Summary
يصف هذا العمل طريقة جديدة لاستهداف انتقائي العضيات التحت خلوية في النباتات، ويعاير باستخدام BIORAD جين غون.
Abstract
من أجل استهداف بروتين واحد لالعضيات التحت خلوية متعددة، النباتات عادة تكرار الجينات ذات الصلة، والتعبير عن كل جينة على حدة باستخدام استراتيجيات التنظيمية المعقدة بما في ذلك الفرق المروجين و / أو متواليات إشارة. وتواجه المهندسين وعلماء الأحياء الاصطناعية الأيض المهتمين في استهداف الإنزيمات إلى عضية خاص مع التحدي: للحصول على البروتين الذي هو أن تكون مترجمة إلى عضية أكثر من واحد، ويجب على مهندس استنساخ نفس الجين عدة مرات. ويعرض هذا العمل حل لهذه الاستراتيجية: تسخير الربط البديلة للمرنا. هذه التكنولوجيا يستفيد من اليخضور وأنشأت بيروكسية استهداف تسلسل ويجمع بينهما في مرنا واحد هو أن تقسم بدلا من ذلك. يتم إرسال بعض المتغيرات لصق إلى بلاستيدات الخضراء، وبعض إلى بيروكسية، وبعض إلى العصارة الخلوية. هنا تم تصميم هذا النظام لاستهداف متعدد عضية مع الربط البديلة. في هذا العمل، وكان من المتوقع أن تكون EXPR GFPessed في بلاستيدات الخضراء، العصارة الخلوية، وبيروكسية من خلال سلسلة من تصميم بعقلانية 5 'مرنا به. هذه العلامات لديها القدرة على تقليل كمية الاستنساخ المطلوبة عند تحتاج إلى أن تتجلى في العضيات التحت خلوية متعددة الجينات مغاير. تم تصميم البناءات في العمل السابق 11، وكانت المستنسخة باستخدام جيبسون التجمع، وربط الأسلوب مستقلة الاستنساخ التي لا تتطلب الإنزيمات قيود. أدخلت البلازميدات الناتجة في نيكوتيانا benthamiana خلايا البشرة ورقة مع بروتوكول تعديل الجينات بندقية. أخيرا، لوحظت الأوراق تتحول مع المجهري متحد البؤر.
Introduction
هذا العمل هو مشروع الهندسة / البيولوجيا التركيبية التمثيل الغذائي حيث صممت الخلايا النباتية للتعبير عن البروتين مراسل في العضيات متعددة ولكن فقط مع بناء الحمض النووي واحد.
نهج واحد لاستهداف البروتينات لأكثر من موقع واحد ينطوي على استنساخ نسخ جينية متعددة، كل منها يحتوي على الببتيد توطين مختلفة. يجب إدخال كل نسخة قبل إعادة تحويل المتعاقبة، أو بدلا من ذلك، من خلال backcrossing التحويلات واحدة 1. وهذا ينطوي على الاستنساخ إضافية، ويقتصر تلو الآخر علامة التعريب في محطة.
طريقة أخرى لتوطين البروتين إلى مواقع متعددة من خلال الربط البديلة 2-5. وكتب الحمض النووي الريبي من جين واحد، ولكن يتم معالجتها نسخ مختلفة من النص بشكل مختلف، وغالبا في أكثر من طريقة واحدة لكل خلية. هذا يمكن أن يؤدي في أكثر من الحمض النووي الريبي رسول في الخلية نسخها من جين واحد. هذه MESSENGE مختلفةيمكن الرنا ص ترميز لالإسوية مختلفة من نفس البروتين، أو في حالة وجود انزياح الإطار، وهو بروتين مختلفة تماما. على الرغم من أن وصفت الربط البديلة في الأدب لسنوات عديدة، وفقط يتم توضيح آليات العمل والجهات المانحة الحفظ ولصق مواقع مستقبلات مؤخرا 6. كما ويجري وصف هذه المواقع على نحو أفضل، فإنها تفتح فرصا للهندسة.
وتواجه المهندسين الأيض النباتية مع التحدي عند التعبير عن بروتين في العضيات متعددة. لبروتين الذي هو أن تكون مترجمة إلى عضية أكثر من واحد، ويجب على مهندس استنساخ نفس الجين عدة مرات، مع كل تسلسل إشارة منفصلة توجيهها إلى عضية من الفائدة. لجين واحد في ثلاثة العضيات، وهذا هو ببساطة ثلاثة جينات. ولكن لالأيضية مسار ستة الجينات، وهذا يوسع إلى 18 الجينات، وهو جهد كبير الاستنساخ. الجمع بين متواليات توطين متعددة في، علامة جين واحد تقسم بدلا من ذلك،ificantly يقلل من هذا الجهد. على سبيل المثال، إعادة هندسة التنفس الضوئي والتوليف isoprenoid 7،8 9،10 تشمل كلا من البلاستيدات الخضراء وperoxisomes. في حالتنا نحن استغل مواقع لصق كما لوحظ في نظام thaliana نبات الأرابيدوبسيس الطبيعية الموصوفة سابقا 6. نحن أعيد تصميمه بعقلانية تسلسل مرنا مغادرة مواقع لصق الطبيعية وحدها، ولكن وضعت تسلسل التي من شأنها أن ترميز-بلاستيدات الخضراء أو العلامات التي تستهدف بيروكسية ضمن الإنترونات تقسم بدلا من ذلك (الشكل 1). البروتين المعبر عنه قد أو قد لا يكون علامة، اعتمادا على ما إذا كان رفعه ما قبل مرنا أن المشفرة على أنها إنترون (أرقام 1G و1H). لمزيد من المعلومات حول تصميم بنيات قدمت في هذا العمل، الرجاء مراجعة المقالة رفيق 11.
