Summary
Эта работа описывает новый способ селективного ориентации субклеточных органелл в растениях, анализировали с использованием BioRad Gene Gun.
Abstract
В целях выявления один белок нескольким субклеточных органелл, растения, как правило, дублируют соответствующие гены, и выразить каждый ген по отдельности, используя сложные стратегий в области регулирования, включая дифференциальных промоутеров и / или сигнальные последовательности. Метаболические инженеры и синтетические биологи, заинтересованные в ориентации ферменты для конкретной органеллы столкнулись с проблемой: белок, который должен быть локализован в более чем одной органеллы, инженер должен клонировать и того же гена многократно. Эта работа представляет собой решение этой стратегии: освоение альтернативного сплайсинга мРНК. Эта технология использует преимущества установленном хлоропластов и пероксисомы ориентации последовательностей и объединяет их в единую мРНК, которая альтернативного сплайсинга. Некоторые варианты сплайсинга отправляются в хлоропласт, некоторые к пероксисоме, а некоторые в цитозоль. Здесь система предназначена для многократного органелл ориентации с альтернативного сплайсинга. В этой работе, GFP как ожидается, будет выражениеEssed в хлоропластов, цитозоле и пероксисоме по серии рационально спроектированными 5 'мРНК тегов. Эти теги имеют потенциал, чтобы уменьшить количество клонирования требуется при гетерологические гены должны быть выражены в нескольких внутриклеточных органелл. Конструкции были разработаны в предыдущей работе 11, и были клонированы с использованием Gibson собрание, перевязки независимый метод клонирования, который не требует ферменты рестрикции. Полученные плазмиды вводили в Nicotiana benthamiana эпидермальный клетках листа с измененным протоколом генной пушки. Наконец, преобразованные листья наблюдались с конфокальной микроскопии.
Introduction
Эта работа является метаболической инженерии / синтетическая биология проект, в котором растительные клетки, сконструированные для экспрессии репортера белка в нескольких органелл, но только с одной конструкции ДНК.
Один из подходов к белков-мишеней в более чем одном месте включает клонирование несколько генетических копий, каждая из которых содержит различной локализации пептида. Каждая копия должна быть введена путем последовательного retransformation, или, наоборот, обратным скрещиванием одинокий преобразований 1. Это включает в себя дополнительную клонирование, и ограничивается одной метке локализации на конце.
Еще один способ локализовать белок в нескольких местах через альтернативного сплайсинга 2-5. РНК транскрибируется из одного гена, но разные копии транскрипта обрабатываются по-разному, часто в более чем одним способом на ячейку. Это может привести к более чем одной РНК в клетке транскрибируется из одного гена. Такие разные MessengeR может кодировать РНК для различных изоформ одного и того же белка, или в случае сдвигу рамки, другим белком в целом. Хотя альтернативный сплайсинг был описан в литературе в течение многих лет, механизмы действия и консервативной донора и рецепторных сайтов сплайсинга только быть выяснены в последнее время 6. Как эти сайты в настоящее время лучше описать, они открывают возможности для машиностроения.
Инженеры метаболические завод столкнулись с проблемой при выражении белок в нескольких органелл. Для белка, который должен быть локализован в более чем одной органеллы, инженер должен клонировать и того же гена многократно, каждый с отдельным сигнальной последовательности направляя ее на органеллы интерес. Для одного гена в трех органелл, это просто три гена. Но в течение шести генов метаболизма, это расширяет до 18 генов, значительных усилий клонирования. Объединение нескольких последовательностей локализации в единый, альтернативно-сплайсированному знакificantly уменьшает эти усилия. Например, реинжиниринг фотодыхание 7,8 и изопреноид синтез 9,10 включает в себя как хлоропластов и пероксисомах. В нашем случае мы воспользовались сайтов сплайсинга как это наблюдается в естественной Arabidopsis системы THALIANA описано ранее 6. Мы рационально переработан последовательность мРНК оставив естественное сайтов сплайсинга в одиночку, но размещены последовательности, которые бы кодируют хлоропласты-или пероксисомы таргетирования теги течение альтернативно-сращены интронов (рис. 1). Экспрессированный белок может иметь или не иметь метку, в зависимости от того, был вырезан пре-мРНК, которая кодируется как интрона (данные 1g и 1h). Более подробную информацию о проектировании конструкций, представленных в этой работе, см. в статье спутником 11.
