Summary
Dette arbejde beskriver en hidtil ukendt fremgangsmåde til selektivt at målrette subcellulære organeller i planter, analyseret under anvendelse af BioRad Gene Gun.
Abstract
For at målrette en enkelt protein til flere subcellulære organeller, planter typisk duplikere de relevante gener, og udtrykke hvert gen separat med komplekse regulerende strategier, herunder differential initiativtagere og / eller signalsekvenser. Metaboliske ingeniører og syntetiske biologer interesserede i at målrette enzymerne til et bestemt organel står over for en udfordring: For et protein, der er til at være lokaliseret til mere end ét organel skal teknikeren klone det samme gen flere gange. Dette arbejde viser en løsning på denne strategi: udnytte alternativ splejsning af mRNA. Denne teknologi udnytter etablerede kloroplast og peroxisome targetingsekvenser og kombinerer dem til et enkelt mRNA, der er alternativt splejsede. Nogle splejsningsvarianter sendes til chloroplasten, nogle til peroxisom, og nogle til cytosolen. Her er designet til flere organel målrettet med alternativ splejsning. I dette arbejde blev GFP forventes at være udtrykdede i chloroplasten, cytosol og peroxisom af en række rationelt konstrueret 5 'mRNA tags. Disse tags har potentiale til at reducere mængden af kloning kræves, når heterologe gener skal udtrykkes i flere subcellulære organeller. Konstruktionerne blev udformet i tidligere arbejde 11, og blev klonet under anvendelse Gibson samling, en ligering uafhængig kloning metode, som ikke kræver restriktionsenzymer. De resulterende plasmider blev indført i Nicotiana benthamiana epidermal bladceller med en modificeret Gene Gun protokol. Endelig blev transformerede blade observeret med konfokal mikroskopi.
Introduction
Dette arbejde er en metabolisk engineering / syntetisk biologi projekt, hvori planteceller er manipuleret til at udtrykke en reporter protein i flere organeller men med kun en enkelt DNA-konstruktion.
En fremgangsmåde til at målrette proteiner mere end ét sted involverer kloning flere genetiske kopier, der hver indeholder en anden lokalisering peptid. Hver kopi skal indføres ved successiv retransformation, eller alternativt ved tilbagekrydsning enkelt transformationer 1. Dette indebærer yderligere kloning, og er begrænset af en lokalisering tag per endestation.
En anden måde til at lokalisere et protein til flere steder er gennem alternativ splejsning 2-5. RNA transkriberet fra et enkelt gen, men forskellige eksemplarer af transkriptet behandles forskelligt, ofte i mere end én måde per celle. Dette kan resultere i mere end en messenger-RNA i cellen transkriberet fra et enkelt gen. Disse forskellige Messengeboxenr RNA'er kan kode for forskellige isoformer af det samme protein eller i tilfælde af en rammeskift et andet protein helt. Selv alternativ splejsning er blevet beskrevet i litteraturen i mange år, er virkningsmekanismer og bevares donor og receptor splejsningssitene kun bliver belyst for nylig 6. Da disse steder er ved at blive bedre beskrevet, de åbner muligheder for engineering.
Plant metaboliske ingeniører står over for en udfordring, når der udtrykker et protein i flere organeller. For et protein, der er til at være lokaliseret på mere end en organel, skal teknikeren klone det samme gen flere gange, hver med en separat signalsekvens dirigere den til organel af interesse. For et enkelt gen i tre organeller, det er simpelthen tre gener. Men for en seks-gen stofskiftevej, dette udvider til 18 gener, en betydelig kloning indsats. Kombination af flere lokaliserings-sekvenser i en enkelt, alternativt splejset gen tegnificantly reducerer denne indsats. For eksempel, re-engineering photorespiration 7,8 og isoprenoid syntese 9,10 involverer både grønkorn og peroxisomer. I vores tilfælde tog vi fordel af splejsningssteder som observeret i en naturlig Arabidopsis thaliana, der er beskrevet tidligere 6. Vi rationelt redesignet mRNA-sekvensen forlader naturlige splejsningssteder alene, men placeret sekvenser, der ville kode chloroplast-eller peroxisom målretning tags inden for alternativt splejset introner (figur 1). Det udtrykte protein kan eller kan ikke have et mærke, afhængig af, om præ-mRNA, som kodede den blev udskåret som et intron (figur 1g og 1h). For mere information om udformningen af konstruktionerne, der præsenteres i dette arbejde, kan du se følgesvend artikel 11.