لأن هذا لا يزال هناك جهد كبير الاستنساخ، جيبسون التجمع، طريقة جديدة لاستنساخ بنيات الحمض النووي، هو شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي في البناء. طريقة جيبسون يمكن استخدامها لأي تسلسل، بغض النظر عن المواقع تقييد (الشكل 2) 12-14. مزيج محددة من الانزيمات يسمح لخطوة واحدة، والتجمع متساوي الحرارة. في هذه الطريقة، فقد تم تصميم عدة أجزاء الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل خطي بحيث يكون تسلسل تداخل ~ 50 نقطة. جيبسون التجمع مزيج إنزيم يساعد على هضم جزئيا أجزاء الحمض النووي الخطية، وفضح خيوط واحدة من متواليات مثلي. وهذه التسلسلات واحد الذين تقطعت بهم السبل جزئية إعادة صلب في خليط التفاعل، مما أدى إلى، خطوة واحدة، تسلسل مستقلة، خالية من ربط رد فعل subcloning السريع.
يصف هذا العمل 1) تصميم عقلاني يبني تقسم بدلا من ذلك للتعبير في البلاستيدات الخضراء النباتية، peroxisomes، وcytosols، 2) الاستنساخ باستخدام طريقة خالية من ربط جديدة من جيبسون التجمع، 3) إيصالها إلى خلايا نبات التبغ مع جين غون، و 4) النتائج التي تظهر استهداف عضية، كما لوحظ مع GFPومتحد البؤر المجهري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تصميم متواليات تقسم بدلا من ذلك لاستهداف متعددة العضيم
- تحديد المواقع للتعبير البروتين النهائي. لهذا العمل، وتكون الفائدة في استهداف بلاستيدات الخضراء، بيروكسية، والعصارة الخلوية.
- استخدام الأدب لتحديد البروتين والحمض النووي المعروف تسلسل لاستهداف البروتينات لعضيات من الفائدة. في هذه الحالة تستهدف بلاستيدات الخضراء تسلسل من نبات الأرابيدوبسيس thaliana-L isoaspartate ناقلة الميثيل 6،15، وكانوا مصممين على بيروكسية استهداف تسلسل من نبات الأرابيدوبسيس thaliana مثل transthyretin S-آلانتوين سينسيز 16،17.
- تحديد نظام الربط البديلة، التي ينبغي أن تستهدف البروتينات التي تهم العضيات الصحيح. لهذا العمل، لصق المواقع كما لوحظ في نظام نبات الأرابيدوبسيس الطبيعية 6. وأعيد تصميم تسلسل مرنا مغادرة مواقع لصق الطبيعية، ولكن وضعت متواليات ترميز بلاستيدات الخضراء أو peroxisبه ضمن الإنترونات تقسم بدلا من ذلك (الشكل 1) لى بعد استهداف.
2. الجمعية جيبسون من أجزاء الحمض النووي
انظر أيضا الشكل 2.
يعتمد أسلوب التجميع جيبسون على عمل العديد من الأنزيمات في مزيج مسبقة الصنع ل1) هضم جزئيا نهايات مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي لجعل خيوط واحد و 2) يصلب أزواج قاعدة مجانية من أجزاء الحمض النووي المجاورة. وهذا يسمح لاستنساخ شظايا الحمض النووي من دون قيود من المواقع قيود.
- اختيار أمر لعناصر في بناء الحمض النووي البلازميد. كمثال TriTag-1 لديه عناصر: أ) ناقل البلازميد (المسام، وتحتوي على بناء GFP معروفة للعمل في المصانع، علامة المقاومة الكانامايسين، وأصول النسخ المتماثل لكولاي والأجرعية المورمة المضيفين)، ب) تسلسل المروج، (P ENTCUP2، أظهرت أن تكون التأسيسي في النباتات)، ج) بلاستيدات الخضراء استهداف تسلسل (CTS)، ج) بيروكسية استهداف تسلسل (PTS)، ود) سلسلة من المواقع لصق كما هو موضح سابقا 6.
- تصميم قاعدة للقاعدة في بناء مع سيليكون وتصميم البرمجيات. القرد هو مفتوح المصدر حزمة مجانية مفيدة لهذا العمل.