Потому что это все еще значительные усилия клонирование, Гибсон монтаж, новый метод клонирования ДНК конструкты, является исед в строительстве. Способ Gibson могут быть использованы для любой последовательности, независимо от сайтов рестрикции (рис. 2) 12-14. Удельный смесь ферментов позволяет за один шаг, изотермический сборки в. В этом способе, несколько двухцепочечные линейные части ДНК выполнены так, что они имеют перекрывающиеся последовательности ~ 50 б. Гибсон сборка Смесь ферментов частично переваривает линейные части ДНК, подвергая одиночные нити гомологичных последовательностей. Эти частичные одноцепочечные последовательности повторно отжигали в реакционной смеси, что привело к быстрому, одноступенчатый, независимый от последовательности, лигирование, свободной от реакции субклонирования.
Эта работа описывает 1) рациональную конструкцию альтернативного сплайсинга конструкции для выражения в хлоропластах растений, пероксисомах и cytosols, 2) их клонирование с помощью нового перевязки без метод Gibson сборки, 3) их доставка в табачного листа клеток с генной пушки, и 4) результаты, показывающие органелл адресности, как это наблюдается с GFPи конфокальной микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Проектирование альтернативы-сращены последовательностей сразу для нескольких органелл таргетинга
- Определить места для выражения окончательного белка. За эту работу, интерес в пристреливать хлоропластов, пероксисомы и цитозоль.
- Используйте литературу для идентификации белковых и ДНК последовательности, известные белки-мишени в органеллах интерес. В этом случае последовательность хлоропласта из Arabidopsis ориентации THALIANA L-метилтрансферазы isoaspartate 6,15 и пероксисом последовательность ориентации от арабидопсис транстиретином, как S-синтазы аллантоин 16,17 определены.
- Определить альтернативный-сплайсинга режим, который должны быть направлены на белки, представляющие интерес для правильных органелл. За эту работу, сайты сплайсинга как это наблюдается в естественной системе Arabidopsis 6. Последовательность мРНК был переработан оставляя природных объектов сплайсинга, но последовательности были размещены кодирования хлоропластов или peroxisОме таргетирования теги в качестве альтернативы-сращены интронов (рис. 1).
2. Гибсон Ассамблея части ДНК
См. также Рисунок 2.
Метод сборки Гибсон зависит от действия ряда ферментов в предварительно сделанные смеси до 1) частично переварить концы двухцепочечной ДНК, чтобы сделать единичные нити и 2) отжига бесплатные пар оснований соседних частей ДНК. Это позволяет клонирования ДНК-фрагментов без ограничений сайтах рестрикции.
- Выбрать заказ на элементы в плазмидной ДНК конструкции. В качестве примера TriTag-1 имеет элементы: а) вектор плазмиды (пор, содержащей GFP конструкцию, известную работать в растениями, маркер устойчивости к канамицину, и начала репликации для кишечной палочки и Agrobacterium tumefaciens хозяев), б) промоторной последовательности, (Р ENTCUP2, показано, что учредительный в растениях), В) хлоропластов последовательность (CTS), ориентированная, в) пероксисомы последовательность (PTS), и г адресность) серию сайтов сплайсинга, как описано ранее 6.
- Дизайн-конструкция базы-в-базы с в разработке программного обеспечения силикомарганца. APE является открытым исходным кодом бесплатный пакет полезны для этой работы.
