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Biology

Epigenetic reprogramming द्वारा hESCs से Myospheres की पीढ़ी

Published: June 21, 2014 doi: 10.3791/51243
Automatic Translation
1, 1,2
1Muscle Development and Regeneration Program, Sanford-Burnham Institute for Medical Research, 2IRCCS Fondazione Santa Lucia

Summary

यहाँ, हम मानव की जैविक सुविधाओं पुनरावृत्ति जो अनुमोदक संस्कृति परिस्थितियों में सिकुड़ा myofibers (myospheres) के तीन आयामी फार्म समूहों है कि कंकाल की मांसपेशी progenitors के एक सजातीय जनसंख्या पैदा करने की ओर मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) के epigenetic reprogramming पर आधारित एक प्रोटोकॉल का वर्णन कंकाल की मांसपेशियों.

Abstract

मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) से कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं का एक सजातीय और प्रचुर मात्रा में आबादी की पीढ़ी के सेल आधारित चिकित्सा के लिए और मानव neuromuscular बीमारियों का मॉडल एक "एक थाली में रोग" के लिए एक आवश्यकता है. ऐसे कम बहुतायत और ब्याज की आबादी है, साथ ही तीन आयामी सिकुड़ा संरचनाओं के गठन के लिए प्रोटोकॉल की कमी की विविधता के रूप में प्रमुख बाधा, neuromuscular विकारों के लिए स्टेम सेल के आवेदन सीमित है. हम hESCs में परिभाषित कारकों के अस्थानिक लागू होने से इन सीमाओं पर काबू पा कि एक प्रोटोकॉल तैयार की है - पेशी दृढ़ संकल्प कारक MyoD और श्रृंगार / एसएनएफ chromatin जटिल घटक BAF60C remodeling - कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं में hESCs reprogram करने में सक्षम हैं. यहाँ हम प्रोटोकॉल hESC व्युत्पन्न myoblasts पैदा करते हैं और निरीक्षण छोटी संरचनाओं (myospheres) में अपने क्लस्टरिंग बढ़ावा देने की स्थापना का वर्णन है कि कार्यात्मक नकल छोटी कंकाल की मांसपेशियों 7

Introduction

Pluripotency बनाए रखते हुए, क्योंकि उनके अद्वितीय क्षमता का स्वयं को नवीनीकृत, मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) पुनर्योजी चिकित्सा में एक अमूल्य संसाधन माना जाता है. इन विट्रो रोग मॉडलिंग के लिए कंकाल की मांसपेशियों के रोगग्रस्त मांसपेशियों और hESC या प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं के सेल की मध्यस्थता repopulation स्टेम (iPSC) व्युत्पन्न पीढ़ी उपचार की पहचान करने और कई neuromuscular रोग के रोगजनन elucidating के उद्देश्य से अध्ययन के प्रमुख लक्ष्य हैं. हालांकि, इन अध्ययनों कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं में परिवर्तित करने के लिए hESCs के प्रतिरोध से और कंकाल myogenesis की ओर hESC-प्रतिबद्धता की आणविक विनियमन के बारे में जानकारी की कमी से चुनौती दी गई है. दरअसल, hESCs से कंकाल की मांसपेशी पूर्वज उत्पन्न करने के लिए पिछले प्रयास केवल embryoid शरीर (ईबी) व्युत्पन्न progenies या mesenchymal कोशिकाओं ट्रांसक्रिप्शनल activators के अस्थानिक अभिव्यक्ति (निम्न कंकाल myogenesis सक्रिय करने के लिए सक्षम हैं पता चला है कि जैसेPax3 या Myf5) 1-3 या विशिष्ट संस्कृति शर्तों 4-5 के लिए जोखिम के.