ملاحظة: TriTag-1، لديه من أجل: ناقلات البلازميد، والمروج، ATG، موقع لصق المانحة، تسلسل الهدف بلاستيدات الخضراء، موقع المانحة لصق، موقع محايد، وصلة الموقع متقبل، تسلسل الهدف بيروكسية، لصق موقع متقبل، على النحو الوارد في GFP البلازميد ناقلات .- تصميم سيليكون في بناء الحمض النووي بحيث هناك تداخلا 50-BP بين كل قطعة عند الطلب الاشعال لPCR. فمن الممكن استخدام التداخل 50 نقطة أساس كما الاشعال: 25 نقطة كل اتجاه.
- ومن المؤكد أن تتبع أصل كل القطع التسلسل. هو على النحو التالي: البلازميد التي يمكن زراعتها وminiprepped؛ تسلسل الخطية التي يمكن استخدامها كقالب PCR؛ أو تسلسل التي سوف تحتاج إلى أن يكونتوليفها تجاريا؟ العديد من الشركات تقدم خدمات منخفضة التكلفة توليف الحمض النووي لشظايا <500 سنة مضت. في هذه الحالة، TriTag نفسها هي 437 سنة مضت، لذا كان من المفيد لأجل ذلك تجاريا.
- فإن أفضل النتائج تأتي إذا كانت جميع أجزاء هي PCR تضخيم وتنقيته من الحمض النووي القالب بهم. علامة المقاومة هي مكان جيد لتقسيم هذا الحمض النووي الكبيرة إلى اثنين من القوالب الصغيرة التي هي أكثر سهولة PCR تضخيمها.
- انزيم التقييد تقييد DpnI يقطع الحمض النووي ميثليته. إذا كان القالب PCR لminiprep من E. القولونية، والعلاج DpnI إزالة الحمض النووي القالب تلويث.
- تصميم سيليكون في بناء الحمض النووي بحيث هناك تداخلا 50-BP بين كل قطعة عند الطلب الاشعال لPCR. فمن الممكن استخدام التداخل 50 نقطة أساس كما الاشعال: 25 نقطة كل اتجاه.
- تنقية كل تسلسل الحمض النووي بشكل منفصل وأزل في الماء، أو TE العازلة EB.
- ناقلات المسام جزء 1، ~ 3،000 سنة مضت (الأسهم الخضراء). PCR تضخيمها وDpnI المعالجة.
- ناقلات المسام جزء 2، ~ 3،000 سنة مضت (الأسهم السوداء). PCR تضخيمها وDpnI المعالجة.
- TriTag إدراج، 437 سنة مضت (الأسهم الزرقاء). أمر تجاريا. Resuspend في DDH 2 O.
- P ENTCUP المروج، ~ 750 شركة بريتيش بتروليوم (الأسهم البرتقالية). PCR تضخيم وDpnI المعالجة.
- قياس تركيزات كل من قطع الحمض النووي. تهدف ل150 نانوغرام / ميكرولتر من القطع النواقل.
- اتخاذ قسامة من الجمعية مزيج جيبسون من الفريزر وذوبان الجليد على الجليد. هذا هو متاحة تجاريا، ولكن أيضا بسيطة لجعل في مختبر 12-14.
- هناك نوعان من الخطوات لهذه الوصفة: مزيج الرئيسي ل5X لزج و 15 ميكرولتر رد فعل بحجم مأخوذة 1.33x. مزيج الرئيسي 5X يحتوي على: 3 مل 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 300 ميكرولتر 1 M MgCl 2، 600 ميكرولتر 10 ملي من كل dNTP، 300 ميكرولتر 1 M DTT، 1.5 غرام PEG-8000، 20 ملغ NAD، وده 2 O إلى 6 مل. إعداد 320 ميكرولتر مأخوذة (18) وتجميد جميع ولكن واحدة في -20 درجة مئوية. فإن الحل يكون لزج جدا. تسمية هذه "5X الأيسوثرم العازلة"
- إلى واحد المتبقية (320 ميكرولتر)، إضافة 1.2 ميكرولتر T5 نوكلياز خارجية، و 20 ميكرولتر Phusion عالية من الاستثمارات الخارجية المباشرةelity البلمرة DNA، 160 ميكرولتر الحمض النووي طق يغاز و 700 ميكرولتر DDH 2 O. إعداد 15 ميكرولتر مأخوذة (~ 80) على الجليد في أنابيب PCR وتخزينها في -20 درجة مئوية.
- تحديد وحدات التخزين لكميات متساوي المولية كل من شظايا. هناك عدد قليل من الآلات الحاسبة على الانترنت، بما في ذلك Gibthon.org. ينبغي أن يكون هناك ما مجموعه 5 ميكرولتر من كل قطعة الحمض النووي. إضافتها إلى ميكرولتر 15 جيبسون مزيج قسامة. إذا كان هذا يتطلب كميات صغيرة جدا لماصة، ويخفف من شظايا الحمض النووي و / أو استخدام قسامة أكثر من واحد.