Примечание: TriTag-1, имеет порядок: плазмиды вектор, промоутер, АТГ, сайт сплайсинга донора, хлоропластов последовательность-мишень, сращивания донором сайт, нейтральный сайт, сращивания акцептор сайт, пероксисомы последовательность-мишень, сращивания акцептор сайт, GFP, содержащиеся в вектор плазмиды .- Проектирование в силико конструкцию ДНК таким образом, что существует 50-ВР перекрытие между каждой части при заказе праймеров для ПЦР. Можно использовать 50 п.о. перекрытие в качестве праймеров: 25 пар оснований в каждом направлении.
- Обязательно следить за происхождении каждого из кусков последовательности. Это как: плазмиды, чтобы быть выращены и miniprepped; линейная последовательность, которая может быть использована в качестве матрицы для ПЦР; или последовательность, должны бытьсинтезированы в коммерческих целях? Несколько компаний предлагают недорогие услуги синтеза ДНК фрагментов <500 б.п.. В этом случае сама является TriTag 437 п.о. так что это было выгодно, чтобы заказать его в промышленных масштабах.
- Наилучшие результаты придет тогда, когда все фрагменты ПЦР-амплифицировали и очищали от их матричной ДНК. Маркер устойчивости является хорошим местом, чтобы разделить эту большую ДНК в двух небольших шаблонов, легче ПЦР-усиливается.
- Ограничение Рестрикционный DpnI режет метилированную ДНК. Если шаблон ПЦР был Miniprep из Е. палочка, лечение DpnI удалит загрязняющих матричной ДНК.
- Проектирование в силико конструкцию ДНК таким образом, что существует 50-ВР перекрытие между каждой части при заказе праймеров для ПЦР. Можно использовать 50 п.о. перекрытие в качестве праймеров: 25 пар оснований в каждом направлении.
- Очищают все последовательности ДНК отдельно и элюирования в воде, TE или буфера EB.
- пор векторная часть 1, ~ 3000 б.п. (зеленые стрелки). ПЦР-амплификации и ДПНИ лечить.
- пор вектор часть 2, ~ 3000 б.п. (черные стрелки). ПЦР-амплификации и ДПНИ лечить.
- TriTag вставка, 437 б.п. (синие стрелки). Заказал на коммерческой основе. Resuspend в DDH 2 O.
- P ENTCUP промоутер, ~ 750 б.п. (оранжевые стрелки). ПЦР-усиливается и DpnI лечить.
- Измерение концентрации каждого из кусочков ДНК. Стремитесь к 150 нг / мкл векторных штук.
- Возьмите аликвоту актовом смеси Гибсон из морозильника и разморозить на льду. Это имеется в продаже, но и просто сделать в лаборатории 12-14.
- Есть два шага к этому рецепту: вязкая 5x мастер микс и 15 мкл реакции размера 1.33x аликвоты. Master Mix 5x содержит: 3 мл 1 М Трис-HCl, рН 7,5, 300 мкл 1 М MgCl 2, 600 мкл 10 мМ каждого дНТФ, 300 мкл 1 М DTT, 1,5 г ПЭГ-8000, 20 мг NAD и DDH 2 O 6 мл. Подготовьте 320 мкл аликвоты (18) и заморозить все, кроме одного при -20 ° С Решение будет достаточно вязким. Этикетка эти "5X изотермы буфер"
- Тому, оставшихся (320 мкл), добавить 1,2 мкл T5 экзонуклеазы, 20 мкл Phusion High-FIDelity ДНК-полимераза, 160 мкл Taq ДНК-лигазы и 700 мкл DDH 2 O. Подготовка 15 мкл аликвоты (~ 80) на льду в ПЦР пробирок и хранить при -20 ° С.
- Определить объем для эквимолярных количеств каждого из фрагментов. Есть несколько онлайн калькуляторы, в том числе Gibthon.org. Там должно быть в общей сложности 5 мкл всех частей ДНК. Добавьте их в 15 мкл Гибсон смешать аликвоты. Если это требуется объемы слишком малы, чтобы пипетки, развести фрагментов ДНК и / или использовать более одного аликвоты.
