Summary
Detta arbete beskriver en ny metod för att selektivt rikta subcellulära organeller i växterna, analyserades med användning av BioRad Gene Gun.
Abstract
För att rikta ett enda protein till flera subcellulära organeller, växter duplicera vanligtvis relevanta generna, och uttrycka varje gen för sig med hjälp av komplexa regulatoriska strategier inklusive differentialtagare och / eller signalsekvenser. Metabola ingenjörer och syntetiska biologer som är intresserade av att rikta enzymer till en särskild organell står inför en utmaning: För ett protein som är att vara lokaliserad till mer än en organell, måste ingenjören klona samma gen flera gånger. Detta arbete presenterar en lösning på denna strategi: att utnyttja alternativ splitsning av mRNA. Denna teknik utnyttjar etablerade kloroplast och peroxisome inriktning sekvenser och kombinerar dem till en enda mRNA som alternativt skarvas. Vissa splitsningsvarianter skickas till kloroplasten, en del till den peroxisom, och en del till cytosolen. Här är systemet utformat för flerorganellriktad med alternativ splitsning. I detta arbete var GFP förväntas vara uttryckEssed i kloroplasten, cytosolen, och peroxisome genom en serie av rationellt utformade 5 'mRNA-taggar. Dessa taggar har potential att minska mängden kloning krävs när heterologa gener behöver uttryckas i flera subcellulära organeller. Konstruktionerna utformades i tidigare arbeten 11, och klonades med användning av Gibson montering, en ligering oberoende kloningsmetod som inte kräver restriktionsenzymer. De resulterande plasmiderna infördes i Nicotiana benthamiana epidermal bladceller med en modifierad Gene Gun-protokollet. Slutligen har transformerade blad observeras med konfokalmikroskopi.
Introduction
Detta arbete är en metabolisk ingenjörs / syntetisk biologi projekt där växtceller för att uttrycka en reporter protein i flera organeller, men med bara en enda DNA-konstruktion.
Ett tillvägagångssätt till målproteiner till mer än ett läge innebär klonings flera genetiska kopior, var och en innehållande en annan lokalisering peptid. Varje kopia måste införas genom successiv återtransformation eller alternativt genom tillbakakorsning enstaka transformer 1. Detta innebär ytterligare kloning, och begränsas av en lokalisering tagg per terminal.
Ett annat sätt att lokalisera ett protein till flera platser är genom alternativ splitsning 2-5. RNA transkriberad från en enda gen, men olika exemplar av transkriptet bearbetas på olika sätt, ofta i mer än ett sätt per cell. Detta kan resultera i mer än en budbärar-RNA i cellen som transkriberats från en enda gen. Dessa olika väR-RNA kan koda för olika isoformer av samma protein, eller i fallet med en läsramsförskjutning, ett annat protein helt och hållet. Trots att alternativ splitsning har beskrivits i litteraturen under många år, är de verkningsmekanismer och bevarad donator och receptor-splitsningsställen bara att belysas senare 6. Eftersom dessa platser håller bättre beskrivas, de öppnar upp möjligheter för teknik.
Växt metabola ingenjörer står inför en utmaning när man uttrycker ett protein i flera organeller. För ett protein som ska lokaliseras till fler än en organell bör installatören klona samma gen flera gånger, var och en med en separat signalsekvensen att rikta den till organellen är av intresse. För en enda gen i tre organeller, detta är helt enkelt tre gener. Men för en sex-gen metaboliska väg, utvidgar detta till 18 gener, en betydande kloning ansträngning. Kombinera flera lokaliseringssekvenser till en enda, alternativt skarvade gen teckenificantly minskar denna insats. Till exempel, re-engineering photorespiration 7,8 och isoprenoid syntes 9,10 involverar både kloroplaster och peroxisomerna. I vårt fall tog vi fördel av splitsningsställen som observerats i en naturlig Arabidopsis thaliana systemet beskrivits tidigare 6. Vi omgjorda rationellt den mRNA-sekvens som lämnar de naturliga splitsningsställen ensam, men placeras sekvenser som skulle koda kloroplast-eller peroxisom-targeting tags inom de alternativt-splitsade intron (Figur 1). Det uttryckta proteinet kan eller kan inte ha en etikett, beroende på om den pre-mRNA som kodade för det skars ut som ett intron (fig. 1g och 1h). För mer information om utformningen av konstruktioner som presenteras i detta arbete, se följeslagare artikel 11.