हम पहले (SMARCD3 द्वारा इनकोडिंग) श्रृंगार / एसएनएफ घटक, BAF60C, मांसपेशी विशेष loci 6 की MyoD की मध्यस्थता सक्रियण की अनुमति देता है कि transcriptional मशीनरी का एक अनिवार्य घटक है कि पता चला है. हमने हाल ही में BAF60C के चुनिंदा अभाव hESCs पर अन्यथा दैहिक कोशिकाओं 8-10 व्यक्त BAF60C में मनाया जाता है कि कंकाल myogenesis 7 के MyoD की मध्यस्थता सक्रियण के लिए प्रतिरोध प्रदान पता चला है कि, एक प्रक्रिया सामान्यतः के रूप में myogenic रूपांतरण करने के लिए भेजा. BAF60C के लिए मजबूर अभिव्यक्ति सीधे BAF60C और myogenic वंश 7 की ओर hESCs करता है कि एक epigenetic हस्ताक्षर भव्य MyoD साथ, विशिष्ट संस्कृति शर्तों पर, hESCs में कंकाल myogenesis सक्रिय करने के लिए MyoD सक्षम बनाता है. ध्यान से, पिछले प्रोटिओमिक विश्लेषण BAF6 के चुनिंदा अनुपस्थिति का पता चला0C, श्रृंगार / एसएनएफ घटकों के बीच, ESCs 11 में. हम तीन आयामी सिकुड़ा फार्म के लिए एकत्रित किया जा सकता है कि कंकाल myoblasts का एक सजातीय जनसंख्या की पीढ़ी के लिए अग्रणी myogenic वंश पर hESCs के एक epigenetic प्रतिबद्धता लागू करने के लिए इस ज्ञान का उपयोग किया संरचनाओं (myospheres) कि कार्यात्मक नकल छोटी कंकाल की मांसपेशियों 7. दरअसल, hESCs से कंकाल की मांसपेशी पूर्वज पैदा करने की हमारी विधि जैसे सेल कोशिकाओं भेदभाव संकेतों को उजागर कर रहे हैं जब तक phenotypically अव्यक्त है जो myogenic वंश, के लिए hESCs के epigenetic प्रतिबद्धता पर निर्भर करता है भेदभाव मध्यम में एकत्रीकरण और संस्कृति (विशिष्ट प्रोटोकॉल देखें). इस रणनीति epigenetically कंकाल की मांसपेशी वंश के लिए प्रतिबद्ध है और ऊतकीय और कंकाल के कार्यात्मक संपत्तियों पुनरावृत्ति कि तीन आयामी सिकुड़ा myospheres के गठन के लिए उपयुक्त हैं hESCs के एक सजातीय आबादी के विस्तार के परमिटमांसपेशियों. myospheres पेशी रोगों का मॉडल एक "एक थाली में रोग" के लिए दोहन छोटी मांसपेशियों का पहला सबूत प्रदान करते हैं. रोगी व्युत्पन्न iPSCs से उत्पन्न करते हैं, तो इन myospheres चिकित्सकीय यौगिकों के उच्च throughput प्रदर्शन के लिए एक उपकरण के रूप में जबरदस्त क्षमता की पेशकश के अलावा, लम्बे समय से विकास संबंधी सवालों को स्पष्ट करने की क्षमता और दुर्लभ रोगों के रोगजनन है. हम भी गोम्स एट अल. 12 से एक जौव प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में myosphere विश्लेषण का एक तत्काल readout, वर्गों पर immunohistochemistry द्वारा प्रदान किया जा सकता है कि ध्यान दें

Protocol

HESCs के 1. संक्रमण

इस प्रोटोकॉल उच्च टिटर lentiviruses एन्कोडिंग BAF60C और MyoD 13 की आवश्यकता है. इन निर्माणों अनुरोध पर उपलब्ध हैं.

