Summary
هنا، نحن تصف البروتوكول استنادا إلى إعادة برمجة جينية للخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) نحو توليد السكان متجانسة من الأسلاف العضلات والهيكل العظمي أنه في ظل ظروف ثقافة متساهلة تشكيل مجموعات ثلاثية الأبعاد من myofibers مقلص (myospheres)، والتي تلخص السمات البيولوجية البشرية عضلات الهيكل العظمي.
Abstract
جيل من السكان متجانسة وفيرة من خلايا عضلات الهيكل العظمي من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) هو شرط لالعلاجات المستندة إلى الخلايا وعن "مرض في طبق" نموذج من الأمراض العصبية والعضلية الإنسان. عقبات رئيسية، مثل انخفاض وفرة وتجانس السكان من الاهتمام، فضلا عن عدم وجود بروتوكولات لتشكيل هياكل مقلص ثلاثي الأبعاد، وحدت من تطبيقات الخلايا الجذعية لعلاج الاضطرابات العصبية والعضلية. لقد قمنا بتصميم البروتوكول الذي يتغلب على هذه الحدود من قبل مقدمة خارج الرحم من العوامل المحددة في hESCs - تحديد العضلات عامل MyoD وSWI / الجبهة الوطنية الصومالية لونين إعادة عرض المعقدة BAF60C عنصر - التي هي قادرة على إعادة برمجة hESCs إلى خلايا العضلات والهيكل العظمي. نحن هنا وصف أنشأ بروتوكول لتوليد myoblasts المستمدة HESC وتعزيز المجموعات في الهياكل ثلاثي الأبعاد المنمنمة (myospheres) التي تحاكي وظيفيا عضلات الهيكل العظمي المنمنمة 7
Introduction
بسبب قدرتها الفريدة على تجديد الذات مع الحفاظ على تعدد القدرات، وتعتبر الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) مصدرا لا يقدر بثمن في مجال الطب التجديدي. جيل الخلايا الجذعية إعادة تعمير بوساطة العضلات المريضة والخلايا الجذعية المحفزة أو HESC يسببها (التوجيهية) مشتقة من عضلات الهيكل العظمي لفي المختبر النمذجة المرض هي الأهداف الرئيسية من الدراسات التي تهدف إلى تحديد وتوضيح العلاجات التسبب في الكثير من الأمراض العصبية والعضلية. ومع ذلك، فقد تم الطعن هذه الدراسات من قبل المقاومة من hESCs تحويلها إلى خلايا عضلات الهيكل العظمي وقلة المعلومات بشأن تنظيم الجزيئي للHESC-الالتزام تجاه تكون العضل الهيكل العظمي. في الواقع، وكشف المحاولات السابقة لتوليد الأسلاف العضلات والهيكل العظمي من hESCs ذلك فحسب الجسم مضغي الشكل السلالات (EB) مشتقة أو خلايا اللحمة المتوسطة هي المختصة لتفعيل الهيكل العظمي تكون العضل التالية التعبير خارج الرحم لتفعيل النسخي (على سبيل المثالPax3 أو Myf5) 1-3 أو عن طريق التعرض لظروف ثقافة معينة 4-5.