Fordi dette er stadig en betydelig kloning indsats Gibson samling, en ny metode til at klone DNA-konstruktioner, er used i byggeriet. Gibson-metoden kan anvendes til enhver sekvens, uanset restriktionssites (figur 2) 12-14. Den specifikke blanding af enzymer giver mulighed for en et-trins, isotermisk forsamling. I denne fremgangsmåde er adskillige dobbeltstrengede lineære DNA-dele udformet således, at de har overlappende sekvenser af ~ 50 bp. Gibson samling enzym mix delvist fordøjer de lineære DNA-dele, udsætter enkeltstrenge af homologe sekvenser. Disse partielle enkeltstrengede sekvenser er re-udglødet i reaktionsblandingen, hvilket resulterer i en hurtig, et skridt, sekvens-uafhængig, ligering fri subkloning reaktion.
Dette arbejde beskriver 1) rationel design alternativt splejsede konstruktioner til ekspression i planter grønkorn, peroxisomer og cytosol, 2) deres kloning ved hjælp af den nye ligatur-fri metode til Gibson forsamling, 3) deres levering i tobaksbladstrenge celler med Gene Gun, og 4) resultater, der viser organel målretning, som observeret med GFPog konfokal mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Design af alternativt splejset sekvenser for Multiple Organelbiosyntese Targeting
- Bestem de steder til endelig protein udtryk. For dette arbejde, interessen i at målrette chloroplasten, peroxisom og cytosol.
- Brug litteraturen til at identificere protein-og DNA-sekvenser, der vides at målrette proteiner organeller af interesse. Målretning I dette tilfælde en chloroplast sekvens fra Arabidopsis thaliana L-isoaspartate methyltransferase 6,15, og en peroxisome targeting sekvens fra Arabidopsis thaliana transthyretin-lignende S-allantoin syntase 16,17 blev bestemt.
- Identificer et alternativ-splejse regime, der bør målrette proteiner af interesse til de korrekte organeller. For dette arbejde, splejsningssites som observeret i en naturlig Arabidopsis-system 6. MRNA-sekvensen blev redesignet forlader naturlige splejsningssteder, men sekvenser blev placeret kodende kloroplast-eller peroxisogle målretning tags inden for de alternativt-splejsede introns (Figur 1).
2.. Gibson forsamling af DNA Dele
Se også figur 2.
Gibson montage metode afhænger af virkningen af flere enzymer i en pre-made mix til 1) delvis fordøje enderne af dobbeltstrenget DNA, er at foretage en enkelt tråde og 2) anneal gratis basepar af nabolandet DNA dele. Dette giver mulighed for kloning af DNA-fragmenter uden begrænsninger af restriktionssteder.
- Vælg en ordre på elementerne i DNA-plasmid konstruktion. Som et eksempel TriTag-1 har elementer: a) en plasmidvektor (pore, indeholder en GFP-konstruktion kendt for at arbejde i planter, en kanamycinresistens markering, og replikationsstartsteder for E. coli og Agrobacterium tumefaciens værter), b) promotorsekvens (P ENTCUP2, vist sig at være konstitutiv i planter)C) et kloroplast-target-sekvens (CTS), c) en peroxisom targeting sekvens (PTS), og d) en række splejsningssites som beskrevet tidligere 6.
- Design konstruktionen basis-for-base med in silico design software. APE er et open source freeware pakke nyttigt for dette arbejde.