  1. शुरू करने से पहले अनुशंसाएँ
    1. फीडर मुक्त शर्तों पर संक्रमण वायरल तेज दौरान सेलुलर प्रतियोगियों को खत्म करने के लिए (2A चित्रा) के लिए संक्रमण, प्लेट hESCs के उच्च दक्षता सुनिश्चित करने के लिए. दरअसल, MEFs hESCs की तुलना में और MyoD की मध्यस्थता रूपांतरण के लिए सक्षम हैं के रूप में संक्रमित करने के लिए बेहद आसान कर रहे हैं. इस प्रकार, hESC संस्कृतियों से MEFs को नष्ट करने के संक्रमण की दर बढ़ जाती है.
    2. यह संक्रमण के उच्च दक्षता सुनिश्चित करने के लिए उच्च टिटर lentiviruses की सिफारिश की है. संक्रमण की दक्षता में सुधार करने के विकल्प "संक्रमण जाँच" खंड में चर्चा कर रहे हैं.
    3. अच्छी तरह से प्रत्येक में 1 मिलीग्राम / एमएल Matrigel के 1 मिलीलीटर जोड़कर Matrigel में लिपटे प्लेटों को तैयार है और कम से कम 1 आरटी पर मानव संसाधन (या हे छोड़ / एन 4 डिग्री सेल्सियस पर सीलपहले दिन के लिए तैयार हो तो).
  2. संक्रमण की प्रक्रिया
    1. संक्रमण से एक दिन पहले
      1. 1000 एक्स कमजोर पड़ने (2 मिमी अंतिम एकाग्रता) में मध्यम में HES सेल क्लोनिंग और रिकवरी पूरक जोड़ें.
    2. 0 दिन - BAF60C साथ संक्रमण
      नोट: पहले MyoD साथ संक्रमण द्वारा पीछा BAF60C साथ hESCs के संक्रमण को पूरा करें.
      1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए TrypLE के 1 मिलीलीटर के साथ ऊष्मायन द्वारा एक एकल कक्ष निलंबन में कालोनियों 14 के रूप में विकसित hESCs के 6 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से अलग कर देना
      2. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब पर स्थानांतरण निलंबन, 1200 rpm पर 5 मिनट के लिए hESC मध्यम और अपकेंद्रित्र के 9 मिलीलीटर जोड़ें.
      3. Centrifugation के दौरान, 1 mTeSR1 की मिलीलीटर, polybrene (6 मिलीग्राम / एमएल) और HES सेल क्लोनिंग और रिकवरी अनुपूरक (2 मिमी) को जोड़कर एक स्वच्छ ट्यूब में संक्रमण मिश्रण तैयार करें.
      4. एक सी से फिर से निलंबित सेल गोली (लगभग 5 x 10 5 -1 एक्स 10 6 कोशिकाओंonfluent अच्छी तरह hESCs के) प्लास्टिक का पालन करने से कोशिकाओं को रोकता है जो एक 6 अच्छी तरह से कम लगाव प्लेट, पर संक्रमण मिश्रण और थाली के 1 मिलीलीटर के साथ.
      5. 10 8 MOI में BAF60C-IRES-GFP वायरस जोडें और इनक्यूबेटर में 3 घंटा सेते
      6. वायरस युक्त सेल निलंबन लीजिए और दो Matrigel लेपित कुओं में समान रूप से विभाजित करते हैं. फिर अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए mTeSR1 + HES सेल क्लोनिंग और रिकवरी अनुपूरक के 2 एमएल जोड़ने और इनक्यूबेटर में ओ / एन छोड़ दें.
    3. दिन 1
      1. ध्यान से वायरस युक्त मध्यम हटाने और mTeSR1and HES सेल क्लोनिंग और रिकवरी अनुपूरक के 2 मिलीलीटर के साथ बदलें. चित्रा 2B में दिखाया गया के रूप में कोशिकाओं clumping शुरू कर देंगे.
    4. Day2 - MyoD साथ संक्रमण
      1. आगे बढ़ने से पहले संक्रमण के एक उच्च क्षमता है करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति स्थिति की जांच. यदि नहीं, तो संक्रमित जाँच "खंड देखेंआयन ".
      2. कोशिकाओं संगम की कम से कम 80% पर पहुंच गया है, तो आप निम्नानुसार आगे बढ़ना; अन्यथा पूर्व कार्यवाही करने के लिए एक अतिरिक्त दिन के लिए प्रतीक्षा करें.
      3. मध्यम निकालें और कोशिकाओं को अलग कर देना TrypLE अभिकर्मक के 1 मिलीलीटर जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट सेते
      4. वर्णित from1.2.2.2 के रूप में दोहराएँ - 1.2.2.6 10 8 MOI में MyoD वायरस जोड़ने.
    5. 3 दिन