- لا تنسى أن تعد السيطرة على الحمض النووي ناقلات وحدها (على سبيل المثال الجزء الحمض النووي الذي يحتوي على مقاومة المضادات الحيوية علامة) وجعل ما يصل حجم بالماء.
- احتضان الأنابيب في cycler الحرارية في 50-55 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة. استبدال على الجليد وتحول إلى E. القولونية عبر حرارة صدمة الخلايا المختصة كيميائيا. لا تستخدم الخلايا electrocompetent. تركيز الملح عالية وتركيز الحمض النووي منخفضة نسبياقد يسبب الخلايا لقوس.
- تطبيق كل ميكرولتر 20 إلى إعداد التجارية من 200 ميكرولتر الكالسيوم كلوريد المختصة E. القولونية.
احتضان على الجليد 30 دقيقة و 60 ثانية صدمة الحرارة في 42 درجة مئوية - العودة إلى الجليد 2 دقيقة، وتطبيق 750 ميكرولتر SOC أو LB المتوسطة واستعادة تهتز في أنبوب microcentrifuge 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. لوحة الخليط والتخفيفات المناسبة على LB + اساسه (أو غيرها من المضادات الحيوية المناسبة). وهذا قد يؤدي إلى ارتفاع الخلفية (وعدد أكبر من الأحداث إعادة التركيب غير المستهدفة) من الاستنساخ القائم على ربط التقليدية، ولكن الأمر يستحق أن يحجب حوالي 10 المستعمرات.
- تطبيق كل ميكرولتر 20 إلى إعداد التجارية من 200 ميكرولتر الكالسيوم كلوريد المختصة E. القولونية.
- تأكيد استنساخ عبر تسلسل وتخزين قسامة في -80 ° C
3. Biolistic ترنسفكأيشن من التبغ مع جين غون
هذا هو الاسلوب الذي أنشئ في إن الرب 18،19. يتم وصف الخطوات الرئيسية والاختلافات أدناه.
- تنمو 50-100 مل E. شاركلى أو 200 مل الأجرعية. ثقافة الإعدادية ماكسي. وهناك تركيز من حوالي 1،500 نانوغرام / ميكرولتر مطلوب للمتابعة.
- إعداد رصاصات بندقية الجينات كما هو موضح سابقا. تحميلها في جين غون.
- لترنسفكأيشن من نيكوتيانا benthamiana التبغ الأنسجة ورقة البشرة، واختيار ورقة كبيرة بالقرب من قاعدة النبات لمدة 3 أشهر من العمر. قطع عليه بعناية ووضعه الجانب الأسفل إلى الأعلى على مناشف ورقية مبللة في طبق بتري 15 سم.
- تعيين والضغط لجين غون إلى 200-250 رطل.
- تهدف بعناية جين غون بين أضلاعه على الجانب السفلي من ورقة، حوالي 3-5 سم فوق ذلك. الافراج عن السلامة وتسليم الجزيئات إلى ورقة. ويمكن استخدام كل رصاصة مرتين في نفس الموقع على ورقة. إذا كان ينفجر ورقة، وتجاهل بدء أوراق جديدة هناك بعض التباين في ورقة وصلابة بسبب ظروف النمو مثل العمر، والرطوبة وغيرها للحصول على 12 سم، وأوراق، ونتوقع أن تناسب حوالي 6 طلقات.
- تخزين ورقة، مع تغطية الجزء العلوي منطبق بتري لمدة 2-3 أيام في ضوء انخفاض على مقاعد البدلاء.
- دراسة ورقة في المجهر تشريح مجهزة مضان الأشعة فوق البنفسجية، والبحث عن الخلايا الفردية معربا عن GFP. تشريح 5-10 ملم أقسام ورقة.
- يغرق ورقة في شريحة المجهر بئر عميقة تحت ~ 200 ميكرولتر 0.1٪ تريتون X-100. المنظفات يساعد على منع فقاعات الهواء من تشكيل على السطح، وعميق شريحة المجهر بشكل جيد يسمح لمنطقة التصوير الأنسجة أكبر.
4. متحد البؤر المجهري لأنسجة Transfected
هذه التعليمات تختلف عن كل صك، ولذلك فمن الضروري الحصول على التدريب المناسب.