Bemærk: TriTag-1, har rækkefølgen: plasmidvektoren promotor ATG splejsedonorstedet kloroplast målsekvens splejsningsdonorsted, neutral site, splejsningsacceptorsted, peroxisom målsekvens splejsningsacceptorsted, GFP, som er indeholdt i plasmidvektor .- Design in silico DNA-konstruktionen sådan, at der er en 50-bp overlap mellem hvert stykke, når du bestiller primere til PCR. Det er muligt at anvende 50 bp overlap som primere: 25 bp hver retning.
- Vær sikker på at holde styr på oprindelsen af de enkelte sekvens stykker. Er det så: et plasmid, der skal dyrkes og miniprepped; en lineær sekvens, der kan anvendes som en PCR-skabelon; eller en sekvens, der skal væresyntetiseret kommercielt? Flere selskaber tilbyder billige DNA-syntese tjenester til fragmenter <500 bp. I dette tilfælde TriTag selv er 437 bp, så det var en fordel at bestille det kommercielt.
- De bedste resultater vil komme, hvis alle de fragmenter er PCR-amplificeret og oprenset fra deres template-DNA. Modstanden markør er et godt sted at opdele dette store DNA i to mindre skabeloner, der er lettere at PCR-amplificeret.
- Begrænsning Restriktionsenzym DpnI skærer methylerede DNA. Hvis PCR-skabelon var et miniprep fra E. coli, vil DpnI behandling fjerne kontaminerende skabelon-DNA.
- Design in silico DNA-konstruktionen sådan, at der er en 50-bp overlap mellem hvert stykke, når du bestiller primere til PCR. Det er muligt at anvende 50 bp overlap som primere: 25 bp hver retning.
- Rense alle de DNA-sekvenser, separat og elueres i vand, TE eller buffer EB.
- pore vektor del 1, ~ 3.000 bp (grønne pile). PCR-amplificeret og DpnI behandles.
- pore vektor del 2, ~ 3.000 bp (sorte pile). PCR-amplificeret og DpnI behandles.
- TriTag insert, 437 bp (blå pile). Bestilt kommercielt. Resuspend i Hedeselskabet 2 O.
- P ENTCUP promotor, ~ 750 bp (appelsin pile). PCR-amplificeret og DpnI behandles.
- Måling af koncentrationen af hver af DNA-stykker. Målet for 150 ng / mikroliter af vektor stykker.
- Tag en portion af Gibson samling mix ud af fryseren og tø på is. Denne er kommercielt tilgængelig, men også nemt at gøre i laboratoriet 12-14.
- Der er to trin i denne opskrift: en tyktflydende 5x mester mix og 15 ul reaktion størrelse 1.33x alikvoter. 5x masterblanding består af: 3 ml 1 M Tris-HCI pH 7,5, 300 pi 1 M MgCl2, 600 pi 10 mM af hver dNTP, 300 pi 1 M DTT, 1,5 g PEG-8000, 20 mg NAD og Hedeselskabet 2 O til 6 ml. Forbered 320 ul portioner (18) og fryse alle, men en ved -20 ° C. Løsningen vil være ganske tyktflydende. Mærk disse "5X isoterm buffer"
- Til den ene tilbageværende (320 ul), tilsættes 1,2 pi T5 Exonuclease, 20 pi Phusion High-FIDelity DNA-polymerase, 160 pi Taq DNA Ligase og 700 pi Hedeselskabet 2 O. Forbered 15 ul portioner (~ 80) på is i PCR-rør og opbevares ved -20 ° C.
- Bestem mængder til ækvimolære mængder af hver af de fragmenter. Der er et par online regnemaskiner, herunder Gibthon.org. Der bør være i alt 5 pi af alle DNA-stykkerne. Tilføj dem til 15 pi Gibson blandingsalikvot. Hvis dette kræver volumen for lille til pipette fortynde DNA-fragmenter og / eller bruge mere end én portion.
- Glem ikke at forberede en kontrol af vektor-DNA alene (fx DNA-del, der indeholder antibiotikaresistens markør) og fyldes op til mærket med vand.