      1. ध्यान से वायरस युक्त मध्यम हटाने और mTeSR1and HES सेल क्लोनिंग और रिकवरी अनुपूरक के 2 मिलीलीटर के साथ बदलें.
      2. Matrigel पर प्लेट MEFs संक्रमित कोशिकाओं के प्रसार को अनुमति देने के लिए अगले दिन के लिए 2.5 x 10 5/2 सेमी प्लेटें लेपित.
    6. 4 दिन
      1. मध्यम निकालें और कोशिकाओं को अलग कर देना TrypLE अभिकर्मक के 1 मिलीलीटर जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट सेते
      2. एक 15 एमएल फाल्कन ट्यूब में कोशिकाओं स्थानांतरण, 1,200 rpm पर 5 मिनट के लिए hESC मध्यम और अपकेंद्रित्र के 9 मिलीलीटर जोड़ें.
      3. आरemove सतह पर तैरनेवाला और hESC मध्यम से 6 मिलीग्राम में फिर से निलंबित.
      4. प्रत्येक अच्छी तरह से MEFs युक्त के लिए 3 मिलीग्राम वितरण, 1:2 विभाजन के अनुपात में MEFs युक्त 6 अच्छी तरह से थाली और थाली hESCs से मध्यम निकालें.
        कालोनियों संगम तक पहुँचते हैं! टिप, MyoD/BAF60C-infected कोशिकाओं के कुओं में से कुछ एक रिजर्व स्टॉक के रूप में तरल नाइट्रोजन में जमे हुए किया जा सकता है. ठंड मध्यम 90 KOSR का% और 10% DMSO प्लस 2 मिमी HES सेल क्लोनिंग और रिकवरी पूरक शामिल हैं. शेष कुओं फिर भेदभाव प्रोटोकॉल से अवगत कराया जा सकता है - विवरण के लिए नीचे देखें. अधिक कोशिकाओं को और अधिक myospheres उत्पादन करने की जरूरत है, तो आप निम्नानुसार संक्रमित hESCs आगे प्रचारित किया जा सकता है:
      5. मध्यम निकालें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल collagenase चतुर्थ के 1 मिलीलीटर के साथ सेते
      6. Collagenase चतुर्थ निकालें और hESC माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ें.
      7. एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे एक 10 मिलीलीटर टिप के साथ कालोनियों परिमार्जन.
      8. COLONI का हिस्सा लीजिएएक 15 मिलीलीटर ट्यूब में और 3 मिनट के लिए तलछट के लिए अनुमति तों. फिर एक अनुपात 01:04 का उपयोग MEFs प्लेटों पर hESC मध्यम और थाली में सतह पर तैरनेवाला, resuspend हटा दें.
  3. संक्रमण जाँच हो रही है
    1. कोशिकाओं का प्रचार है, यह आरएनए के विश्लेषण के लिए फसल और (प्रतिनिधि परिणाम देखें) प्रत्येक स्तर पर सही जैविक स्थिति का पता चलता है कि बायोमार्कर के लिए जाँच करने के क्रम में immunofluorescence द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण करने के लिए एक छोटे पैमाने में संक्रमित कोशिकाओं थाली करने के लिए सिफारिश की है. उच्च टिटर lentiviruses के लिए उम्मीद संक्रमित कोशिकाओं का प्रतिशत कम से कम 80% होना चाहिए.
    2. उच्च दक्षता सुनिश्चित करने के लिए, lentiviral वैक्टर एक फ्लोरोसेंट चयन मार्कर और / या एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध शुरू करने, संशोधित किया जा सकता है. BAF60C व्यक्त हमारे lentiviral प्लाज्मिड भी GFP प्रतिदीप्ति किया जाता है.
    3. एक फ्लोरोसेंट मार्कर के लिए hESCs छंटनी. संक्रमण के कम दक्षता के मामले में प्रतिदीप्ति एक का उपयोग करने के लिए सिफारिश की हैBAF60C वायरस व्यक्त कोशिकाओं के लिए समृद्ध और फिर उच्च टिटर MyoD वायरस से संक्रमित कोशिकाओं को (FACS छँटाई) छँटाई ctivated कोशिकाओं.
      1. मध्यम में HES सेल क्लोनिंग और रिकवरी अनुपूरक सॉर्ट करने से पहले दिन में जोड़ें.
      2. छंटाई के दिन, (0 दिन में वर्णित है) TrypLE द्वारा कोशिकाओं को अलग कर देना और FACS ट्यूबों में KO प्रतिस्थापन सीरम प्लस HES सेल क्लोनिंग और रिकवरी अनुपूरक में कोशिकाओं resuspend.
      3. छंटाई के अंत में, HES सेल क्लोनिंग और रिकवरी पूरक जोड़ने MEFs प्लेटों पर KO प्रतिस्थापन सीरम और थाली में कोशिकाओं को इकट्ठा.