لقد أظهرنا سابقا أن المكون السويسري / الجبهة الوطنية الصومالية، BAF60C (المشفرة بواسطة SMARCD3)، هو عنصر أساسي من آلات النسخ التي يسمح التنشيط بوساطة MyoD من مواضع محددة العضلات 6. لقد اكتشفت مؤخرا أن غياب الانتقائي للBAF60C يضفي على hESCs المقاومة إلى تفعيل بوساطة MyoD من الهيكل العظمي تكون العضل 7 أن لوحظ ذلك في BAF60C معربا عن الخلايا الجسدية 8-10، وهي عملية يشار إلى تحويل عضلي كما. التعبير القسري للBAF60C تمكن MyoD لتفعيل الهيكل العظمي تكون العضل مباشرة في hESCs، بناء على الظروف ثقافة معينة، مع BAF60C وMyoD فرض توقيع جينية التي تلزم hESCs نحو النسب عضلي 7. من المذكرة، كشف تحليل البروتين السابقة عدم وجود انتقائية من BAF60C، بين مكونات SWI / الجبهة الوطنية الصومالية، في المجالس الاقتصادية والاجتماعية 11. استخدمنا هذه المعرفة لفرض الالتزام جينية من hESCs على النسب عضلي، مما يؤدي إلى توليد عدد سكانها متجانسة من myoblasts الهيكل العظمي التي يمكن تجميعها لتشكيل مقلص ثلاثية الأبعاد هياكل (myospheres) التي تحاكي وظيفيا عضلات الهيكل العظمي المنمنمة 7. في الواقع، لدينا وسيلة لتوليد الأسلاف العضلات والهيكل العظمي من hESCs يعتمد على التزام جينية من hESCs إلى النسب عضلي، والتي هي كامنة ظاهريا حتى تتعرض الخلايا إلى إشارات التمايز، مثل خلية التجميع والثقافة في التمايز المتوسطة (انظر بروتوكول معين). يسمح هذا استراتيجية التوسع في عدد السكان متجانسة من hESCs التي ترتكب epigenetically إلى نسب العضلات والهيكل العظمي ومناسبة لتشكيل myospheres مقلص ثلاثية الأبعاد التي ألخص النسيجية والخصائص الوظيفية للالهيكل العظميالعضلات. توفير myospheres أول دليل للعضلات المنمنمة استغلال ل"مرض في طبق" نموذجا للأمراض العضلات. عندما ولدت من مريض المستمدة iPSCs، هذه myospheres لديها القدرة على توضيح المسائل التنموية طويلة الأمد والتسبب في الأمراض النادرة، بالإضافة إلى تقديم إمكانيات هائلة كأداة لفحص إنتاجية عالية من المركبات العلاجية. نلاحظ أيضا أن واحدة قراءات الفوري لتحليل myosphere يمكن أن تقدمها المناعية على أقسام، كما هو موضح في البروتوكول إن الرب عن طريق جوميز وآخرون 12
Protocol
1. العدوى من hESCs
هذا البروتوكول يتطلب عالية lentiviruses عيار ترميز BAF60C وMyoD 13. تتوفر هذه التركيبات عند الطلب.
- توصيات قبل البدء
- من أجل ضمان الكفاءة العالية للعدوى، hESCs لوحة للعدوى في ظروف خالية من وحدة التغذية (الشكل 2A) للقضاء على المنافسين الخلوية خلال امتصاص الفيروسية. في الواقع، MEFs هي أسهل المعروف أن تصيب بالمقارنة مع hESCs والمختصة لتحويل بوساطة MyoD. وبالتالي، والقضاء على MEFs من ثقافات HESC يزيد من معدل الإصابة.
- فمن المستحسن أن يكون lentiviruses عيار عالية لضمان الكفاءة العالية للعدوى. وتناقش الخيارات لتحسين كفاءة العدوى في قسم "التحقق من العدوى".
- إعداد لوحات المغلفة matrigel بإضافة 1 مل من 1 ملغ / مل Matrigel في كل بئر وترك ما لا يقل عن 1 ساعة على RT (أو O / N مختومة في 4 درجات مئويةإذا أعدت قبل يوم واحد).
- الإجراء العدوى
- قبل يوم من العدوى
- إضافة حس الخليوي الاستنساخ والملحق الانتعاش في المتوسط في 1000 X التخفيف (2 ملي تركيز النهائي).
- اليوم 0 - العدوى مع BAF60C
ملاحظة: تنفيذ إصابة hESCs مع BAF60C أولا تليها العدوى مع MyoD.- فصل بئر من لوحة 6 جيدا من hESCs كما نمت المستعمرات 14 في تعليق خلية واحدة من قبل الحضانة مع 1 مل من TrypLE لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- نقل التعليق إلى أنبوب 15 مل، إضافة 9 مل من HESC المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1،200 دورة في الدقيقة.
- أثناء الطرد المركزي، وإعداد مزيج العدوى في أنبوب نظيفة بإضافة إلى 1 مل من mTeSR1، polybrene (6 ملغ / مل) و [هس] خلية الاستنساخ والاسترداد الملحق (2 ملم).
- إعادة تعليق بيليه الخلية (حوالي 5 × 10 5 -1 × 10 6 خلايا من واحد جكذلك onfluent من hESCs) مع 1 مل من مزيج من العدوى وعلى طبق من ذهب لوحة مرفق 6 جيدا منخفضة، مما يمنع الخلايا من التمسك البلاستيك.