Eftersom detta är fortfarande en betydande klonings ansträngning, Gibson församling, en ny metod för kloning av DNA-konstruktioner, är used i byggandet. Den Gibson-metoden kan användas för någon sekvens, oberoende av restriktionsställen (Figur 2) 12-14. Den specifika blandningen av enzymer möjliggör en en-stegs, isotermisk montering. I denna metod är flera dubbelsträngade linjära DNA-delar utformas så att de har överlappande sekvenser av ~ 50 bp. Den Gibson montering enzymblandning smälter delvis de linjära DNA-delar, utsätta enstaka trådar av homologa sekvenser. Dessa partiella enkelsträngade sekvenser åter glödgades i reaktionsblandningen, vilket resulterar i en snabb, en-stegs, sekvensoberoende, ligering fria subkloning reaktion.
Detta arbete beskriver ett) rationella konstruktion alternativt splitsade konstruktioner för uttryck i växt kloroplaster, peroxisomer och cytosols, 2) deras kloning med hjälp av den nya ligation-fri metod för Gibson församling, 3) deras leverans i tobaksbladceller med Gene Gun, och 4) resultat som visar organell inriktning, som observerats med GFPoch konfokalmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utformning av alternativ-skarvade Sekvenser för Multiple organellriktad
- Bestäm platser för slutlig proteinuttryck. För detta arbete, är intresset för att rikta kloroplasten, peroxisome och cytosolen.
- Använd litteraturen för att identifiera protein-och DNA-sekvenser som är kända till målproteiner till organeller av intresse. I detta fall en kloroplast-målsökningssekvensen från Arabidopsis thaliana L-isoaspartate metyltransferas 6,15 och en peroxisom målsekvens från Arabidopsis thaliana transtyretin liknande S-allantoin syntas 16,17 bestämdes.
- Identifiera ett alternativ-skarvning regim som bör inriktas på proteiner av intresse till rätt organeller. För detta arbete, skarva platser som observerats i en naturlig Arabidopsis-system 6. MRNA-sekvensen omgjorda lämnar naturliga splitsningsställen, men sekvenser placerades kodning kloroplast-eller peroxisome-targeting tags inom alternativt-splitsade introner (Figur 1).
2. Gibson Montering av DNA-delar
Se även fig 2.
Den Gibson monteringsmetoden beror på effekten av flera enzymer i en färdig mix till 1) delvis smälta ändarna av den dubbelsträngade DNA för att göra enkelsträngar och 2) härdnings gratis baspar i angränsande DNA-delar. Detta gör det möjligt för kloning av DNA-fragment utan de begränsningar av restriktionsställen.
- Välj en order på elementen i DNA-plasmid-konstruktion. Som ett exempel TriTag-en har inslag av: a) en plasmidvektor (pore, innehållande en GFP-konstruktion känd att fungera i växter, en kanamycin-resistensmarkör och replikationsursprung för E. coli och Agrobacterium tumefaciens värdar), b) en promotorsekvens (P ENTCUP2, visats vara konstitutiv i växter), C) en kloroplast-målsökningssekvensen (CTS), c) en peroxisom målsekvens (PTS), och d) en serie av splitsningsställen såsom beskrivits tidigare 6.
- Utforma konstruktionen bas-till-bas med in silico design mjukvara. ApE är ett open source freeware paket användbara för detta arbete.