- Inkuber rørene i et termisk cykliseringsapparat ved 50-55 ° C i 30-60 minutter. Sæt på is og omdanne til E. coli via varmechok-kemisk kompetente celler. Brug ikke elektrokompetente celler. Den høje saltkoncentration og relativt lav DNA-koncentrationkan bevirke, at cellerne bue.
- Anvend alle 20 ul til en kommerciel fremstilling af 200 pi calcium-chlorid kompetent E. coli.
Inkuber på is 30 minutter og varmechok 60 sek ved 42 ° C - Retur til is 2 min, anvendes 750 pi SOC eller LB-medium og gendanne omrystning i et mikrocentrifugerør i 30 minutter ved 37 ° C. Plate blandingen og passende fortyndinger på LB + Kan (eller anden passende antibiotikum). Dette kan resultere i højere baggrund (og et større antal ikke-målorganismer rekombinationsbegivenheder) end traditionel ligatur-baseret kloning, men det er umagen værd at screene omkring 10 kolonier.
- Anvend alle 20 ul til en kommerciel fremstilling af 200 pi calcium-chlorid kompetent E. coli.
- Bekræft klon via sekvens og gemme en portion ved -80 ° C
3.. Biolistic Transfektion af tobak med Gene Gun
Dette er en teknik, der er etableret i JOVE 18,19. Vigtige skridt og forskelle er beskrevet nedenfor.
- Grow 50-100 ml E. coli eller 200 ml Agrobacterium. Maxi-prep kulturen. En koncentration på omkring 1.500 ng / pi er påkrævet for at fortsætte.
- Forbered gen pistol kugler som tidligere beskrevet. Indlæse dem i Gene Gun.
- Til transfektion af Nicotiana benthamiana tobaksblade epidermal væv, vælger et stort blad tæt på bunden af en 3 måned gammel plante. Skære det forsigtigt og læg det med bunden opad på våd papirservietter i en 15 cm petriskål.
- Indstil Han pres for Gene Gun til 200-250 psi.
- Omhyggeligt sigte Gene Gun mellem ribber på undersiden af et blad, omkring 3-5 cm over det. Slip sikkerhed og levere partikler til bladet. Hver kugle kan bruges to gange på samme sted på bladet. Hvis bladet eksploderer, kassere og starte en ny blad-der er en vis variation i blad sejhed grund vækstbetingelser såsom alder, fugt, osv. For en 12-cm blad, forvente at passe omkring 6 skud.
- Opbevar blade, dækket med toppen af enPetriskål i 2-3 dage i svagt lys på bænken.
- Undersøg blad i en dissektionsmikroskop udstyret med UV-fluorescens og søge efter de enkelte celler, der udtrykker GFP. Dissekere 5-10 mm sektioner af bladet.
- Nedsænkes blade i en dyb brønd objektglas under ~ 200 pi 0,1% Triton X-100. Detergentet hjælper med at forhindre luftbobler i at danne på overfladen og dyb brønd objektglas giver mulighed for en større væv billeddannelse område.
4.. Konfokal mikroskopi af Transficerede Tissue
Disse instruktioner varierer for hver instrument, så det er vigtigt at få trænet ordentligt.
- For fluorescensdetektion eksperimenter indstille excitation laser til 489 nm, og indstille fotomultiplikatoren detektorer til 500-569 nm for GFP-fluorescens og 630-700 nm for klorofyl auto-fluorescens. Billede celler ved hjælp af en 40x vand-immersionsobjektiv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Designet indsats var et resultat af en betydelig planlægning. Novel til dette projekt er brugen af alternativ splejsning at skabe en præ-mRNA, der er oversat til differentielt udtrykte proteiner. Disse proteiner udtrykkes i forskellige organeller, i dette tilfælde chloroplasten, peroxisom og / eller cytosol. Vi tilpasset naturlige Arabidopsis gen, der alternativt splejsede 6 og placerede kendt kloroplast 6 og peroxisom 17 targetingsekvenser i alternative exoner (TriTag-1 og TriTag-2). TriTag-3 består af en peroxisom signal indlejret i en lav kompleksitet region kloroplast sekvens. Disse blev placeret i ramme med GFP (figur 1).