- إضافة BAF60C-IRES-GFP الفيروس في 10 8 وزارة الداخلية واحتضان 3 ساعة في الحاضنة
- جمع التعليق الخلية التي تحتوي على فيروسات وتقسيم بالتساوي في بئرين المغلفة matrigel. ثم يضاف 2 مل من mTeSR1 + حس الخليوي الاستنساخ والاسترداد الملحق إلى كل بئر وترك O / N في الحاضنة.
- يوم 1
- إزالة بعناية المتوسطة التي تحتوي على الفيروس واستبدالها مع 2 مل من mTeSR1and حس الخليوي الاستنساخ والملحق الاسترداد. الخلايا ستبدأ التثاقل كما هو مبين في الشكل 2B.
- Day2 - العدوى مع MyoD
- قبل المتابعة التحقق من حالة مضان من الخلايا تحت المجهر مضان للتأكد من الحصول على كفاءة عالية من العدوى. إذا لم يكن كذلك، راجع قسم "التحقق تصيبأيون ".
- إذا وصلت إلى خلايا لا يقل عن 80٪ من التقاء، والمضي قدما على النحو التالي؛ إلا الانتظار ليوم إضافي قبل المتابعة.
- إزالة المتوسطة وإضافة 1 مل من كاشف TrypLE لفصل الخلايا. احتضان 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- كما كرر from1.2.2.2 صفه - مضيفا 1.2.2.6 فيروس MyoD في 10 8 وزارة الداخلية.
- يوم 3
- إزالة بعناية المتوسطة التي تحتوي على الفيروس واستبدالها مع 2 مل من mTeSR1and حس الخليوي الاستنساخ والملحق الاسترداد.
- MEFs على لوحة matrigel المغلفة لوحات في 2.5 × 10 5 / سم 2 لليوم التالي للسماح للإكثار من الخلايا المصابة.
- اليوم 4
- إزالة المتوسطة وإضافة 1 مل من كاشف TrypLE لفصل الخلايا. احتضان 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- نقل الخلايا في أنبوب 15 مل الصقر، إضافة 9 مل من HESC المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1،200 دورة في الدقيقة.
- Remove طاف واعادة تعليق في 6 مل من HESC المتوسط.
- إزالة المتوسطة من MEFs التي تحتوي على لوحة 6 جيدا وhESCs وحة في 01:02 نسبة الانقسام، والاستغناء 3 مل لكل MEFs المحتوية جيدا.
تلميح! عندما تصل المستعمرات التقاء، وبعض من الآبار الخلايا MyoD/BAF60C-infected يمكن تجميد في النيتروجين السائل بمثابة مخزون احتياطي. ويشمل تجميد المتوسطة 90٪ من KOSR و 10٪ DMSO زائد 2 ملي حس الخليوي الاستنساخ والملحق الاسترداد. الآبار المتبقية يمكن ثم تتعرض لبروتوكول التمايز - انظر أدناه لوصف. إذا كانت هناك حاجة أكثر من الخلايا لانتاج المزيد من myospheres، hESCs المصابة يمكن نشر كما يلي: - إزالة المتوسطة واحتضان مع 1 مل من 1 ملغ / مل كولاجيناز الرابع لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- إزالة كولاجيناز الرابع وإضافة 1 مل من HESC المتوسط.
- تحت المجهر تشريح كشط المستعمرات مع طرف 10 مل.
- جمع قطع من كولونيوفاق في أنبوب 15 مل، والسماح لالرواسب لمدة 3 دقائق. ثم إزالة طاف، resuspend في HESC المتوسطة وعلى لوحة MEFs لوحات باستخدام نسبة 01:04.
- قبل يوم من العدوى
- فحص العدوى
- في حين نشر الخلايا، فمن المستحسن لوحة الخلايا المصابة في نطاق أصغر لموسم الحصاد لتحليل الحمض النووي الريبي وإجراء تحليل التعبير البروتين المناعي من أجل التحقق من المؤشرات الحيوية التي تعكس الوضع البيولوجي الصحيح في كل مرحلة (انظر نتائج الممثل). لlentiviruses عيار عالية ينبغي أن تكون النسبة المئوية للخلايا المصابة المتوقع لا يقل عن 80٪.
- لضمان الكفاءة العالية، وناقلات lentiviral يمكن تعديلها، وإدخال علامة اختيار الفلورسنت و / أو المقاومة للمضادات الحيوية. لدينا البلازميد lentiviral معربا عن BAF60C أيضا يحمل GFP مضان.