Anm: TriTag-1, har de ordning: plasmidvektor, promotor, ATG, splitsningsdonatorställe, kloroplast målsekvens, splitsningsdonatorställe, neutral plats, splitsningsacceptorställe, peroxisom målsekvensen splitsningsacceptorställe, GFP som återges i plasmidvektor .- Utforma in silico-DNA-konstruktion, så att det finns en 50-bp överlappning mellan varje bit vid beställning av primrar för PCR. Det är möjligt att använda 50 bp överlappning som primers: 25 bp varje riktning.
- Var noga med att hålla reda på ursprunget för var och en av de sekvensbitar. Är det så: en plasmid som ska odlas och miniprepped; en linjär sekvens, som kan användas som en PCR-mall; eller en sekvens som kommer att behöva varasyntetiserades kommersiellt? Flera företag erbjuder billiga DNA-syntestjänster för fragment <500 bp. I detta fall TriTag själv är 437 bp så det var fördelaktigt att beställa den kommersiellt.
- De bästa resultaten kommer om alla fragment är PCR-amplifierade och renas från sina templat-DNA. Den resistensmarkör är en bra plats för att dela denna stora DNA i två mindre mallar som är lättare att PCR-amplifieras.
- Restriktionsrestriktionsenzym Dpnl klipper metylerade DNA. Om PCR-mallen var en miniprep från E. coli, kommer Dpnl behandling avlägsna kontaminerande DNA-mall.
- Utforma in silico-DNA-konstruktion, så att det finns en 50-bp överlappning mellan varje bit vid beställning av primrar för PCR. Det är möjligt att använda 50 bp överlappning som primers: 25 bp varje riktning.
- Rena alla DNA-sekvenser för sig och elueras i vatten, TE eller buffert EB.
- PORE vektor del 1, ~ 3.000 bp (gröna pilar). PCR-amplifierade och Dpnl behandlas.
- PORE vektor del 2, ~ 3.000 bp (svarta pilar). PCR-amplifierade och Dpnl behandlas.
- TriTag insats, 437 bp (blå pilar). Beställt kommersiellt. Resuspend i DDH 2 O.
- P ENTCUP promotor, ~ 750 bp (orange pilar). PCR-amplifierade och Dpnl behandlas.
- Mät koncentrationerna av var och en av de DNA-bitar. Sikta på 150 ng / l av vektor bitar.
- Tag en alikvot av Gibson aggregatet mixen ut ur frysen och tina på is. Detta är kommersiellt tillgänglig, men också enkla att göra i labbet 12-14.
- Det finns två steg till detta recept: en viskös 5x huvudblandning och 15 il reaktion storlek 1.33x alikvoter. Den 5x huvudblandning innehåller: 3 ml 1 M Tris-HCl pH 7,5, 300 | il 1 M MgCl2, 600 | il 10 mM av varje dNTP, 300 ^ il 1 M DTT, 1,5 g PEG-8000, 20 mg NAD och DDH 2 O till 6 ml. Bered 320 | il alikvoter (18) och frysa alla utom en vid -20 ° C. Lösningen kommer att vara ganska viskösa. Märk dessa "5X isotherm buffert"
- För den som kvar (320 l), tillsätt 1,2 l T5 Exonukleas, 20 ^ Phusion High-Fidelity DNA-polymeras, 160 l Taq DNA-ligas och 700 l DDH 2 O. Förbered 15 l alikvoter (~ 80) på is i PCR-rör och förvara vid -20 ° C.
- Bestäm volymerna för ekvimolära mängder av vart och ett av fragmenten. Det finns några online räknare, inklusive Gibthon.org. Det bör finnas totalt 5 | il av alla DNA-bitar. Lägg dem till 15 l Gibson mix delmängd. Om detta kräver att volymerna för små för att pipett, späd DNA-fragment och / eller använda mer än en portion.
- Glöm inte att förbereda en kontroll av vektor-DNA ensamt (t.ex. DNA-del som innehåller antibiotikaresistensmarkör) och fyll med vatten.