2. ईबी तरह प्रेरण और भेदभाव

  1. प्रेरण और भेदभाव प्रक्रिया
    1. 0 दिन - ईबी प्रेरण
      1. अच्छी तरह से (चित्रा -2) में कालोनियों की संख्या अधिक है करने के लिए, BAF60C/Myod-infected hESCs से भेदभाव शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें.
      2. प्रत्येक अच्छी तरह से अनुसंधान के लिएemove मध्यम, पीबीएस के साथ धोने और 1 मिलीग्राम / एमएल collagenase चतुर्थ के 1 मिलीलीटर जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते
      3. Collagenase निकालें और ईबी माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ें.
      4. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत जल्दी यंत्रवत् एक 10 मिलीलीटर टिप के साथ scraping द्वारा 400-800 सेल समुच्चय में कालोनियों को अलग कर देना.
      5. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में कालोनियों का हिस्सा लीजिए और 3 मिनट के लिए तलछट के लिए अनुमति देते हैं. सतह पर तैरनेवाला निकालें, ईबी मध्यम के 3 मिलीलीटर में फिर से निलंबित और एक 6 अच्छी तरह से कम लगाव प्लेट की एक अच्छी तरह से करने के लिए सेल निलंबन हस्तांतरण.
    2. दिन 1
      1. आगे बढ़ने से पहले कालोनियों का आकार और कोशिका मृत्यु की जाँच करें. बड़ी मात्रा मौजूद हैं, तो एक 5 एमएल पिपेट, 3-4 बार साथ धीरे से ऊपर pipetting द्वारा और उन्हें नीचे तोड़ने. कोशिका मृत्यु बहुत अधिक है (कई अस्थायी कोशिकाओं और मलबे) गंभीरता से एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में समुच्चय इकट्ठा करके मध्यम जगह और ताजा ईबी मध्यम के 3 मिलीलीटर के साथ उन्हें थाली, इस प्रकार के रूप अन्यथा आगे बढ़ना.
      2. जोड़ें 1.5कुओं में ताजा ईबी मध्यम मिलीलीटर
    3. दिन 2
      1. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में कुओं से समुच्चय इकट्ठा करके मध्यम बदलें. उन्हें 2 मिनट के लिए बसने करते हैं.
      2. सतह पर तैरनेवाला निकालें ताजा ईबी मध्यम के 3 मिलीलीटर के साथ की जगह और एक ही कुओं पर फिर से विभाजित.
    4. 3 दिन
      1. कुओं में ताजा ईबी माध्यम की 1.5 मिलीलीटर जोड़ें.
    5. 4 दिन
      1. "2 दिवस" ​​के रूप में वर्णित आगे बढ़ें.
    6. दिन 5 - ईबी की तरह समूहों (चित्रा 2 डी) के myogenic भेदभाव.
      1. 2.1.3.1 में वर्णित के रूप में समुच्चय लीजिए और पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ एक बार धोने; एकत्रित तलछट के लिए अनुमति देते हैं.
      2. पीबीएस निकालें और डीएम के माध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़ने; एक ही कुओं पर थाली.
    7. दिन 6 - डे 20
      1. डी 6 से D20 के लिए हर 3 दिन ताजा माध्यम के साथ मध्यम जगह. प्रतिनिधि myospheres एफ में दिखाए जाते हैंigure 2 ई.
  2. जांच की जा रही myosphere भेदभाव
    1. आगे बढ़ने से पहले, यह एक पिछले जौव प्रोटोकॉल 12 में वर्णित के रूप में, अक्टूबर परिसर में एम्बेडेड myospheres के वर्गों बनाकर myospheres भीतर myogenic भेदभाव की दक्षता की जांच की सिफारिश की है. ऐसे myognenin रूप myogenic मार्कर (क्लोन F5D, DSHB) और मायोसिन भारी श्रृंखला (क्लोन MF20, DSHB) (प्रतिनिधि परिणाम देखें) के लिए एक immunofluorescence धुंधला प्रदर्शन करना.
      यह 5 मिनट के लिए सोडियम सल्फेट dodecyl (एसडीएस) में 0.5% के साथ इलाज के द्वारा प्रतिजन पुनर्प्राप्ति प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है ईबी वर्गों पर myogenin के लिए धुंधला के साथ सफल होने के लिए! टिप. इसके अतिरिक्त, यह F5D और MF20 एंटीबॉडी का उपयोग डबल धुंधला के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना संभव है.