- الفرز hESCs لعلامة فلوري. في حالة انخفاض كفاءة عدوى فمن المستحسن استخدام مضان لخلايا ctivated الفرز (FACS-الفرز) لتخصيب الخلايا معربا عن فيروس BAF60C ثم تصيب الخلايا مع عيار عالية فيروس MyoD.
- إضافة حس الخليوي الاستنساخ والملحق الانتعاش في المتوسط في اليوم قبل الفرز.
- يوم الفرز، فصل الخلايا عن طريق TrypLE (كما هو موضح في اليوم 0) وresuspend الخلايا في KO استبدال المصل بالإضافة إلى حس الخليوي الاستنساخ والاسترداد الملحق في نظام مراقبة الأصول الميدانية أنابيب.
- في نهاية الفرز، وجمع الخلايا في KO استبدال المصل وعلى لوحة MEFs لوحات مضيفا حس الخليوي الاستنساخ والملحق الاسترداد.
2. EB-مثل الحث والتمايز
- الاستقراء والتمايز الداخلي
- اليوم 0 - EB الحث
- تأكد، قبل بدء التمايز من BAF60C/Myod-infected hESCs، لديك عدد كبير من المستعمرات في البئر (الشكل 2C).
- لكل ص جيداemove المتوسط، ويغسل مع برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من 1 ملغ / مل كولاجيناز الرابع. احتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- إزالة كولاجيناز وإضافة 1 مل من EB المتوسط.
- تحت المجهر تشريح بسرعة فصل ميكانيكيا المستعمرات إلى 400-800 المجاميع الخلية عن طريق كشط مع طرف 10 مل.
- جمع قطع من المستعمرات في أنبوب 15 مل، والسماح لالرواسب لمدة 3 دقائق. إزالة طاف، وإعادة تعليق في 3 مل من EB المتوسطة ونقل تعليق خلية لبئر واحدة من أدنى مستوى 6 جيدا لوحة المرفق.
- يوم 1
- التحقق من حجم المستعمرات وموت الخلايا قبل المتابعة. إذا قطع كبيرة موجودة، وكسر لهم من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا مع ماصة 5 مل، 3-4 مرات. إذا كان موت الخلايا عالية جدا (العديد من الخلايا العائمة والحطام) استبدال المتوسطة من خلال جمع المجاميع في أنبوب 15 مل عن طريق الجاذبية وطبق عليهم مع 3 مل من الطازجة المتوسطة EB، والمضي قدما على خلاف ذلك على النحو التالي.
- إضافة 1.5مل من الطازجة المتوسطة EB في الآبار
- يوم 2
- تغيير المتوسطة من خلال جمع المجاميع من الآبار في أنبوب 15 مل. السماح لهم يستقر لمدة 2 دقيقة.
- إزالة طاف، مع استبدال 3 مل من الطازجة المتوسطة EB وتوزيع على نفس الآبار.
- يوم 3
- إضافة 1.5 مل من الطازجة المتوسطة EB في الآبار.
- اليوم 4
- المضي قدما كما هو موضح في "يوم 2".
- اليوم 5 - التفريق عضلي من EB-مثل مجموعات (الشكل 2D).
- جمع الركام كما هو موضح في 2.1.3.1 ويغسل مرة واحدة مع 2 مل من برنامج تلفزيوني؛ السماح للمجمعة لالرواسب.
- إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 3 مل من DM المتوسطة؛ لوحة على نفس الآبار.
- اليوم 6 - 20 يوم
- من D6 لD20 استبدال المتوسطة مع المتوسطة الطازجة كل 3 أيام. وتظهر myospheres ممثل في Figure 2E.
- اليوم 0 - EB الحث
- التحقق myosphere التمايز
- قبل المضي قدما، فمن المستحسن للتحقق من كفاءة التمايز عضلي داخل myospheres بجعل أقسام myospheres جزءا لا يتجزأ من أكتوبر المركب، كما هو موضح في البروتوكول إن الرب السابق 12. إجراء تلطيخ المناعي للعلامات عضلي مثل myognenin (F5D استنساخ، DSHB) والميوسين السلسلة الثقيلة (MF20 استنساخ، DSHB) (انظر نتائج الممثل).