Plasmiderne, der anvendes i denne undersøgelse indeholdt således flere elementer: den native alternativ splejsning regime fra PIMT2 gen 6 chloroplast og peroxisome targeting sekvenser, GFP og et plasmid rygrad. Da hver har meget specIFIC krævede sekvens, er det nødvendigt med en sekvens-uafhængig metode. Gibson samling protokol 12,13 kan bruges på alle sekvenser, så længe de enkelte dele er designet med sekvens lighed med hinanden, og ikke indeholder gentagne sekvenser. I korte træk er lineære DNA-fragmenter konstrueret (enten via PCR-amplifikation kommerciel syntese eller fordøjelse af en pre-made plasmid), således at de har ~ 50 bp af overlappende homologe sekvens (figur 2). Ækvimolære mængder af hver af DNA-fragmenterne er kombineret i et enkelt rør indeholdende Gibson samling mix, inkuberet ved 50 ° C i en time, og transformeret ind i E. coli. Plasmiderne følge af Gibson samling protokollen blev bekræftet ved Sanger-sekventering.
I denne undersøgelse de tre forskellige GFP organel-targeting konstrukter blev sammenlignet med umærkede GFP og Rubisco-tagget GFP. Konfokal mikroskopi blev anvendt til at detektere GFP-fluorescens i single celler transient transformeret. I kontrol-forsøg blev transient ekspression observeret korreleret til kloroplaster (let identificerbare ved den røde autofluorescens af klorofyl), kernerne (store organel, som ikke er en chloroplast og har kun én per celle), og / eller små organeller menes at være peroxisomer. Grøn (GFP) og røde (klorofyl autofluorescens) kanaler blev overlejret for at studere intracellulær lokalisering (figur 3). For en mere komplet diskussion af disse resultater, se venligst vores ledsager artiklen 11.
Som forudsagt i alle tre dobbelte målretning konstruktioner blev GFP observeret i kloroplaster (figur 4) i overlay konfokal mikrografier. TriTag-1 og TriTag-2 mål også GFP til cytosolen og den lille organel menes at være peroxisom (figur 4a og 4b, henholdsvis). TriTag-3 mål for GFP til kun chloroplasten og peroxisom, men ikkecytosolen (figur 4c). En sammenfatning af resultaterne er afbildet (figur 5).
Fig. 1. Design af alternativ splejsning konstruktioner til forskellen organel ekspression i Nicotiana benthamiana. Splice diagrammer (a) TriTag-1, (b) TriTag-2, og (c) TriTag-3, der viser ikke-målsøgende sekvenser (grå), chloroplast targetingsekvenser (lysegrøn), peroxisome targeting sekvenser (orange), og GFP-kodende sekvens anvendes transiente ekspressionssystemer forsøg. TriTag-1 og TriTag-2 består af alternativ splejsning konstruktioner; TriTag-3 består af en peroxisom signal indlejret i en lav kompleksitet region kloroplast sekvens. Sekvenser af
Figur 2 Diagram for Gibson samling:.. En ny metode til samling af overlappende DNA-fragmenter The Gibson montage metode til plasmid konstruktion 12,13 hurtigt erstatte traditionelle begrænsning-ligatur kloning i mange laboratorier. Grundlæggende kan man designe en konstruktion in silico, der indeholder DNA'et af interesse nøjagtigt sammensat af PCR-produkter amplificeret fra forskellige kilder. Design primere, der er komplementære til hinanden, og PCR-amplifikation af hvert fragment med de farvede primere. Tilføj alle stykkerne i en enkelt rør med enzymblandingen og transformere E. coli kompetente celler. Klik her for at se larger billede.