- Не забудьте подготовить контроль векторной ДНК в покое (например, часть ДНК, содержащий маркер устойчивости к антибиотику) и составляют объем с водой.
- Инкубировать пробирки в амплификатор при 50-55 ° С в течение 30-60 минут. Заменить на льду и превращаются в Е. палочка через теплового шока химически компетентные клетки. Не используйте Электрокомпетентные клетки. Высокая концентрация соли и концентрация относительно низким ДНКможет привести к клеткам дуги.
- Применить все 20 мкл к коммерческой подготовки 200 мкл хлоридом кальция компетентную E. палочка.
Инкубируют на льду 30 мин и теплового шока 60 сек при 42 ° С - Вернуться на лед 2 мин, применяется 750 мкл SOC или LB среду и восстановить встряхивая в микроцентрифужных трубки 30 мин при 37 ° С Plate смесь и соответствующие разведения на LB + Кан (или другого соответствующего антибиотика). Это может привести к более высоким фоне (и большим числом событий рекомбинации нецелевых), чем традиционные перевязки основе клонирования, но стоит экран около 10 колоний.
- Применить все 20 мкл к коммерческой подготовки 200 мкл хлоридом кальция компетентную E. палочка.
- Подтверждение клон через последовательность и хранить аликвоты при -80 ° С
3. Biolistic Трансфекцию табака с генной пушки
Это техника, которая устанавливается в Юпитер 18,19. Основные этапы и различия описаны ниже.
- Расти 50-100 мл E. Колорадолитий или 200 мл Agrobacterium. Макси-приготовительному культуру. Концентрации от примерно 1500 нг / мкл требуется, чтобы продолжить.
- Подготовка генной пушки пули, как описано выше. Загрузите их в генной пушки.
- Для трансфекции Nicotiana benthamiana табачного листа эпидермальной ткани, выбрать большой лист близко к основанию 3-месячной завода. Аккуратно вырежьте его и поместить его нижней стороной вверх на влажных бумажных полотенец в блюдо 15 см Петри.
- Установите давление He для генной пушки до 200-250 фунтов на квадратный дюйм.
- Осторожно целью генной пушки между ребрами на нижней стороне листа, около 3-5 см выше него. Отпустите безопасность и доставить частицы к листу. Каждый пуля может быть использован дважды в том же месте на листе. Если лист взрывается, отбросить и начать новый лист-есть некоторые различия в лист вязкости в зависимости от условий роста, таких как возраст, влаги и т.д. Для 12-см листа, ожидайте соответствовать приблизительно 6 выстрелов.
- Храните лист, покрытый верхней частиЧашка Петри в течение 2-3 дней при низкой освещенности на скамейке.
- Осмотрите лист в рассекает микроскоп оснащен ультрафиолетовой люминесценции, и поиск отдельных клеток, экспрессирующих GFP. Проанализируйте 5-10 мм разделы листа.
- Погрузите лист в глубокой микроскопа хорошо скользят под ~ 200 мкл 0,1% Тритон Х-100. Моющее средство помогает предотвратить образование воздушных пузырей на поверхности, а скважина стекло микроскопа позволяет большей площади изображения ткани.
4. Конфокальной микроскопии трансфектированных ткани
Эти инструкции отличаться для каждого инструмента, поэтому важно, чтобы должным образом обучены.
- Для экспериментов обнаружения флуоресценции, установить лазер возбуждения в 489 нм и установить фотоэлектронных детекторов в 500-569 нм для GFP флуоресценции и 630-700 нм для хлорофилла автофлуоресценции. Клетки изображение, используя 40х воды погружения цели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Дизайн усилий явилось результатом значительного планирования. Роман к этому проекту является использование альтернативного сплайсинга для создания пре-мРНК, которая в переводе на дифференциально выраженных протеинов. Эти белки экспрессируются в разных органеллах, в данном случае хлоропласта, пероксисом и / или цитозоль. Мы адаптировали ген Arabidopsis природный который альтернативного сплайсинга 6 и помещают известно хлоропласта 6 и 17 пероксисом ориентации последовательности в альтернативных экзонов (TriTag-1 и TriTag-2). TriTag-3 состоит из пероксисом сигнала встроенного в низкой сложностью области последовательности хлоропластов. Они были размещены в рамке с GFP (рис. 1).