تلميح! لتكون ناجحة مع تلطيخ لmyogenin على أقسام EB فمن الأهمية بمكان لأداء استرجاع مستضد عن طريق العلاج مع كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) 0.5٪ لمدة 5 دقائق. بالإضافة إلى ذلك، فمن الممكن استخدام هذا البروتوكول لتلطيخ مزدوجة باستخدام F5D وMF20 الأجسام المضادة.
- قبل المضي قدما، فمن المستحسن للتحقق من كفاءة التمايز عضلي داخل myospheres بجعل أقسام myospheres جزءا لا يتجزأ من أكتوبر المركب، كما هو موضح في البروتوكول إن الرب السابق 12. إجراء تلطيخ المناعي للعلامات عضلي مثل myognenin (F5D استنساخ، DSHB) والميوسين السلسلة الثقيلة (MF20 استنساخ، DSHB) (انظر نتائج الممثل).
3. وصفات وسائل الإعلام
- ESC المتوسطة
DMEM-F12
1 ملي L-الجلوتامين
20٪ خروج المغلوب سرأم استبدال المتوسطة (KOSR)
0.1 ملم الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA)
50 U / مل البنسلين / الستربتوميسين (القلم / بكتيريا)
0.1 ملي بيتا المركابتويثانول
8 نانوغرام / مل الأساسية عامل نمو الخلايا الليفية (bFGF) - EB المتوسطة
DMEM F12
1 ملي L-الجلوتامين
15٪ FBS
5٪ مصل الحصان - DM المتوسطة
DMEF F12
الملحق 1X ITS السائل وسائل الإعلام
1X N-2 الملحق
Representative Results
ويبين الشكل 1A التخطيطي من البروتوكول المقترح لتوليد myospheres من hESCs. الخطوات الحاسمة للسيطرة على (المشار إليها بواسطة الأسهم) هي كفاءة العدوى في hESCs وتحويل عضلي داخل myospheres.
في تجاربنا نحن الاستفادة من ناقلات lentiviral ترميز BAF60C الذي يحمل GFP مضان. نحن عادة ما تصيب الخلايا مع BAF60C ونظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز 72 ساعة بعد العدوى إلى إثراء للسكان معربا عن BAF60C. عندما تصل خلايا حوالي 70-80٪ من التقاء، ونحن تصيب MyoD مع الفيروسة البطيئة. بعد الإصابة الأولى فإنه عادة ما تستغرق يومين أو ثلاثة أيام للخلايا للوصول إلى ذلك التقاء.
الرقم 1B يظهر مستويات التعبير عن الجينات الخارجية عن التعريف أضعاف بالمقارنة مع غير المصابين hESCs. ويبين الشكل 1C التعبير والتوزيع على مستوى البروتين من العوامل قدم. BAF60C ويرد التعبير GFP مضان، في حين تم الكشف عن MyoD التعبير المناعي مع الأجسام المضادة MyoD. نعتبر يوم 0 اليوم نبدأ تمايز hESCs المصابة في المجاميع EB-مثل. بعد 15 يوما في المتوسط DM، يتم تضمين جزء من myospheres (عادة بشكل جيد بأكمله واحد) في مجمع أكتوبر 12 ومقطوع لأداء المناعي للعلامات عضلي للتحقق عضلي كفاءة التحويل. يبين الشكل 1D تلطيخ ممثل لmyogenin والميوسين السلسلة الثقيلة في والتمايز عضلي الأمثل. يمكن Myospheres لها أشكال مختلفة أو غير عادية، وربما نتيجة لالتحام مع myospheres أصغر. بدءا من يوم 10، فمن الممكن أن نلاحظ انكماش متفرقة في myospheres (انظر الفيلم 1 و 2).
43/51243fig1.jpg "/>
الشكل 1. A) تخطيطي للبروتوكول يستخدم لتوليد myospheres من hESCs. ب) مستويات مرنا من الجينات الخارجية في hESCs المصابين BAF60C وMyoD (H9-BM) التي رصدتها QRT-PCR وأعرب عن التعريف أضعاف، كما مقارنة بالسخرية hESCs المصابة الصور (H9-الظهور). C) المناعي يظهر تلطيخ MyoD (الحمراء) ومضان BAF60C (الأخضر) بسبب العنصر IRES-GFP في ناقلات. D) المناعي التي أجريت على أقسام myosphere الملون لMyogenin (MYOG )، سلسلة الميوسين الثقيلة (MyHC) و counterstained للدابي (انظر التفاصيل المناعي). شريط المقياس هو 100 ميكرون.
