (A) oder die Ansammlung von GFP-Aggregate in den Prozessen (B) wurden in überlebenden überwacht betäubt C. eleg ans nach AS.

3. Wimper-Pick. Eine montierte Wimpern Pick. Der Einschub, ein Detail der Wimper geklebt, um die Zahnstocher Holz.

4. Lab hergestellt hypoxischen Kammer im Inneren des Wasserbades. Ein geschlossener Behälter bereit, das Experiment zu starten. Die Pfeile zeigen die Gas-und Ausfahrt und die Flasche Gewicht verwendet, um es von schwimm halten.

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5. Details der inneren und äußeren Seite des Behälterdeckels. A) Außenseite der Behälterdeckel, die die Röhre und dem Anschluss an die bisherigen Loch. B) Außenseite des Behälterdeckels, auf der der Rohrstutzen auf die bisherigen Loch befestigt.

Discussion

AS wurde häufig in C verwendet elegans IR Verletzungen zu modellieren. Einige wichtige Punkte sollten für dieses Protokoll hervorgehoben werden: C. elegans sind beständig gegen eine Vielzahl von Verletzungen, die die Notwendigkeit für 3 gleichzeitige Beleidigungen (Hitze, Hunger und Sauerstoffmangel) zu Tode mit diesem System zu erreichen. Anoxia allein nicht den Würmern in diesem Zeitfenster ¹⁴ zu töten. Darüber hinaus ist ein zusätzlicher Temperaturanstieg Stress, so ist es wichtig, genau zu überwachen. Streng genommen ist Hunger nicht signifikant den Grad der Mortalität beobachtet ^7, per se, aber es scheint, um die Variabilität unter den Experimentwiederholungen zu verringern. Da es können erhebliche Variabilität von Tag zu Tag, ist es äußerst wichtig, die Vergleichsproben laufen direkt parallel und Experimente über mehrere Tage wiederholt. Im Allgemeinen sind die Ergebnisse für drei getrennte Platten von 50-100 Würmer / experimentellen Bedingungen gemessen und das sind dien gemittelt und als eine einzige Versuchs Replikat betrachtet. Im Allgemeinen scheinen zwischen sieben und neun Wiederholungen aus, um zu erreichen oder auszuschließen statistische Signifikanz zu sein.

Das Entwicklungsstadium der in dem Experiment verwendet Würmer muss auch sorgfältig wie die Anfälligkeit der verschiedenen Stufen zu überwachenden Schäden erheblich variiert ^15,16. Der Einsatz von jungen Erwachsenen ist Standard, und Larvenstadium (L3 und L4) Würmer zu sein scheinen resistent gegen die schädlichen Auswirkungen von AS (unveröffentlichte Daten).

Dieses Protokoll stellt zwei Möglichkeiten, um die Experimente durchzuführen, eine mit einer im Labor hergestellten Geräten (mit Tupperware-Behälter Typ-und Gaseingang ¹¹⁾ und andere mit einer handelsüblichen ^4,6 hypoxischen Kammer. Anoxie durch andere Mittel, die den Sauerstoffverbrauch erzielt werden, wie an anderer Stelle beschrieben ^13,17. Der Einsatz von alternativen Techniken, um eine hypoxische Umgebung erstellen kann den AS Inkubationszeit Bedarf ändernum die gewünschte Menge des Todes zu erstellen. Targeting ~ 20% Überlebensrate ist ein idealer Ausgangspunkt für die Untersuchung Schutzmaßnahmen, während 80% ist ebenso ideal für Interventionen, die die nachteiligen Wirkungen von AS verschärfen. Eine weitere wichtige Einschränkung ist, der Zeitpunkt, zu dem die Beobachter Partituren tot / lebendig Würmer. Wenn die Zeit für die Analyse wird über 24 h verlängert, können die Daten irreführend sein, da tote Würmer zunehmend schwieriger zu identifizieren. Dies kann aufgrund Wurm Kadaver immer über die Zeit relativ transparent, dass befruchtete Embryonen können innerhalb der Schlachtkörper in Post-mortem-Nachkommen zu entwickeln und zu stören, wie sie entstehen, aber auch.

Die Analyse der neuronalen Morphologie kann modifiziert werden, um Proteinexpressionsmuster ^18, Kernfragmentierung ⁴ und andere Parameter ¹⁹ durch ein Wurmstamm, der die entsprechende genetisch codierten Markierung exprimiert Substitution aussehen. Eine letzte Einschränkung ist, dass die Visualisierung derneuronale Prozesse sollte weniger als 30 min nach Einsetzen der Würmer auf der Folie durchgeführt werden. Tiere unter Narkose gehalten auf Objektträger für längere Zeit kann AS-unabhängigen Schäden aufweisen. Passen Sie die Menge der Tiere pro Folie nach der benötigten Zeit zu verfolgen und zu analysieren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
N2  strain	CGC		Wild type strain. http://www.cbs.umn.edu/CGC/
TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP)	CGC	TU2583	integrated fluorescent transgene used to label touch neurons. http://www.cbs.umn.edu/CGC/
CB1338 mec-3 (e1338)IV	CGC	CB1338	canonical mec-3 mutant that is touch insensitive. http://www.cbs.umn.edu/CGC/
Microcentrifuge Tube	Eppendorf	0030 120.086
Nikon Eclipse TE2000-U Microscope	Nikon USA	TE2000-U
Low Temperature Incubator	Sheldon Manufacturing Inc.	Model 2005
Eyelash Pick			An eyelash pick can be prepared by attaching  an eyelash onto a wooden toothpick, then attaching the toothpick in a glass Pasteur pipette (Figure 3).
Hypoxic Chamber	Coy	8307030	Hypoxic Glove box equipped with paladium catalyst and CO2 controller.