Плазмиды, используемые в данном исследовании, таким образом, содержит несколько элементов: родной альтернативной схемы сплайсинга из гена PIMT2 6 хлоропласта и пероксисома ориентации последовательности, GFP и плазмиды позвоночник. Поскольку каждый из них имеет очень спецификациипоследовательность БР требуется, метод последовательность независимый необходимо. Узел протокол Gibson 12,13 могут быть использованы на любых последовательностей тех пор, пока составные части выполнены с сходства последовательностей друг к другу, и не содержат повторяющихся последовательностей. Короче говоря, линейные фрагменты ДНК построены (либо через ПЦР-амплификации, коммерческого синтеза или переваривания заранее сделал плазмиды), что у них есть ~ 50 б.п. перекрывающихся гомологичной последовательности (рис. 2). Эквимолярные количества каждого из фрагментов ДНК объединены в одной пробирке, содержащей смесь сборки Gibson, инкубировали при 50 ° С в течение одного часа, и трансформировали в Е. палочка. Плазмиды, вытекающие из протокола сборки Gibson были подтверждены секвенированием Sanger.
В этом исследовании три различных GFP органелл таргетирования конструкции были по сравнению с непомеченной GFP и Rubisco-меткой GFP в. Конфокальной микроскопии для обнаружения флуоресценции GFP в сиngle клетки временно трансформированные. В контрольных экспериментах, переходный выражение наблюдается коррелировало с хлоропластов (легко идентифицируемых красной флуоресценции хлорофилла), ядер (большой органелл, что не хлоропластов и имеет только один на ячейку), и / или небольшие органеллы считается пероксисомы. Зеленый (GFP) и красные (хлорофилл аутофлюоресценция) каналы были наложены учиться внутриклеточную локализацию (рис. 3). Для более полного обсуждения этих результатов, попробуйте другие из сопутствующую статью 11.
Как и предсказывалось, во всех трех двойных, ориентированных конструкций, GFP наблюдалась в хлоропластах (рис. 4) в наложения конфокальной микрофотографии. TriTag-1 и TriTag-2 цель GFP также в цитозоль и небольшой органеллы полагают, пероксисом (фиг.4А и 4В соответственно). TriTag-3 цели GFP только хлоропласте и пероксисома, но нецитозоль (рис. 4в). Краткое изложение результатов, показана (рис. 5).
Рисунок 1. Проектирование альтернативного сплайсинга конструкций для дифференциального выражения органелл в Nicotiana benthamiana. Splice диаграммы (а) TriTag-1, (б) TriTag-2, и (с) TriTag-3 показывает ненацеливании последовательности (серый), хлоропластов направленные на последовательности (светло-зеленый), пероксисомными, направленные последовательности (оранжевые), и кодирующей последовательностью GFP используется в переходных экспериментов экспрессии. TriTag-1 и TriTag-2 состоят из альтернативных конструкций сплайсинга; TriTag-3 состоит из пероксисом сигнала встроенного в низкой сложностью области последовательности хлоропластов. Последовательности
Рисунок 2 Схема для Gibson сборки:.. Новым методом для сборки перекрывающиеся фрагменты ДНК Метод Гибсон сборка для плазмиды строительства 12,13 быстро вытесняет традиционные рестрикции-перевязки клонирование во многих лабораториях. По существу, можно спроектировать конструкцию в кремнии, содержащий интерес ДНК точно, состоящий из продуктов ПЦР амплифицированных из различных источников. Конструкция праймеров, которые бесплатный друг к другу, и ПЦР-амплификации каждого фрагмента с цветными праймеров. Добавить все части в одну пробирку с ферментной смеси, и трансформации E. палочки компетентные клетки. Щелкните здесь для просмотра лArger изображения.