الشكل 2. صور الممثل مظهر الخلية في مراحل مختلفة منبروتوكول من العدوى (الجزء الأول) لتمايز (الجزء الثاني). شريط مقياس 100 ميكرون. في حين أن الهياكل EB-مثل من D1 إلى D5 هي في معظمها دائرية الشكل (D)، myospheres نمت على مدى 15 يوما وفقا للمخطط في الشكل 1A تقديم شكل لا يمكن التنبؤ بها وغير متجانسة في الثقافة؛ نرى اثنين من الأمثلة في E و F.
Discussion
يصف البروتوكول المقترح هنا كيفية توليد مجموعات ثلاثية الأبعاد من myofibers مقلص (myospheres) مباشرة من hESCs. الاستراتيجية المقترحة لديه القدرة غير مسبوقة وغير عادية لإنتاج عضلات صغيرة في التعليق الذي يمكن أن تكون مناسبة بأنه "مرض في طبق" نموذج لكلا المقايسات فحص والدراسات التنموية. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة لتوليد myospheres من hESCs واضحة ولا تحتاج إلى أي خطوة الفرز FACS خلال التمايز، والتي عادة ما لديها تأثير سلبي على العائد من الخلايا استردادها. الى جانب ذلك، فإن إجراء الفرز خلال التمايز تتداخل مع تجميع لأنه ينطوي على التفكك من EB إلى الخلايا واحد.
ويستند الطريقة المقترحة على reprograming جينية من hESCs مع عوامل محددة، MyoD وBaAF60C، والتي لا يتم التعبير عنها في الخلايا الجذعية الجنينية المحفزة. MyoD وBAF60C توفير "الأساسية" بروتين ال معقدةفي مواضع علامات الجيني الذي النسخ العائدات لتنشيط البرنامج عضلي الهيكل العظمي. يتم تسليم اثنين من العوامل إلى الخلايا عن طريق العدوى lentiviral وبالتالي فمن الأهمية بمكان الحصول على كفاءة عالية من إصابة كل من العوامل في جميع الخلايا. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق استخدام فيروسات عيار عالية أو الفيروسات هبوا علامات التحديد. شروط الثقافة أيضا تلعب دورا هاما في تحسين مدى تمايز عضلي. نقترح بروتوكول التمايز القائم على مصل للتمايز MyoD/BAF60C معربا عن hESCs في مجموعات السلائف عضلي، تليها حضانة في المصل خالية المتوسطة تحديدا (التي تحتوي على الانسولين ترانسفيرين - ITS) لتحقيق تحويل السلائف عضلي في myotubes الهيكل العظمي. ومع ذلك، فمن الممكن أن وسائل الإعلام تحديدا أخرى يمكن تحقيق التمايز عضلي مساوية أو أفضل. واحد الحد الحالي للبروتوكول هو أنه يعتمد على استخدام مصل بقري جنيني، والتي، إلى جانب احتواءالعديد من البروتينات الحيوانية والمواد جي، ويظهر الكثير إلى الكثير من الاختلافات. وهذا قد يؤدي إلى انخفاض كفاءة أو عدم تجانس تحويل عضلي داخل myospheres. من المذكرة، وليس كل الهياكل EB-مثل المستمدة من BAF60/MyoD-expressing hESCs هي myospheres؛ وهي، وبعضها EB-مثل الركام يتكون بالكامل من myofibers. عدد myospheres المستمدة عادة من hESCs معربا عن BAF60C وMyoD يمكن أن تختلف 30-60٪ حسب تقديرات المناعية على المقاطع EB أجريت في نهاية البروتوكول (انظر نتائج). ومن شأن النهج المحتملة لإثراء الثقافة طبق لmyospheres فقط يكون لاستخدام مراسل عضلي. وهذا من شأنه تسهيل التخلص من الكتل EB-متباينة مثل جزئيا أو لا، واختيار فقط myospheres.