3. मीडिया व्यंजनों

  1. ईएससी मध्यम
    DMEM-F12
    1 मिमी एल glutamine
    20% नॉकआउट सर्विसेजउम रिप्लेसमेंट मध्यम (KOSR)
    0.1 मिमी nonessential अमीनो एसिड (NEAA)
    50 यू / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन / Strep)
    0.1 मिमी बीटा mercaptoethanol
    8 एनजी / एमएल बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF)
  2. ईबी मध्यम
    DMEM F12
    1 मिमी एल glutamine
    15% FBS
    5% हार्स सीरम
  3. डीएम मध्यम
    DMEF F12
    1X अपने तरल मीडिया अनुपूरक
    1X एन 2 अनुपूरक

Representative Results

चित्रा 1 ए प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध hESCs से myospheres उत्पन्न करने के लिए प्रस्तावित पता चलता है. (तीर द्वारा इंगित) को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण कदम hESCs में संक्रमण की दक्षता और myospheres भीतर myogenic रूपांतरण हैं.

हमारे प्रयोगों में हम GFP प्रतिदीप्ति किया जाता है कि एक lentiviral वेक्टर एन्कोडिंग BAF60C का लाभ ले. हम आम तौर पर BAF60C व्यक्त की आबादी के लिए समृद्ध करने के लिए संक्रमण के बाद BAF60C और FACS सॉर्ट 72 घंटा के साथ कोशिकाओं को संक्रमित. कोशिकाओं संगम की लगभग 70-80% तक पहुँचते हैं, हम MyoD lentivirus के साथ संक्रमित. पहला संक्रमण के बाद यह सामान्य है कि संगम तक पहुँचने के लिए कोशिकाओं के लिए दो या तीन दिन लगते हैं.

चित्रा 1 बी संक्रमित नहीं hESCs गुना प्रेरण रिश्तेदार के रूप में एक्सोजेनस जीनों की अभिव्यक्ति के स्तर को दर्शाता है. चित्रा 1C पेश कारकों के प्रोटीन के स्तर पर अभिव्यक्ति और वितरण से पता चलता है. BAF60C MyoD अभिव्यक्ति एक MyoD एंटीबॉडी के साथ immunofluorescence ने पता लगाया है, जबकि अभिव्यक्ति, GFP प्रतिदीप्ति के रूप में दिखाया गया है. हम ईबी तरह समुच्चय में संक्रमित hESCs के भेदभाव शुरू दिन पर दिन 0 विचार करें. डीएम मध्यम में 15 दिनों के बाद, myospheres के एक हिस्से (आमतौर पर एक पूरे अच्छी तरह से) Oct यौगिक 12 में एम्बेडेड और myogenic रूपांतरण दक्षता की जांच करने के लिए myogenic मार्करों के लिए immunofluorescence प्रदर्शन करने sectioned है. चित्रा -1 myogenin और मायोसिन भारी श्रृंखला में के लिए प्रतिनिधि धुंधला से पता चलता है एक इष्टतम myogenic भेदभाव. Myospheres शायद छोटे myospheres साथ विलय का एक परिणाम के रूप में, अलग या असामान्य आकार हो सकता है. 10 दिन से शुरू, यह (फिल्म 1 और 2 देखें) myospheres में छिटपुट संकुचन निरीक्षण करने के लिए संभव है.

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चित्रा 1. ए) hESCs. बी से myospheres) BAF60C और MyoD (H9-बी एम) QRT-पीसीआर द्वारा नजर रखी और गुना प्रेरण के रूप में व्यक्त से संक्रमित hESCs में एक्सोजेनस जीन की mRNA स्तर की पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध, के रूप में संक्रमित hESCs नकली की तुलना की वजह से. डी) Immunofluorescence Myogenin के लिए दाग myosphere वर्गों पर प्रदर्शन वेक्टर में IRES-GFP तत्व (MYOG को MyoD धुंधला हो जाना (लाल) और BAF60C प्रतिदीप्ति (हरा) दिखा (H9-सीटीआर). सी) Immunofluorescence छवियों ), मायोसिन भारी श्रृंखला (MyHC) और DAPI के लिए counterstained (Immunofluorescence विवरण देखें). स्केल बार 100 मीटर है.