Рисунок 3. Процедуры управления бомбардировке в N. benthamiana лист клетки эпидермиса. (переменного тока) Untagged GFP. (а) Зеленый канал. Untagged GFP выражается в ядре и вокруг периферии клетки, соответствующие цитозоле, но не вакуоль. (Б) Красные хлоропласты указывают аутофлюоресценция хлорофилла. (С) Наложение. В этом флуоресценции конструкта наблюдается в ядре и только цитозоле, но не хлоропласты. (DF) Хлоропласт с метками управления GFP. (Г) Зеленый канал. GFP выражается в крупных органелл, с ячейки, как это указано. (Е) Красные хлоропласты указывают аутофлюоресценции хлорophyll. (е) Наложение. В этом случае желтые хлоропласты наблюдалось, что свидетельствует о том, что GFP (зеленый) предназначен для хлоропласта. Печатается с разрешения 11. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 4. Tri-Tag-1, 2, 3 помечены GFP объединены изображений. (А) Tri-Tag1. В этом случае желтый хлоропластов периферии наблюдаются, указывая, что GFP предназначен для хлоропласта. GFP наблюдается также в цитозоле, а также небольших точечных органелл, которые могут быть пероксисомы. (Б) Tri-Tag2. В этом случае желтый хлоропластов периферии наблюдаются, указывая, что GFP предназначен для С hloroplast. GFP наблюдается также в цитозоле, а также небольших точечных органелл, которые могут быть пероксисомы. (С) Tri-Вкладка3. В этом случае желтые хлоропласты наблюдаются, а также небольших точечных органелл, которые могут быть пероксисом. Но GFP не наблюдается в цитоплазме. Печатается с разрешения 11. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 5. Отсеки типичного табачного листа клеток эпидермиса. Здесь их относительные размеры и местоположение внутри клетки показаны, и относительные уровни экспрессии наблюдается через конфокальной микроскопии. Печатается с разрешения 11./ 51234/51234fig5highres.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании, простые стратегии описаны для локализации одну трансгенную белка в несколько клеточных компартментах в растениях. Цель заключается в разработке конструкции, которая бы выразить один ген в более чем одной органеллы в Nicotiana benthamiana. Стратегии включают рациональную конструкцию GFP основе ДНК-конструкций, Gibson сборку, доставку плазмид в клетках листа с генной пушки, и наблюдение за результатами с конфокальной микроскопии.
Три различных короткие, N-концевых теги были разработаны для одновременной хлоропластов, пероксисоме и цитозоле таргетирования 11. Эти "TriTags" были разработаны путем объединения в природе ДНК, кодирующих альтернативного сплайсинга мРНК, которые направляют кодируемых белков в любом хлоропласте плюс цитоплазме 6 или пероксисома плюс цитоплазмы 17. TriTag-3 не зависит от альтернативного сплайсинга и состоит из ориентации хлоропластов последовательности, в которой паturally неструктурированных часть была заменена с пероксисомальной последовательности целевых ориентиров 15,17. Функция TriTags в естественных условиях целевой GFP в Nicotiana benthamiana листьев клеток эпидермиса (рис. 5).
Конфокальные микрофотографии показали, что TriTag-1 и TriTag-2 целевую GFP в хлоропласт, пероксисом, и цитозоле эффективно, но с предпочтением хлоропласта и пероксисом, соответственно (фиг.4А и 4В). TriTag-3 цели GFP только в хлоропласт и пероксисома, но не цитозоль (рис. 4в). В целом, эти теги могут сократить время и ресурсы, расходуемые на клонирование для растений метаболической инженерии, специально для тех, кто нуждается конкретное выражение в хлоропластах и пероксисомах.