- Inkubera rören i en anordning för cyklisk värmebehandling vid 50-55 ° C under 30-60 minuter. Sätt på is och förvandlas till E. coli via värmechock kemiskt kompetenta celler. Använd inte elektro celler. Den höga saltkoncentrationen och den relativt låga DNA-koncentrationkan få cellerna till båge.
- Applicera alla 20 fil till en kommersiell beredning av 200 l kalcium-klorid kompetent E. coli.
Inkubera på is i 30 min och värmechock 60 sek vid 42 ° C - Återgå till is 2 min, tillämpas 750 jil SOC-eller LB-medium, och återhämta sig under skakning i ett mikrocentrifugrör 30 min vid 37 ° C. Plate blandningen och lämpliga spädningar på LB + Kan (eller annan lämplig antibiotika). Detta kan leda till högre bakgrunden (och ett större antal icke-mål rekombination) än traditionella ligation-baserad kloning, men det är värt att screena ca 10 kolonier.
- Applicera alla 20 fil till en kommersiell beredning av 200 l kalcium-klorid kompetent E. coli.
- Bekräfta klon via sekvens och lagra en portion vid -80 ° C
3. Biolistic Transfektion av tobak med Gene Gun
Detta är en teknik som är etablerad i JoVE 18,19. Nyckelsteg och skillnader beskrivs nedan.
- Grow 50-100 ml E. coli eller 200 ml Agrobacterium. Maxi-prep i kulturen. En koncentration av ca 1500 ng / ul krävs för att fortsätta.
- Förbered gen pistol kulor som tidigare beskrivits. Ladda dem i Gene Gun.
- För transfektion av Nicotiana benthamiana tobaksblad epidermal vävnad, välj ett stort blad nära basen av en 3 månader gammal anläggning. Skär den försiktigt och placera den undersidan uppåt på våta pappershanddukar i en 15 cm petriskål.
- Ställ Han trycket för Gene Gun till 200-250 psi.
- Noggrant syfta genkanonen mellan ribborna på den nedre sidan av ett blad, ca 3-5 cm ovanför den. Frigör säkerhets och leverera partiklarna till bladet. Varje kula kan användas två gånger på samma ställe på bladet. Om blad exploderar, kasta och börja ett nytt blad-det finns en viss variation i blad seghet på grund av tillväxtförhållanden som ålder, fukt, etc. För en 12-cm blad, räkna med att passa ca 6 skott.
- Förvara blad, täckt med överdelen av enPetriskål för 2-3 dagar i svagt ljus på bänken.
- Undersök löv i en dissekera mikroskop utrustat med UV-fluorescens, och söka efter enskilda celler som uttrycker GFP. Dissekera 5-10 mm sektioner av löv.
- Sänk bladet i en djup brunn objektsglas under ~ 200 | il 0,1% Triton X-100. Tvättmedlet hjälper till att förhindra luftbubblor från att bildas på ytan, och den djupa väl objektglas möjliggör en större vävnadsavbildningsområdet.
4. Konfokalmikroskopi av transfekterade Vävnad
Dessa instruktioner varierar för varje instrument, så det är viktigt att få rätt utbildning.
- För experiment fluorescens upptäckt, ange excitation laser på 489 nm, och ställa fotomultiplikatorn detektorer till 500-569 nm för GFP fluorescens och 630-700 nm för klorofyll auto-fluorescens. Bildceller med användning av ett 40x vattenimmersionsobjektiv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utformningen ansträngning var ett resultat av betydande planering. Novel till detta projekt är användningen av alternativ splitsning för att skapa en pre-mRNA som är översatt till differentiellt uttryckta proteiner. Dessa proteiner uttrycks i olika organeller, i detta fall kloroplasten, peroxisom-och / eller cytosolen. Vi anpassade naturlig Arabidopsis gen som alternativt skarvas 6, och placerade kända kloroplast 6 och peroxisome 17 inriktning sekvenser i alternativa exoner (TriTag-1 och TriTag-2). TriTag-3 består av en peroxisom signal inbäddad i en låg komplexitet regionen av kloroplast-sekvensen. Dessa placerades i ram med GFP (figur 1).