- للتجارب الكشف عن مضان، تعيين الليزر الإثارة إلى 489 نانومتر، وتعيين كشف مضخم إلى 500-569 نانومتر لمضان GFP و630-700 نانومتر لالكلوروفيل لصناعة السيارات في مضان. الصورة باستخدام الخلايا هدف المياه الغمر 40X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كان جهد التصميم نتيجة لتخطيط كبير. رواية لهذا المشروع هو استخدام الربط بديلة لإنشاء ما قبل مرنا التي يتم ترجمتها إلى البروتينات وأعرب تفاضلي. يتم التعبير عن هذه البروتينات في العضيات المختلفة، في هذه الحالة بلاستيدات الخضراء، بيروكسية و / أو العصارة الخلوية. نحن تكييفها الجينات نبات الأرابيدوبسيس الطبيعية التي تقسم بدلا من 6، ووضعها المعروف بلاستيدات الخضراء 6 و 17 بيروكسية استهداف تسلسل في الإكسونات البديل (TriTag-1 وTriTag-2). TriTag-3 يتكون من إشارة بيروكسية جزءا لا يتجزأ من داخل المنطقة منخفضة تعقيد تسلسل بلاستيدات الخضراء. وضعت هذه في الإطار مع GFP (الشكل 1).
وبالتالي فإن البلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة الواردة عدة عناصر: الأصلي نظام الربط بديلة من الجين PIMT2 6، بلاستيدات الخضراء وبيروكسية استهداف متواليات، GFP، والعمود الفقري البلازميد. لأن كل لديه المواصفات جداIFIC المطلوبة تسلسل، وهي طريقة تسلسل مستقلة أمر ضروري. جيبسون التجمع بروتوكول 12،13 يمكن استخدامها على أي تسلسل طالما تم تصميم الأجزاء المكونة مع تشابه تسلسل لبعضها البعض، والتي لا تتضمن متواليات تكرار. باختصار، هي التي شيدت شظايا الحمض النووي الخطي (إما عن طريق PCR التضخيم، والتوليف التجارية، أو هضم البلازميد مسبقة الصنع) أن لديهم مثل هذه ~ 50 نقطة من تسلسل مثلي تداخل (الشكل 2). يتم الجمع بين كميات متساوي المولية كل من شظايا الحمض النووي في أنبوب واحد يحتوي على مزيج التجمع جيبسون، حضنت في 50 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، وتحويلها إلى E. القولونية. وأكد البلازميدات الناتجة عن بروتوكول التجمع جيبسون بواسطة سانجر التسلسل.
في هذه الدراسة تم مقارنة GFP يبني استهداف ثلاثة عضية مختلفة لGFP معلم وGFP الموسومة Rubisco. تم استخدام المجهر متحد البؤر مضان للكشف عن GFP في الاشتراكيةngle الخلايا تحولت عابر. في التجارب السيطرة، فقد ارتبط التعبير عابرة وحظ أن البلاستيدات الخضراء (التي يسهل التعرف عليها من قبل تألق ذاتي الحمراء الكلوروفيل)، نوى (عضية الكبيرة التي ليس لديها بلاستيدات الخضراء واحد فقط لكل خلية)، و / أو العضيات الصغيرة يعتقد أن peroxisomes. تم مضافين الخضراء (GFP) والأحمر (الكلوروفيل تألق ذاتي) قنوات لدراسة توطين الخلايا (الشكل 3). للاطلاع على مناقشة أكثر اكتمالا من هذه النتائج، يرجى الاطلاع على المادة 11 رفيق.
كما هو متوقع، في جميع بنيات استهداف مزدوج ثلاثة، لوحظ GFP في البلاستيدات الخضراء (الشكل 4) في الميكروسكوب متحد البؤر تراكب. TriTag-1-2 وTriTag هدف GFP أيضا إلى العصارة الخلوية وعضية صغيرة يعتقد أنها بيروكسية (أرقام 4A و 4B، على التوالي). TriTag-3 أهداف فقط GFP إلى بلاستيدات الخضراء وبيروكسية، ولكن ليسالعصارة الخلوية (الشكل 4C). وتخطيطي ملخص لنتائج (الشكل 5).
الشكل 1. تصميم بنيات الربط البديلة لالتفاضلية التعبير عضية في نيكوتيانا benthamiana. لصق الرسوم البيانية من (أ) TriTag-1، (ب) TriTag-2، و (ج) TriTag-3 متواليات تظهر عدم استهداف (الرمادي)، بلاستيدات الخضراء تسلسل استهداف (الضوء الأخضر)، وتسلسل استهداف بيروكسية (برتقالي)، والترميز تسلسل GFP المستخدمة في التجارب التعبير عابرة. TriTag-1-2 وTriTag تتكون من بنيات الربط البديلة؛ TriTag-3 يتكون من إشارة بيروكسية جزءا لا يتجزأ من داخل المنطقة منخفضة تعقيد تسلسل بلاستيدات الخضراء. تسلسل
الشكل 2 التخطيطي لجيبسون التجمع:. طريقة جديدة لتجميع شظايا الحمض النووي تداخل الأسلوب جيبسون التجمع من أجل بناء البلازميد 12،13 تحل بسرعة محل التقليدية الاستنساخ تقييد للربط في كثير من المختبرات. أساسا، يمكن للمرء أن تصميم بناء في سيليكون والذي يحتوي على الحمض النووي من الفائدة تماما، ويتألف من المنتجات PCR تضخيمها من مصادر مختلفة. تصميم الاشعال التي هي مكملة لبعضها البعض، وPCR-تضخيم كل جزء مع الاشعال الملونة. إضافة كافة قطع في أنبوب واحد مع مزيج الانزيم، وتحويل E. الخلايا المختصة القولونية. انقر هنا لمشاهدة لarger الصورة.