Изменения и устранение неисправностей
В TriTags как в настоящее время построены довольно статичным. Тем не менее, underlyinг технологии, альтернативный сплайсинг, чтобы перевод различных тегов с указанием места, является гибким. Существующие специфические тэги хлоропластов и / или пероксисомными может быть изменен для любой другой органеллы, будь то секреция путь, митохондрия, тег ER жительства, вакуоль. Они также могут быть объединены с тканеспецифических промоторов, например, для семян, цветов, корней, листьев, стеблей и т. д.
Для такого проекта, как этот, методом Гибсон сборки 12-14 для клонирования конструкции идеально подходит. Это простой и мощный инструмент субклонировать любую последовательность без ограничений сайтов рестрикции. В один шаг реакций, Гибсон сборка быстро создал конструкций и элементов управления с минимальными усилиями в клонирования. Методика сборки Gibson почти бесконечно модифицируемые для любой желаемой последовательности при условии, что последовательности шаблон может быть PCR-амплифицируют. Хотя в этом примере Gibson сборка была показана с расщепленную плазмиду, ПЦР-амплификации вектор имеет тенденцию работать лучше, чем при использовании усваивается Miniprep.
Генной пушки является быстрым, эффективным методом для временной трансфекции клеток, как было установлено настоящим журнале 18,19. Nicotiana benthamiana имеет большие, лопастные листья клетки эпидермиса, которые и идеально подходит для трансфекции с генной пушки, но и для наблюдая с конфокальной микроскопии. Протокол для изготовления пули хорошо известна. Золото используется в качестве микроносителя в большинстве экспериментов в литературе до сих пор, однако вольфрама микроносители недавно доступны по низким ценам.
Ограничения по методам
Одним из основных ограничений метода Gibson является наличие повторяющихся последовательностей: чем больше перекрытие область является результатом меньше побочных продуктов. Переваривание продуктов ПЦР с DpnI следует удалить загрязнения шаблоны плазмиду; который, как правило, источник сторонепродукции. Ферменты переварить фрагментов ДНК из двухцепочечной ДНК в одноцепочечной. Наличие повторяющихся последовательностей вблизи концов (~ 1 т.п.н.) ДНК-фрагментов значительно увеличивает возможность неправильной рекомбинации. Кроме того, повторяется в течение последовательностей также накладывает ограничения: это не хорошо известны, и трудно контролировать, как далеко T5 экзонуклеазной жует резервную одноцепочечной ДНК. Быстрое активность экзонуклеазы сдерживается высокой температуре реакции (50-55 ° C) в конечном счете денатурации фермента и вязкость уменьшается общее движение в растворе. Для получения дополнительной тонкой настройки на стадии реакции, последовательности и перевязки независимого клонирования (SLIC) 20 является предпочтительным.
Основным недостатком метода генной пушки является то, что она производит только порядка 9:59 временно трансформированных клеток на съемки события.
Значение в отношении существующих методов
Технология сборки Гибсон наслаждается быстрое принятие своей простотой, гибкостью и адаптивностью. Это более быстрый протокол, чем традиционные ограничение / лигирования клонирование, и не требует специфических последовательностей, такие как те, которые требуются для рестрикцией. Это не ограничивается двумя или тремя фрагментов для рекомбинации; оригинальные исследователи продемонстрировали его успешно на срок до 10 частей, хотя и с ограниченным эффективности. Для многих исследователей Gibson сборка делает для большего числа положительных клонов.
Для более трансформантов с методами Biolistic или для создания преобразованного каллусной ткани, использование шкаф стиле биолистической устройства (например, Bio-Rad PDS-1000) должны быть использованы. Альтернативным методом является Agrobacterium инфильтрации.
Будущие приложения
Гибсон сборка позволяет все большие и большие кластеры ДНК для сборки, чтобыточка, где не наблюдалось максимальный предел. Оригинальные авторы использовали его, чтобы собрать несколько сотен т.п.н. ДНК 13.