चित्रा 2
चित्रा 2. के विभिन्न चरणों में सेल उपस्थिति के प्रतिनिधि तस्वीरभेदभाव (भाग द्वितीय) के संक्रमण (भाग मैं) से प्रोटोकॉल. स्केल बार 100 मीटर है. ईबी संरचनाओं की तरह है, जबकि डी 1 से D5 को आकार (डी) में ज्यादातर परिपत्र हैं, चित्रा 1 ए में योजना एक अप्रत्याशित आकार वर्तमान और संस्कृति में विषम हैं अनुसार 15 दिन से अधिक हो myospheres; ई और एफ में दो उदाहरण देखें.

Discussion

यहाँ प्रस्तावित प्रोटोकॉल सीधे hESCs से सिकुड़ा myofibers (myospheres) के तीन आयामी समूहों उत्पन्न करने के लिए कैसे करें. प्रस्तावित रणनीति स्क्रीनिंग assays और विकास अध्ययन के लिए दोनों मॉडल "एक थाली में रोग" एक के रूप में उपयुक्त हो सकता है कि निलंबन में छोटा मांसपेशियों का निर्माण करने के अभूतपूर्व और असाधारण क्षमता है. इसके अलावा, hESCs से myospheres उत्पन्न करने के लिए विधि सरल है और आम तौर पर बरामद कोशिकाओं की उपज पर नकारात्मक प्रभाव पड़ता है जो भेदभाव के दौरान किसी भी FACS छँटाई कदम, की आवश्यकता नहीं है. यह एकल कक्षों में ईबी की एक हदबंदी का तात्पर्य के बाद इसके अलावा, भेदभाव के दौरान एक छँटाई प्रक्रिया एकत्रीकरण के साथ हस्तक्षेप करेगा.

प्रस्तावित विधि pluripotent भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं में व्यक्त नहीं कर रहे हैं जो विशिष्ट कारकों, MyoD और BaAF60C, साथ hESCs के epigenetic reprograming पर आधारित है. MyoD और BAF60C "मूल" प्रोटीन जटिल वें प्रदाननिशान पर प्रतिलेखन कंकाल myogenic कार्यक्रम को सक्रिय करने के लिए आय जिसमें से जीनोमिक loci. दो कारकों lentiviral संक्रमण के माध्यम से कोशिकाओं को दिया और यह सभी कोशिकाओं में दोनों कारकों के संक्रमण के एक उच्च दक्षता प्राप्त करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है रहे हैं. इस उच्च टिटर वायरस या चयन मार्कर के साथ संपन्न वायरस का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है. संस्कृति की स्थिति भी myogenic भेदभाव की हद अनुकूलन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. कंकाल myotubes में myogenic व्यापारियों का रूपांतरण प्राप्त करने के लिए - हम सीरम मुक्त परिभाषित मध्यम में ऊष्मायन (आईटीएस इंसुलिन transferrin युक्त) द्वारा पीछा myogenic व्यापारियों के समूहों में hESCs व्यक्त MyoD/BAF60C के भेदभाव के लिए एक सीरम आधारित भेदभाव प्रोटोकॉल, प्रस्ताव. हालांकि, यह अन्य परिभाषित मीडिया एक समान या बेहतर myogenic भेदभाव को प्राप्त कर सकते हैं कि संभव है. प्रोटोकॉल के एक वर्तमान सीमा है कि यह इसके अलावा जो होते हैं, भ्रूण गोजातीय सीरम, के उपयोग पर निर्भर करता हैकई पशु प्रोटीन और पदार्थ आईएनजी, बहुत से बहुत विविधताओं से पता चलता है. इस myospheres भीतर myogenic रूपांतरण की कम क्षमता या विविधता में हो सकता है. ध्यान से, BAF60/MyoD-expressing hESCs से प्राप्त सभी ईबी संरचनाओं की तरह myospheres नहीं कर रहे हैं; अर्थात्, कुछ पूरी तरह से myofibers से बना ईबी तरह समुच्चय हैं. (परिणाम देखें) प्रोटोकॉल के अंत में प्रदर्शन ईबी वर्गों पर immunostaining द्वारा अनुमानित रूप में सामान्य रूप से BAF60C और MyoD व्यक्त hESCs से व्युत्पन्न myospheres की संख्या 30 से 60% से भिन्न हो सकती हैं. केवल myospheres के लिए एक संस्कृति डिश को समृद्ध करने के लिए एक संभावित दृष्टिकोण एक myogenic संवाददाता का उपयोग किया जाएगा. यह आंशिक रूप से या नहीं विभेदित ईबी की तरह समूहों discarding और केवल myospheres चयन में सुविधा होगी.