الرقم 3. العلاجات تحكم قصفت في N. benthamiana خلايا ورقة البشرة. (ميلان) GFP معلم (أ) قناة الأخضر. يتم التعبير عن GFP معلم في النواة وحول محيط الخلية، والمقابلة لالعصارة الخلوية، ولكن ليس فجوة. (ب) البلاستيدات الخضراء الأحمر تشير إلى تألق ذاتي من الكلوروفيل. (ج) تراكب. في هذا البناء مضان لوحظ في النواة والعصارة الخلوية فقط، ولكن ليس البلاستيدات الخضراء. (DF) الموسومة الجبيلة اليخضور السيطرة GFP. (د) قناة الأخضر. يتم التعبير عن GFP في العضيات كبيرة، مع خلية على النحو المبين. (ه) البلاستيدات الخضراء الأحمر تشير إلى تألق ذاتي من الكلورophyll. (و) تراكب. في هذه الحالة لوحظ البلاستيدات الخضراء الصفراء، مشيرا إلى أن GFP (الخضراء) والتي تستهدف إلى بلاستيدات الخضراء. طبع بإذن 11. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 4. ثلاثي تاج 1، 2، 3 GFP الموسومة دمج الصور. (أ) ثلاثي Tag1. في هذه الحالة لوحظ أطرافها بلاستيدات الخضراء الصفراء، مشيرا إلى أن GFP يستهدف إلى بلاستيدات الخضراء. ويلاحظ أيضا GFP في العصارة الخلوية وكذلك العضيات منقط الصغيرة التي قد تكون peroxisomes. (ب) ثلاثي Tag2. في هذه الحالة لوحظ أطرافها بلاستيدات الخضراء الصفراء، مشيرا إلى أن GFP وتستهدف ج hloroplast. ويلاحظ أيضا GFP في العصارة الخلوية وكذلك العضيات منقط الصغيرة التي قد تكون peroxisomes. (ج) ثلاثي Tag3. في هذه الحالة لوحظ البلاستيدات الخضراء الصفراء، وكذلك العضيات منقط الصغيرة التي قد تكون peroxisomes. ولكن لا GFP لوحظ في العصارة الخلوية. طبع بإذن 11. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرقم 5. المقصورات خلية البشرة أوراق التبغ التقليدية. هنا تظهر أحجامها النسبية ومواقع داخل الخلية، ومستويات التعبير النسبية لوحظ من خلال الفحص المجهري متحد البؤر. طبع بإذن 11./ 51234/51234fig5highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة، تم وصفها استراتيجيات بسيطة لإضفاء الطابع المحلي على البروتين المعدلة وراثيا واحد لمقصورات الخلوية متعددة في النباتات. كان الهدف لتصميم بناء من شأنه أن التعبير عن جين واحد في عضية أكثر من واحد في نيكوتيانا benthamiana. وتشمل استراتيجيات التصميم الرشيد للبنيات الحمض النووي القائم على GFP، جيبسون التجمع، والتسليم من البلازميدات إلى الخلايا ورقة مع جين غون، ومراقبة النتائج مع المجهري متحد البؤر.
وقد صممت ثلاثة قصيرة، والعلامات N-محطة مختلفة للبلاستيدات الخضراء في وقت واحد، وبيروكسية العصارة الخلوية تستهدف 11. وقد صممت هذه "TriTags" من خلال الجمع بين السلطات الوطنية المعينة التي تحدث بشكل طبيعي ترميز mRNAs وتقسم بدلا من أن يوجه البروتينات المشفرة إما إلى بلاستيدات الخضراء بالإضافة إلى السيتوبلازم 6 أو بيروكسية بالإضافة إلى السيتوبلازم 17. TriTag-3 لا تعتمد على الربط البديلة ويتكون من سلسلة تستهدف بلاستيدات فيه غتم استبدال جزء غير منظم turally مع تسلسل استهداف peroxisomal 15،17. وظيفة TriTags في الجسم الحي لاستهداف GFP في نيكوتيانا benthamiana نبات خلايا البشرة (الشكل 5).