Способность избирательно воздействовать несколько органелл с одной генетической конструкции имеет потенциал, чтобы уменьшить число генов, нуждающихся должны быть преобразованы. Доставка больших и больших фрагментов ДНК (и, следовательно больших метаболических путей) является краткосрочной перспективе цель. Изопреноидных пути были доставлены в хлоропласт по Biolistic методов; другие кластеры генов, таких как альтернативные пути фиксации углерода находятся на горизонте.
Критические шаги в рамках Протокола.
В Gibson сборки, убедитесь, что последовательности шаблона нет гомологию друг с другом, за исключением в местах целевых рекомбинации.
В биолистической трансформации растений Nicotiana, быть осторожным держать генной пушки около 10-15 см выше листьевй держать давление гелия при 200-250 фунтов на квадратный дюйм. Ближе, чем, хрупкая лист взорвется, и дальше, чем, что они не будут хорошо трансформируется. Через два дня после трансфекции синяк должен появиться на листе, если он правильно трансформируется.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Джен Шин из Массачусетского общего госпиталя за щедрое пожертвование Nicotiana benthamiana саженцев. Джен Буш помог нам значительно в консультации в выращивании растений и создание растильню область. Том Ферранте из Висс институт предложил важную помощь с конфокальной микроскопии. Авторы особенно хотел бы поблагодарить Дона Ingber Детской больнице Бостона и Висс институт по щедрому пожертвованию генной пушки и связанных поставок. Финансирование этого проекта была оказана в рамках соглашения о сотрудничестве с Департаментом энергетики Агентства перспективных исследовательских проектов (ARPA-E Award # DE-000079) для PAS, JCW, и МДМ, и через Chimerion биотехнологии, Inc для MJV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotide primers | IDT | (custom) | Design specifically for construct |
| GeneBlocks | IDT | (custom) | 500 bp oligonucleotides |
| ApE software | U Utah | (download) | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | Used to purify PCR products |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid |
| Phusion Master Mix with GC Buffer | NEB | M0532S | Used to PCR-amplify gene of interest |
| Gibson assembly reaction mix | NEB | E2611L | Master mix of the following 9 ingredients |
| 1 M Tris-HCl pH7.5 | Teknova | T1075 | Gibson assembly mix |
| 1 M MgCl2 | G Biosiences | 82023-086 | Gibson assembly mix |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | Gibson assembly mix |
| 1 M DTT | Fermentas | R0861 | Gibson assembly mix |
| PEG-8000 | Affymetrix | 19966 | Gibson assembly mix |
| NAD | Applichem | A1124,0005 | Gibson assembly mix |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | Gibson assembly mix |
| Phusion polymerase | NEB | F530S | Gibson assembly mix |
| Taq DNA ligase | NEB | M0208L | Gibson assembly mix |
| Gibthon.org | Website to simplify calculations | ||
| Plasmid PLUS Maxi kit | Qiagen | 12963 | Used to prepare DNA for gene gun bullets |
| Gene Gun system | BioRad | 165-2451 | Includes all parts necessary |
| Nicotania benthamiana | (n/a) | (n/a) | Gift of Jen Sheen, MGH |
| Confocal microscope | Leica | SP5 X MP | Imaging of resultant cells |
| Deep well slides | Electron Microscopy Sciences | 71561-01 | Used for confocal imaging |
| A Plasmid Editor (ApE) | University of Utah | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape | |
| Gibthon:Ligation calculator | http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/ |
References
- Que, Q., et al. Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities. GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).
- Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements. Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).
- Hickey, S. F., et al. Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon. Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).
- Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. Alternative splicing in plants - coming of age. Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).
- Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).
- Dinkins, R. D., et al. Changing transcriptional initiation sites and alternative 5'- and 3'-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).
- Kebeish, R., et al. Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana. Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).
- Maier, A., et al. Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement. Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).
- Kumar, S., et al. Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts. Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).
- Sapir-Mir, M., et al. Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes. Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).
- Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5' mRNA tags. Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Lowenson, J. D., Clarke, S. Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis. The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).
- Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).
- Reumann, S., et al. Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms. The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Hollender, C. A., Liu, Z. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene. (40), (2010).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