Figur 3. Kontrol behandlinger bombarderet i N. benthamiana blad epidermale celler. (AC) Untagged GFP. (a) Grøn kanal. Untagged GFP udtrykkes i kernen og omkring cellen periferien, svarende til cytosolen, men ikke vacuolen. (B) Røde chloroplaster angiver autofluorescens af klorofyl. (C) Overlay. I denne konstruktion fluorescens er observeret i kernen, og kun cytosol, men ikke de grønkorn. (Df) Chloroplast-tagget GFP kontrol. (D) Grøn kanal. GFP udtrykkes i de store organeller, med en celle som skitseret. (E) Røde kloroplaster indikerer autofluorescens af klorophyll. (f) Overlay. I dette tilfælde observeres gule grønkorn, hvilket indikerer, at GFP (grøn) er målrettet til chloroplasten. Genoptrykt med tilladelse 11. Klik her for at se større billede.
Fig. 4. Tri-Tag-1, 2, 3 tagget GFP fusioneret billeder. (A) Tri-TAG1. I dette tilfælde observeres gul chloroplastproteiner periferier, der angiver, at GFP er målrettet til chloroplasten. GFP er også observeret i cytosolen samt små punktformig organeller, der kan være peroxisomer. (B) Tri-tag2. I dette tilfælde observeres gul chloroplastproteiner periferier, der angiver, at GFP er målrettet til c hloroplast. GFP er også observeret i cytosolen samt små punktformig organeller, der kan være peroxisomer. (C) Tri-tag3. I dette tilfælde observeres gule chloroplaster, såvel som små punktformig organeller, der kan være peroxisomer. Men GFP ikke overholdes i cytosolen. Genoptrykt med tilladelse 11. Klik her for at se større billede.
Figur 5.. Rum i en typisk tobaksblade epidermal celle. Her deres relative størrelser og placeringer i cellen skal vises, og de relative ekspressionsniveauer observeret via konfokal mikroskopi. Genoptrykt med tilladelse 11./ 51234/51234fig5highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse er simple strategier er beskrevet for at lokalisere et enkelt transgene proteiner til flere cellulære rum i planter. Målet var at designe konstruktion, som ville udtrykke et enkelt gen i mere end ét organel i Nicotiana benthamiana. Strategier omfatter rationelt design af GFP-baserede DNA-konstruktioner, Gibson samling, levering af plasmider bladceller med Gene Gun, og observation af resultaterne med konfokal mikroskopi.
Tre forskellige kort, N-terminale tags var designet til samtidig kloroplast, peroxisome og cytosol målretning 11. Disse "TriTags" er designet ved at kombinere naturligt forekommende DNA, der koder for alternativt splejsede mRNA'er, som styrer de kodede proteiner til enten chloroplasten plus cytoplasmaet 6 eller peroxisomet plus cytoplasmaet 17. TriTag-3 er ikke afhængig af alternativ splejsning og består af en målrettet kloroplast sekvens, hvor en narelt ustruktureret del er blevet erstattet med en peroxisomal targeting sekvens 15,17. Den TriTags funktion in vivo til at målrette GFP i Nicotiana benthamiana leaf epidermale celler (figur 5).
Konfokal mikrografer viste, at TriTag-1 og TriTag-2-målet GFP til chloroplasten, peroxisom og cytosol effektivt, men med præference for chloroplasten og peroxisome henholdsvis (figur 4a og 4b). TriTag-3 mål GFP kun chloroplasten og peroxisom, men ikke i cytosolen (figur 4c). I alt kan disse tags reducere tid og ressourcer brugt på kloning af plantebeskyttelsesmidler metabolic engineering, specielt til dem, der kræver særligt udtryk i grønkorn og peroxisomer.
Ændringer og fejlfinding
De TriTags som i øjeblikket bygget er ret statiske. Imidlertid underlying teknologi, alternativ splejsning at tillade oversættelse af forskellige stedspecifikke tags, er fleksibel. De eksisterende kloroplast-og / eller peroxisom specifikke koder kan ændres til noget andet organel, det være sig sekretionsvejen, mitokondrier, en ER opholdssted tag, vacuolen. Disse kan også kombineres med vævsspecifikke promotorer, fx til frø, blomster, rødder, blade, stilke, osv.