أظهر الميكروسكوب متحد البؤر التي TriTag-1-2 وTriTag الهدف GFP إلى بلاستيدات الخضراء، بيروكسية، والعصارة الخلوية بشكل فعال، ولكن مع أفضلية للبلاستيدات الخضراء وبيروكسية، على التوالي (أرقام 4A و 4B). TriTag-3 أهداف فقط GFP إلى بلاستيدات الخضراء وبيروكسية، ولكن ليس العصارة الخلوية (الشكل 4C). في كل شيء، هذه العلامات قد تقليل الوقت وإنفاق الموارد على الاستنساخ لهندسة التمثيل الغذائي النباتي، وتحديدا لأولئك الذين يحتاجون التعبير محددة في البلاستيدات الخضراء وperoxisomes.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
وشيدت TriTags كما هي ثابتة إلى حد ما في الوقت الحالي. ومع ذلك، فإن underlyinز التكنولوجيا، والربط البديلة للسماح ترجمة الكلمات بمواقع معينة مختلفة، غير مرنة. يمكن تغيير علامات بلاستيدات الخضراء و / أو بيروكسية القائمة المحددة لأي عضية أخرى، سواء كان ذلك المسار إفراز، والحبيبات الخيطية، وعلامة الإقامة ER، فجوة. هذه يمكن أيضا أن تكون مجتمعة مع المروجين الأنسجة محددة، على سبيل المثال للبذور، والزهور، والجذور، ويترك، وينبع، الخ
لمشروع مثل هذا واحد، وطريقة جيبسون التجمع 12-14 لاستنساخ يبني هو المثل الاعلى. هو بسيط، وأداة قوية لsubclone أي تسلسل من دون قيود من المواقع قيود. في ردود الفعل من خطوة واحدة، جيبسون التجمع إنشاؤها بسرعة يبني والضوابط مع الحد الأدنى من الجهد في مجال الاستنساخ. تقنية التجميع جيبسون هو ما يقرب من تعديل بلا حدود عن أي التسلسل المطلوب، طالما أن تسلسل قالب يمكن تضخيم PCR. على الرغم من أن في هذا المثال تم إظهار جيبسون التجمع مع البلازميد هضمها، PCR-تضخيم ناقلات يميل للعمل بشكل أفضل من استخدام miniprep هضمها.
الجينات بندقية هو طريقة سريعة وفعالة لترنسفكأيشن عابرة من الخلايا، كما أنشئت من قبل هذه المجلة 18،19. نيكوتيانا benthamiana له، خلايا كبيرة رقة lobate البشرة، والتي هي على حد سواء مثالية لترنسفكأيشن مع بندقية الجينات، ولكن أيضا ل مراقبة مع المجهري متحد البؤر. راسخة بروتوكول لصنع الرصاص. وقد استخدم الذهب باعتباره microcarrier في معظم التجارب في الأدب حتى الآن، ولكن تتوفر مؤخرا microcarriers التنغستن بتكلفة منخفضة.
القيود المفروضة على تقنيات
أحد أوجه القصور الرئيسية في طريقة جيبسون هو وجود تسلسل المتكررة: كلما طالت المنطقة هو نتيجة تداخل منتجات جانبية أقل. هضم منتجات PCR مع DpnI يجب إزالة تلوث قوالب البلازميد؛ التي عادة ما تكون مصدر الجانبالمنتجات. الانزيمات هضم شظايا الحمض النووي DNA من الذين تقطعت بهم السبل المزدوج تقطعت بهم السبل في واحد. وجود تسلسل المتكررة بالقرب من نهايات (~ 1 كيلو بايت) من شظايا الحمض النووي يزيد بشكل كبير من إمكانية إعادة التركيب غير السليم. كذلك، يكرر ضمن تسلسل تشكل أيضا وجود قيود: أنها ليست معروفة جيدا، ويصعب السيطرة عليها مدى دعم يمضغ T5 نوكلياز خارجية الحمض النووي المفرد الذين تقطعت بهم السبل. وخفف من النشاط السريع للنوكلياز خارجية من قبل ارتفاع درجة الحرارة رد فعل (50-55 درجة مئوية) في نهاية المطاف تغيير طبيعة الإنزيم، وخفض اللزوجة الحركة الشاملة في الحل. لمزيد من صقل للخطوات التفاعل، وتسلسل وربط الاستنساخ المستقلة (SLIC) ويفضل 20.
وجود قيود كبيرة للتقنية بندقية الجين هو أنه ينتج فقط بناء على أمر من 1-10 خلايا تتحول عابر في حال اطلاق النار.
أهمية فيما يتعلق بأساليب موجود
تقنية التجميع جيبسون تتمتع التبني السريع لسهولة والمرونة، والقدرة على التكيف. ذلك هو بروتوكول أسرع من التقليدية الاستنساخ قيود / ربط، و لا يتطلب متواليات محددة مثل تلك المطلوبة لتقييد عملية الهضم. فإنه لا يقتصر على اثنين أو ثلاثة أجزاء ليكون معاد؛ وقد أظهرت الباحثون الأصلي بنجاح لمدة تصل إلى 10 أجزاء، ولكن مع كفاءة محدودة. بالنسبة لكثير من الباحثين جيبسون التجمع يجعل لعدد أكبر من الحيوانات المستنسخة إيجابية.
لمزيد من transformants مع تقنيات Biolistic، أو لخلق نسيج الكالس تحولت، ينبغي أن تستخدم استخدام جهاز biolistic على غرار مجلس الوزراء (على سبيل المثال BIORAD PDS-1000). طريقة بديلة هي الأجرعية التسلل.