अन्त में, पेश कारकों के अस्थायी आवश्यकताओं अंतर्निहित तंत्र की एक बेहतर समझ प्रसव की विधि में सुधार के लिए उपयोगी होगा. उदाहरण के लिए, अगर BAF60C और MyoD केवल श के लिए आवश्यक हैंort समय सही दिशा में "किक" कोशिकाओं को संशोधित mRNA वितरण पर आधारित विधियों लागू किया जा सकता है. कारकों कोशिकाओं उनके अंतर्जात प्रोटीन का फायदा उठाने से पहले एक लंबे समय के लिए आवश्यक हैं अगर इसके विपरीत, एक episomal दृष्टिकोण परिवर्तनशीलता और जीनोम में एकीकरण के कारण अनियंत्रित प्रभाव को खत्म करने की सिफारिश की जाएगी. अंत में, हम यह पिछले कंकाल की मांसपेशियों में hESC रूपांतरण प्राप्त करने के लिए या MyoD (कभी नहीं के बाद) के रूप में एक ही समय में BAF60C व्यक्त करने के लिए अनिवार्य है कि ध्यान दें. BAF60C की पूर्व अभिव्यक्ति के लिए आवश्यकता संभवतः जीनोम 6,15 के माध्यम से उचित MyoD chromatin वितरण के लिए epigenetic परिदृश्य पूर्व स्थापित करने में अपनी भूमिका पर निर्भर करता है. जैसे, भविष्य प्रोटोकॉल यौगिकों या hESCs में BAF60C अभिव्यक्ति का प्रचार करने वाले अन्य जोड़तोड़ द्वारा सुधार किया जा सकता है.

Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

पीएलपी सैनफोर्ड बच्चों के स्वास्थ्य अनुसंधान केंद्र के एसोसिएट अन्वेषक है. R01AR056712, R01AR052779 और गठिया और Musculoskeletal स्वास्थ्य / राष्ट्रीय संस्थान के राष्ट्रीय संस्थान और त्वचा रोग (NIAMS), एमडीए और सैनफोर्ड बच्चों के स्वास्थ्य अनुसंधान पुरस्कार से P30 AR061303: यह काम पीएलपी के लिए निम्न अनुदान द्वारा समर्थित किया गया है. इस काम आंशिक रूप से परियोजना में यूरोपीय समुदाय सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम से अनुसंधान के वित्तपोषण से लाभ हुआ है FP7 स्वास्थ्य - 2009 ENDOSTEM 241440 (मरम्मत और मांसपेशियों के ऊतकों के रखरखाव के लिए vasculature जुड़े स्टेम कोशिकाओं और मांसपेशियों में स्टेम कोशिकाओं की सक्रियता) एसए द्वारा समर्थित किया गया. सीआईआरएम फैलोशिप.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well plate Corning 3506
6-well low attachment plate Corning 3471
GFR Matrigel BD Biosciencies 356231
MEFs (growth arrested)14
Collagenase IV Invitrogen 17104-019
DMEM-F12 Invitrogen 15-090-CV
KOSR Invitrogen 10828-028
1 mM L-glutamine (100X) Invitrogen 35050-61
Pen/Strep (100X) Invitrogen 15070-063
2-Mercaptoethanol Invitrogen 21985-023
NEAA (100X) Invitrogen 11140-050
Polybrene Millipore TR-1003-G
ITS Liquid Media Supplement Sigma I3146
N2-supplement  Invitrogen 17502-048
TrypLE express Invitrogen 12605-010
FBS HyClone SH30396.03
HS Invitrogen 16050114
hES Cell Cloning & Recovery Supplement Stemgent 01-0014-100
bfgf Sigma 4114-TC
mTeSR1 Stemcell Technologies 5850
Anti-MyoD BD Biosciences 554130
Anti-MyHC DSHB MF20
Anti-myogenin DSHB F5D

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 88 ऊतकों कोशिकाओं भ्रूण संरचनाएं musculoskeletal प्रणाली है musculoskeletal रोगों hESC epinegetics कंकाल Myogenesis Myosphere chromatin Lentivirus संक्रमण
Epigenetic reprogramming द्वारा hESCs से Myospheres की पीढ़ी
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Albini, S., Puri, P. L. Generation… More

Albini, S., Puri, P. L. Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming. J. Vis. Exp. (88), e51243, doi:10.3791/51243 (2014).

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