De plasmider som användes i denna studie innehöll sålunda flera element: den nativa alternativ splits regim från PIMT2 gen 6, kloroplasten och peroxisomal targeting sekvenser, GFP, och en plasmid-ryggrad. Eftersom alla har mycket specific erforderliga sekvensen, som är nödvändigt för en sekvens-oberoende metod. Den Gibson monteringsprotokoll 12,13 kan användas på alla sekvenser så länge som de ingående delarna är utformade med sekvenslikhet med varandra, och inte innehåller upprepade sekvenser. I korthet, är linjära DNA-fragment konstrueras (antingen via PCR-amplifiering, kommersiell syntes eller nedbrytning av en färdig plasmid) så att de har ~ 50 bp överlappning homolog sekvens (Figur 2). Ekvimolära mängder av var och en av DNA-fragmenten är kombinerade i ett enda rör innehållande Gibson aggregatet mix, inkuberades vid 50 ° C under en timme, och transformerades in i E. coli. De plasmider som följer av Gibson monteringsprotokoll bekräftades av Sanger-sekvensering.
I denna studie var de tre olika GFP-organelle-targeting konstruktionerna jämfördes med omärkt GFP och en Rubisco-märkt GFP. Konfokalmikroskopi användes för att påvisa GFP fluorescens i single celler transient transformerade. I kontrollexperiment, var övergående uttryck observeras korrelerad till kloroplaster (lätt identifierbara genom den röda autofluorescens av klorofyll), kärnorna (stor organell som inte är en kloroplast och har endast en per cell), och / eller små organeller tros vara peroxisomer. Grön (GFP) och röda (klorofyll autofluorescens) kanaler var överlagras för att studera intracellulära lokalisering (Figur 3). För en mer fullständig diskussion av dessa resultat, se vår följeslagare artikel 11.
Som förutspått, i alla tre dubbla inriktnings konstruktioner ades GFP observerades i kloroplasterna (Figur 4) i overlay konfokala mikrofotografier. TriTag-1 och TriTag-2 mål GFP också till cytosolen och den lilla organell tros vara den peroxisom (figurerna 4a och 4b, respektive). TriTag-3 mål för GFP till endast kloroplasten och peroxisome, men intecytosolen (Figur 4c). En sammanfattning av resultaten i diagramform (Figur 5).
Figur 1. Utformning av alternativa splits konstruktioner för differentiell organell expression i Nicotiana benthamiana. Splice diagram av (a) TriTag-1, (b) TriTag-2, och (c) TriTag-3 som visar icke-målsökningssekvenser (grå), kloroplast riktar sekvenser (ljusgrön), peroxisome riktar sekvenser (orange) och GFP-kodande sekvensen användes i transient expressionsexperiment. TriTag-1 och TriTag-2 består av alternativa splits konstruktioner; TriTag-3 består av en peroxisom signal inbäddad i en låg komplexitet regionen av kloroplast-sekvensen. Sekvenser av
Figur 2 Flödesschema för Gibson montering:.. En ny metod för montering av överlappande DNA-fragment The Gibson monteringsmetod för plasmid konstruktion 12,13 snabbt ersätter traditionella begränsning-ligation kloning i många laboratorier. I huvudsak kan man utforma ett konstrukt in silico som innehåller DNA av intresse exakt sammansatt av PCR-produkter som amplifierats från olika källor. Designa primers som är gratis till varandra, och PCR-amplifiera varje fragment med de färgade primers. Lägg alla bitar i ett enda rör med enzymblandning, och omvandla E. coli-kompetenta celler. Klicka här för att se lArger bild.