تطبيقات المستقبل
جيبسون التجمع يسمح مجموعات أكبر وأكبر من الحمض النووي ليتم تجميعها، لالنقطة التي لم يحترم أقصى حد. وقد استخدم الكتاب الأصلي لتجميع عدة مئات من kilobases DNA 13.
القدرة على استهداف انتقائي العضيات متعددة مع بناء الوراثية واحد لديه القدرة على تقليل عدد الجينات التي تحتاج إلى أن تتحول. تسليم شظايا الحمض النووي أكبر وأكبر (وبالتالي المسارات الأيضية أكبر) هو الهدف على المدى القريب. وقد تم تسليم مسارات Isoprenoid إلى بلاستيدات الخضراء بالطرق biolistic؛ مجموعات الجينات الأخرى مثل مسارات تثبيت الكربون البديلة التي تلوح في الأفق.
خطوات حاسمة في إطار البروتوكول.
في جيبسون التجمع، وتأكد من أن تسلسل قالب لم يكن لديك التماثل مع بعضهم البعض إلا في المواقع المستهدفة إعادة التركيب.
في التحول biolistic من النباتات نيكوتيانا، وتوخي الحذر للحفاظ على بندقية الجينات حوالي 10-15 سم فوق الأوراق والثاني مواصلة الضغط الهليوم في 200-250 رطل. أقرب من ذلك، فإن ورقة هشة تنفجر، وأبعد من ذلك فإنها لن تتحول بشكل جيد. بعد يومين من ترنسفكأيشن يجب أن تظهر كدمة على ورقة إذا تم تحويله بشكل صحيح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر جين شين من مستشفى ماساتشوستس العام للتبرع سخي من الشتلات نيكوتيانا benthamiana. ساعد جين بوش لنا إلى حد كبير في تقديم المشورة في زراعة النباتات وإنشاء منطقة غرفة النمو. عرضت توم فيرانتي من معهد ويس مساعدة حاسمة مع المجهري متحد البؤر. فإن الكتاب أود أن أشكر بصفة خاصة دون انجبير من مستشفى بوسطن للأطفال ومعهد لويس التبرع السخي من جين غون واللوازم المرتبطة بها. وقدمت التمويل لهذا المشروع من خلال اتفاقية تعاون مع وزارة الطاقة وكالة مشاريع البحوث المتقدمة (ARPA-E جائزة # DE-000079) لنظام تقييم الأداء، JCW، وأطباء العالم، ومن خلال Chimerion التكنولوجيا الحيوية، وشركة لMJV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotide primers | IDT | (custom) | Design specifically for construct |
| GeneBlocks | IDT | (custom) | 500 bp oligonucleotides |
| ApE software | U Utah | (download) | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | Used to purify PCR products |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid |
| Phusion Master Mix with GC Buffer | NEB | M0532S | Used to PCR-amplify gene of interest |
| Gibson assembly reaction mix | NEB | E2611L | Master mix of the following 9 ingredients |
| 1 M Tris-HCl pH7.5 | Teknova | T1075 | Gibson assembly mix |
| 1 M MgCl2 | G Biosiences | 82023-086 | Gibson assembly mix |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | Gibson assembly mix |
| 1 M DTT | Fermentas | R0861 | Gibson assembly mix |
| PEG-8000 | Affymetrix | 19966 | Gibson assembly mix |
| NAD | Applichem | A1124,0005 | Gibson assembly mix |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | Gibson assembly mix |
| Phusion polymerase | NEB | F530S | Gibson assembly mix |
| Taq DNA ligase | NEB | M0208L | Gibson assembly mix |
| Gibthon.org | Website to simplify calculations | ||
| Plasmid PLUS Maxi kit | Qiagen | 12963 | Used to prepare DNA for gene gun bullets |
| Gene Gun system | BioRad | 165-2451 | Includes all parts necessary |
| Nicotania benthamiana | (n/a) | (n/a) | Gift of Jen Sheen, MGH |
| Confocal microscope | Leica | SP5 X MP | Imaging of resultant cells |
| Deep well slides | Electron Microscopy Sciences | 71561-01 | Used for confocal imaging |
| A Plasmid Editor (ApE) | University of Utah | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape | |
| Gibthon:Ligation calculator | http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/ |
References
- Que, Q., et al. Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities. GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).
- Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements. Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).
- Hickey, S. F., et al. Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon. Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).
- Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. Alternative splicing in plants - coming of age. Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).
- Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).
- Dinkins, R. D., et al. Changing transcriptional initiation sites and alternative 5'- and 3'-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).
- Kebeish, R., et al. Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana. Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).
- Maier, A., et al. Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement. Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).
- Kumar, S., et al. Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts. Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).
- Sapir-Mir, M., et al. Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes. Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).
- Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5' mRNA tags. Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Lowenson, J. D., Clarke, S. Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis. The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).
- Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).
- Reumann, S., et al. Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms. The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Hollender, C. A., Liu, Z. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene. (40), (2010).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