For et projekt som dette, Gibson samlemetode 12-14 til kloning konstruktioner er ideel. Det er en enkel, effektiv værktøj til at subklone helst sekvens uden begrænsninger af restriktionssteder. I et-trins reaktioner Gibson samling hurtigt skabte konstruktioner og kontroller med en minimal indsats i kloning. Gibson samling teknik er næsten uendeligt modificerbare for vilkårlig rækkefølge, så længe den skabelon-sekvenser kan PCR-amplificeret. Selv om der i dette eksempel Gibson konstruktion blev vist med en spaltet plasmidPCR-amplifikation af vektoren har tendens til at fungere bedre end ved hjælp af en spaltet miniprep.
Gene Gun er en hurtig, effektiv metode til transient transfektion af celler, som er blevet etableret ved dette tidsskrift 18,19. Nicotiana benthamiana har store, lappede blade epidermale celler, som er både ideel til transfektion med Gene Gun, men også for observere med konfokal mikroskopi. Protokollen til fremstilling af kugler er veletableret. Guld har været brugt som en mikrobærer i de fleste eksperimenter i litteraturen hidtil, men wolfram mikrobærerne er senest tilgængelige til en lav pris.
Begrænsninger af de teknikker
En væsentlig begrænsning af Gibson fremgangsmåden er tilstedeværelsen af gentagne sekvenser: jo længere det overlappende område er færre sideprodukter resultatet. Spaltning af PCR-produkterne med DpnI bør fjerne kontaminerende plasmid-skabeloner; som normalt er kilden til sideprodukter. De enzymer fordøje DNA-fragmenter fra dobbeltstrenget DNA i enkeltstrenget. Tilstedeværelsen af gentagne sekvenser nær enderne (~ 1 kb) af DNA-fragmenter, øger muligheden for ukorrekt rekombination. Samt, gentager inden sekvenserne også udgøre en begrænsning: Det er ikke kendt, og vanskelig at kontrollere, hvor langt T5 exonuklease tygger sikkerhedskopiere enkeltstrenget DNA. Den hurtige aktivitet exonuclease tempereres ved høj reaktionstemperatur (50-55 ° C) til sidst at denaturere enzymet, og viskositetsnedsættende den samlede bevægelse i opløsningen. For mere finjustering af reaktionen trin, sekvens og ligatur uafhængig kloning (SLIC) 20 foretrækkes.
En væsentlig begrænsning af genkanonen teknik er, at den kun producerer af størrelsesordenen 1-10 transient transformerede celler pr skydning begivenhed.
Betydning forhold til det eksisterende metoder
Gibson montage teknik nyder hurtig vedtagelse for sin lethed, fleksibilitet og tilpasningsevne. Det er en hurtigere protokol end traditionelle begrænsning / ligering kloning, og ikke kræver specifikke sekvenser, såsom dem, der kræves til restriktionsfordøjelse. Det er ikke begrænset til to eller tre fragmenter, der skal rekombinerede; de oprindelige forskere har vist, at det med succes i op til 10 dele, omend med begrænset effektivitet. For mange forskere Gibson samling gør for et større antal positive kloner.
For flere transformanter med biolistiske teknikker, eller til oprettelse af transformerede callusvæv, bør anvendes brugen af et skab stil biolistisk anordning (f.eks BioRad PDS-1000). En alternativ fremgangsmåde er Agrobacterium infiltration.
Fremtidige applikationer
Gibson samling tillader større og større klynger af DNA, der skal samles, for atdet punkt, hvor en maksimal grænse ikke er blevet overholdt. De oprindelige forfattere har brugt den til at samle flere hundrede kilobaser DNA 13.