Figur 3. Kontroll behandlingar bombarderades i N. benthamiana blad epidermala celler. (AC) Untagged GFP. (a) grön kanal. Untagged GFP uttrycks i kärnan och runt cellens periferi, som motsvarar den cytosol, men inte vakuolen. (B) Röda kloroplaster indikera autofluorescens av klorofyll. (C) överlägg. I denna konstruktion fluorescens observeras i kärnan och endast cytosolen, men inte kloroplaster. (Df) Kloroplast-märkta GFP kontroll. (D) Grön kanal. GFP uttrycks i de stora organeller, med en cell som beskrivs. (E) Röda kloroplaster indikerar autofluorescens av klorklorofyll. (f) Överlägg. I detta fall gula kloroplaster observeras, vilket indikerar att GFP (grön) är riktad till kloroplasten. Omtryckt med tillåtelse 11. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 4. Tri-Tag-1, 2, 3 tagged GFP fusion bilder. (A) Tri-Tag1. I detta fall gul kloroplast periferier observeras, vilket indikerar att GFP är riktad till kloroplasten. GFP är också observerats i cytosolen samt små punktat organeller som kan vara peroxisomerna. (B) Tri-tag2. I detta fall gul kloroplast periferier observeras, vilket indikerar att GFP riktar sig till C hloroplast. GFP är också observerats i cytosolen samt små punktat organeller som kan vara peroxisomerna. (C) Tri-TAG3. I detta fall gula kloroplaster iakttas, liksom små punktat organeller som kan vara peroxisomer. Men GFP inte observeras i cytosolen. Omtryckt med tillåtelse 11. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 5. Fack för en typisk tobaksblad epidermal cell. Här deras relativa storlek och platser i cellen visas, och de relativa uttrycksnivåerna observeras via konfokalmikroskopi. Omtryckt med tillåtelse 11./ 51234/51234fig5highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie är enkla strategier har beskrivits för att lokalisera en enda transgena proteiner till flera cellulära utrymmen i växter. Målet var att designa konstruktion som skulle uttrycka en enda gen i mer än en organell i Nicotiana benthamiana. Strategier innefattar rationell design av GFP-baserad DNA-konstruktioner, Gibson montering, leverans av plasmiderna till bladceller med Gene Gun, och observation av resultaten med konfokalmikroskopi.
Tre olika korta, N-terminal taggar utformades för samtidig chloroplast, peroxisom och cytosolen inriktning 11. Dessa "TriTags" utformades genom att kombinera naturligt förekommande DNA som kodar alternativt splitsade mRNA som styr de kodade proteinerna till antingen kloroplasten plus cytoplasman 6 eller peroxisome plus cytoplasman 17. TriTag-3 är inte beroende av alternativ splitsning och består av en kloroplast inriktning sekvens där en narellt ostrukturerad partiet har ersatts med en peroxisomal targeting sekvens 15,17. Den TriTags funktionen in vivo för att rikta GFP i Nicotiana benthamiana blad epidermala celler (Figur 5).
Konfokala mikrofotografier visade att TriTag-1 och TriTag-2 mål GFP till kloroplasten, peroxisom och cytosol effektivt, men med företräde till kloroplasten och peroxisom, respektive (Fig. 4a och 4b). TriTag-3 mål GFP endast till kloroplasten och peroxisom, men inte i cytosolen (Figur 4c). Sammantaget kan dessa taggar reducera tid och resurser läggs på kloning för växt metabolisk teknik, speciellt för dem som behöver särskilt uttryck i kloroplasterna och peroxisomerna.
Ändringar och felsökning
De TriTags som nu byggts är ganska statisk. Emellertid underlying-teknik, alternativ splitsning för att möjliggöra översättningen av olika platsspecifika taggar, är flexibel. De befintliga kloroplast och / eller peroxisom specifika taggar skulle kunna ändras av någon annan organell, vare sig det är utsöndringsvägen, mitokondrien, en ER uppehålls etikett, vakuolen. Dessa kan också kombineras med vävnadsspecifika promotorer, t.ex. för frön, blommor, rötter, blad, stjälkar, etc.