أخيرا، فإن فهم أفضل للآليات التي تقوم عليها الاشتراطات الزمنية من العوامل أدخلت تكون مفيدة لتحسين طريقة التسليم. على سبيل المثال، إذا كان هناك حاجة BAF60C وMyoD فقط لركلات الترجيحالوقت أورط الى "ركلة" الخلايا في الاتجاه الصحيح، يمكن أن تطبق على أساس أساليب تعديل تسليم مرنا. على النقيض من ذلك، إذا كانت هناك حاجة العوامل لفترة أطول قبل الخلايا استغلال البروتينات الخاصة بهم الذاتية، وهو نهج episomal سوف أوصى للقضاء على التباين والآثار غير المنضبط بسبب الاندماج في الجينوم. أخيرا، نلاحظ أنه إلزامي للتعبير عن BAF60C قبل أو في نفس الوقت الذي MyoD (أبدا بعد) من أجل تحقيق تحويل HESC في العضلات والهيكل العظمي. شرط للتعبير مسبقة من المفترض BAF60C يعتمد على دورها في وضع ما قبل المشهد جينية للتوزيع MyoD ونين السليم من خلال الجينوم 6،15. على هذا النحو، يمكن تحسين بروتوكولات المستقبل من خلال المركبات أو التلاعب الأخرى التي تشجع التعبير BAF60C في hESCs.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
حزب العمال التقدمي هو باحث مشارك في مركز أبحاث الصحة سانفورد للطفولة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المنح التالية لحزب العمال التقدمي: R01AR056712، R01AR052779 وP30 AR061303 من المعهد الوطني للصحة / المعهد الوطني لالتهاب المفاصل والعضلات والعظام والأمراض الجلدية (NIAMS)، نجمة داود الحمراء وسانفورد الأطفال جائزة بحوث الصحية. وقد استفاد هذا العمل جزئيا من تمويل البحوث من البرنامج الإطاري السابع للجماعة الأوروبية في المشروع FP7 الصحة 2009 - ENDOSTEM 241440 (تفعيل الأوعية الدموية الخلايا الجذعية المرتبطة والخلايا الجذعية العضلية لإصلاح وصيانة الأنسجة العضلية) وأيد SA كتبها. CIRM الزمالة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Corning | 3506 | |
| 6-well low attachment plate | Corning | 3471 | |
| GFR Matrigel | BD Biosciencies | 356231 | |
| MEFs (growth arrested)14 | |||
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 15-090-CV | |
| KOSR | Invitrogen | 10828-028 | |
| 1 mM L-glutamine (100X) | Invitrogen | 35050-61 | |
| Pen/Strep (100X) | Invitrogen | 15070-063 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-050 | |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | |
| N2-supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
| TrypLE express | Invitrogen | 12605-010 | |
| FBS | HyClone | SH30396.03 | |
| HS | Invitrogen | 16050114 | |
| hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-100 | |
| bfgf | Sigma | 4114-TC | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Anti-MyoD | BD Biosciences | 554130 | |
| Anti-MyHC | DSHB | MF20 | |
| Anti-myogenin | DSHB | F5D |
References
- Darabi, R., et al. Functional skeletal muscle regeneration from differentiating embryonic stem cells. Nat Med. 14, 134-143 (2008).
- Darabi, R., et al. Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice. Cell Stem Cell. 10, 610-619 (2012).
- Iacovino, M., et al. Inducible cassette exchange: a rapid and efficient system enabling conditional gene expression in embryonic stem and primary cells. Stem Cells. 29, 1580-1588 (2011).
- Barberi, T., et al. Derivation of engraftable skeletal myoblasts from human embryonic stem cells. Nat Med. 13, 642-648 (2007).
- Goudenege, S., et al. Myoblasts derived from normal hESCs and dystrophic hiPSCs efficiently fuse with existing muscle fibers following transplantation. Mol Ther. 11, 2153-2167 (2012).
- Forcales, S. V., et al. Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex. Embo J. 31, 301-316 (2012).
- Albini, S., et al. Epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells into skeletal muscle cells and generation of contractile myospheres. Cell Rep. 3, 661-670 (2013).
- Weintraub, H., et al. Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 5434-5438 (1989).
- Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242, 405-411 (1988).
- Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51, 987-1000 (1987).
- Ho, L., et al. An embryonic stem cell chromatin remodeling complex, esBAF, is essential for embryonic stem cell self-renewal and pluripotency. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 5181-5186 (2009).
- Gomes, I. C., et al. Analysis of pluripotent stem cells by using cryosections of embryoid bodies. J Vis Exp. (46), (2010).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Barcova, M., Campa, V. M., Mercola, M. Human embryonic stem cell cardiogenesis. Human Stem Cell Manual: a Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. L., Schwartz, P. H. , Elsevier/Academic Press. Amsterdam. 227-237 (2007).
- Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1. Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).