Evnen til selektivt at målrette flere organeller med en enkelt genetisk konstruktion har potentialet til at reducere antallet af gener, der kræver at blive transformeret. Leveringen af større og større DNA-fragmenter (og dermed større metaboliske veje) er en kortsigtet mål. Isoprenoid veje er blevet leveret til chloroplasten ved biolistiske metoder; andre genklynger såsom alternative kulstofbinding veje er i horisonten.
Kritiske trin i protokollen.
I Gibson samling, skal du sørge for skabelonens sekvenser ikke har homologi til hinanden undtagen ved målet rekombinationssitene.
I biolistisk transformation af Nicotiana planter, være omhyggelig med at holde genkanonen omkring 10-15 cm over bladene ennd holde heliumtryk på 200-250 psi. Tættere end dette, vil den skrøbelige blade eksplodere, og længere end at de ikke vil være godt forvandlet. To dage efter transfektion et blåt mærke skal vises på bladet, hvis det er korrekt forvandlet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Jen Sheen af Massachusetts General Hospital for den generøse donation af Nicotiana benthamiana frøplanter. Jen Bush hjulpet os meget i rådgivning i dyrkning af planter og oprettelse af en vækst kammer område. Tom Ferrante af Wyss Instituttet tilbød afgørende hjælp med konfokal mikroskopi. Forfatterne vil især gerne takke Don Ingber af Børnehospital Boston og Wyss Institut for den generøse donation af en Gene Gun og tilhørende forsyninger. Midler til projektet blev givet gennem en samarbejdsaftale med det amerikanske energiministerium Advanced Research Projects Agency (ARPA-E Award # DE-000.079) til PAS, JCW og MdM og gennem Chimerion Biotechnology, Inc. til MJV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotide primers | IDT | (custom) | Design specifically for construct |
| GeneBlocks | IDT | (custom) | 500 bp oligonucleotides |
| ApE software | U Utah | (download) | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | Used to purify PCR products |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid |
| Phusion Master Mix with GC Buffer | NEB | M0532S | Used to PCR-amplify gene of interest |
| Gibson assembly reaction mix | NEB | E2611L | Master mix of the following 9 ingredients |
| 1 M Tris-HCl pH7.5 | Teknova | T1075 | Gibson assembly mix |
| 1 M MgCl2 | G Biosiences | 82023-086 | Gibson assembly mix |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | Gibson assembly mix |
| 1 M DTT | Fermentas | R0861 | Gibson assembly mix |
| PEG-8000 | Affymetrix | 19966 | Gibson assembly mix |
| NAD | Applichem | A1124,0005 | Gibson assembly mix |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | Gibson assembly mix |
| Phusion polymerase | NEB | F530S | Gibson assembly mix |
| Taq DNA ligase | NEB | M0208L | Gibson assembly mix |
| Gibthon.org | Website to simplify calculations | ||
| Plasmid PLUS Maxi kit | Qiagen | 12963 | Used to prepare DNA for gene gun bullets |
| Gene Gun system | BioRad | 165-2451 | Includes all parts necessary |
| Nicotania benthamiana | (n/a) | (n/a) | Gift of Jen Sheen, MGH |
| Confocal microscope | Leica | SP5 X MP | Imaging of resultant cells |
| Deep well slides | Electron Microscopy Sciences | 71561-01 | Used for confocal imaging |
| A Plasmid Editor (ApE) | University of Utah | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape | |
| Gibthon:Ligation calculator | http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/ |
References
- Que, Q., et al. Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities. GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).
- Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements. Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).
- Hickey, S. F., et al. Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon. Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).
- Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. Alternative splicing in plants - coming of age. Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).
- Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).
- Dinkins, R. D., et al. Changing transcriptional initiation sites and alternative 5'- and 3'-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).
- Kebeish, R., et al. Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana. Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).
- Maier, A., et al. Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement. Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).
- Kumar, S., et al. Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts. Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).
- Sapir-Mir, M., et al. Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes. Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).
- Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5' mRNA tags. Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Lowenson, J. D., Clarke, S. Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis. The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).
- Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).
- Reumann, S., et al. Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms. The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Hollender, C. A., Liu, Z. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene. (40), (2010).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