För ett projekt som detta, Gibson monteringsmetoden 12-14 för kloning av konstruktioner är perfekt. Det är ett enkelt och kraftfullt verktyg för att subklona varje sekvens utan de begränsningar av restriktionsställen. I ett steg reaktioner, Gibson montering snabbt skapade konstruktioner och kontroller med minimal ansträngning i kloning. The Gibson monteringsteknik är nästan oändligt modifierbara för varje önskad sekvens så länge som mallsekvenser kan PCR-amplifieras. Även i detta exempel Gibson församling visades med en smält plasmidPCR-amplifiering av vektorn tenderar att fungera bättre än att använda en digere miniprep.
Den Gene Gun är en snabb, effektiv metod för transient transfektion av celler, som har fastställts av denna tidskrift 18,19. Nicotiana benthamiana har stora, flikiga blad epidermala celler, som är både perfekt för transfektion med Gene Gun, men också för observera med konfokalmikroskopi. Protokollet för framställning av kulor är väl etablerad. Guld har använts som en mikrobärare i de flesta experiment i litteraturen hittills, men volfram mikro är nyligen tillgängliga till låg kostnad.
Begränsningar av de tekniker
En viktig begränsning av Gibson metoden är närvaron av upprepade sekvenser: ju längre den överlappande regionen är färre sidoprodukter resultat. Digerering av PCR-produkter med Dpnl bör avlägsna kontaminerande plasmid-mallar; vilka vanligtvis är källan till sidaprodukter. Enzymerna smälta DNA-fragmenten från dubbelsträngat DNA i enkelsträngad. Närvaron av upprepade sekvenser nära ändarna (~ 1 kb) av DNA-fragmenten ökar avsevärt möjligheten till felaktig rekombination. Vad bra, upprepar inom sekvenserna också utgöra en begränsning: det är inte känt, och svårt att kontrollera hur långt T5 exonukleas tuggar tillbaka enkelsträngat DNA. Den snabba aktiviteten av exonukleas dämpas av hög reaktionstemperatur (50-55 ° C) så småningom denaturera enzymet, och viskositeten minskar den övergripande rörelse i lösningen. För mer finjustering av reaktionssteg, sekvens och ligering oberoende kloning (SLIC) 20 är att föredra.
En allvarlig begränsning med genkanonen tekniken är att den endast producerar i storleksordningen 1-10 transient transformerade celler per skytte händelse.
Betydelse avseende befintliga metoder
Den Gibson monteringsteknik njuter snabbt antagande för dess enkelhet, flexibilitet och anpassningsförmåga. Det är en snabbare protokoll än traditionella begränsningar / ligation kloning, och inte kräver specifika sekvenser såsom de som krävs för restriktionsklyvning. Det är inte begränsat till två eller tre fragment som skall rekombinerade; de ursprungliga forskarna har visat att det med framgång i upp till 10 delar, om än med begränsad effektivitet. För många forskare Gibson församling gör för ett större antal positiva kloner.
För fler transformanter med Biolistic tekniker, eller för att skapa transforme kallusvävnad, bör användas användningen av en biolistisk enhet skåp-stil (t.ex. BioRad PDS-1000). En alternativ metod är Agrobacterium infiltration.
Framtida Applikationer
Gibson montering möjliggör större och större kluster av DNA som skall monteras, tillden punkt där ett gränsvärde inte har iakttagits. De ursprungliga författarna har använt den för att sätta ihop flera hundra kilobaser DNA 13.
Förmågan att selektivt rikta flera organeller med en enda genetisk konstruktion har potential att minska antalet gener som behöver omvandlas. Leveransen av större och större DNA-fragment (och därmed större metaboliska vägar) är en kortsiktigt mål. Isoprenoid vägar har levererats till kloroplasten genom biolistiska metoder; andra genkluster såsom alternativa koldioxidfixavägar finns vid horisonten.
Kritiska steg Inom protokollet.
I Gibson montering, se mallsekvenserna inte har homologi till varandra förutom vid målet rekombineringsställena.
I biolistisk transformation av Nicotiana växter, vara noga med att hålla genkanonen ca 10-15 cm ovanför bladen ennd hålla heliumtryck vid 200-250 psi. Närmare än så kommer det sköra blad explodera, och längre än att de inte kommer att bli väl förvandlas. Två dagar efter transfektion ett blåmärke ska visas på bladet om det är korrekt omvandlas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Jen Sheen i Massachusetts General Hospital för den generösa donationen av Nicotiana benthamiana plantor. Jen Bush hjälpt oss mycket i rådgivning i odling av växter och inrätta en tillväxtkammare område. Tom Ferrante av Wyss Institutet erbjöd avgörande hjälp med konfokalmikroskopi. Författarna vill särskilt tacka Don Ingber av Barnsjukhuset Boston och Wyss Institutet för den generösa donationen av en Gene Gun och tillhörande förbrukningsmaterial. Finansieringen för detta projekt tillfördes genom ett samarbetsavtal med Department of Energy Advanced Research Projects Agency (ARPA-E Award # DE-000.079) för PAS, JCW, och MdM, och genom Chimerion Biotechnology, Inc. för MJV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotide primers | IDT | (custom) | Design specifically for construct |
| GeneBlocks | IDT | (custom) | 500 bp oligonucleotides |
| ApE software | U Utah | (download) | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | Used to purify PCR products |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid |
| Phusion Master Mix with GC Buffer | NEB | M0532S | Used to PCR-amplify gene of interest |
| Gibson assembly reaction mix | NEB | E2611L | Master mix of the following 9 ingredients |
| 1 M Tris-HCl pH7.5 | Teknova | T1075 | Gibson assembly mix |
| 1 M MgCl2 | G Biosiences | 82023-086 | Gibson assembly mix |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | Gibson assembly mix |
| 1 M DTT | Fermentas | R0861 | Gibson assembly mix |
| PEG-8000 | Affymetrix | 19966 | Gibson assembly mix |
| NAD | Applichem | A1124,0005 | Gibson assembly mix |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | Gibson assembly mix |
| Phusion polymerase | NEB | F530S | Gibson assembly mix |
| Taq DNA ligase | NEB | M0208L | Gibson assembly mix |
| Gibthon.org | Website to simplify calculations | ||
| Plasmid PLUS Maxi kit | Qiagen | 12963 | Used to prepare DNA for gene gun bullets |
| Gene Gun system | BioRad | 165-2451 | Includes all parts necessary |
| Nicotania benthamiana | (n/a) | (n/a) | Gift of Jen Sheen, MGH |
| Confocal microscope | Leica | SP5 X MP | Imaging of resultant cells |
| Deep well slides | Electron Microscopy Sciences | 71561-01 | Used for confocal imaging |
| A Plasmid Editor (ApE) | University of Utah | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape | |
| Gibthon:Ligation calculator | http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/ |
References
- Que, Q., et al. Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities. GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).
- Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements. Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).
- Hickey, S. F., et al. Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon. Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).
- Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. Alternative splicing in plants - coming of age. Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).
- Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).
- Dinkins, R. D., et al. Changing transcriptional initiation sites and alternative 5'- and 3'-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).
- Kebeish, R., et al. Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana. Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).
- Maier, A., et al. Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement. Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).
- Kumar, S., et al. Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts. Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).
- Sapir-Mir, M., et al. Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes. Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).
- Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5' mRNA tags. Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Lowenson, J. D., Clarke, S. Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis. The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).
- Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).
- Reumann, S., et al. Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms. The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Hollender, C. A., Liu, Z. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene. (40), (2010).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
