Summary
ここでは、許容的培養条件下でヒトの生物学的特徴を再現収縮筋線維（myospheres）の三次元クラスターを形成し、骨格筋前駆細胞の均質な集団を生成することに向けて、ヒト胚性幹細胞（hESC）のエピジェネティックな再プログラミングに基づくプロトコルを記載骨格筋。
Abstract
ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）からの骨格筋細胞の均質かつ豊富な人口の生成は細胞ベースの治療のために、人間の神経筋疾患のモデル「皿の中の病気」のための必要条件である。このような低存在量および目的の集団、ならびに三次元収縮構造の形成のためのプロトコルの欠如の不均一性などの主要なハードルは、神経筋障害のための幹細胞の用途が限られている。複雑なコンポーネントのBAF60C改造筋肉決定因子MyoDのとSWI / SNFクロマチン - - 私たちは、ヒトES細胞における定義された要因の異所性を導入することにより、これらの制限を克服し、プロトコルを設計した骨格筋細胞にヒトES細胞を再プログラムすることができること。ここでは、プロトコルがhESC由来筋芽細胞を生成し、三次元小型化された構造（myospheres）に彼らのクラスタ化を推進するために設立さについて説明し、その機能的に模倣する小型化された骨格筋7
Introduction
多能性を維持しながら、そのために彼らのユニークな能力の自己再生、ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）は、再生医療での貴重な情報源と考えられている。 インビトロ疾患モデリングのための骨格筋の病気の筋肉とのhESCまたは誘導多能性幹細胞の細胞媒介性再増殖（IPSC）由来の生成幹する治療を同定し、多くの神経筋疾患の病因の解明を目的とした研究の主要な目標である。しかし、これらの研究は、骨格筋細胞に変換するhESCの抵抗によって、骨格筋形成に向けてのhESC-コミットメントの分子規制に関する情報の不足によって挑戦されてきた。実際、ヒトES細胞から骨格筋前駆細胞を生成するための従来の試みは、胚様体（EB）由来の子孫や、間葉系細胞は、転写活性化因子の異所性発現後の骨格筋形成を活性化させる能力があることを明らかにした（ 例：PAX3またはMyf5の）1-3または特定の培養条件4-5への暴露による。
我々は以前（SMARCD3によってコードされる）、SWI / SNF複合コンポーネント、BAF60Cは、筋特異的遺伝子座6のMyoDの媒介活性化を可能にする転写機構の不可欠な構成要素であることを示した。我々は最近、BAF60Cの選択がない場合は、そうでないBAF60Cで観察され、骨格筋形成7のMyoDの媒介活性化に対する抵抗は、8月10日 、一般的に筋原変換と呼ばれるプロセスを体細胞に発現ヒトES細胞に与えることを発見した。 BAF60Cの強制発現は、直接BAF60CとのMyoDは筋形成系譜7に向けてヒトES細胞をコミットエピジェネティックな署名を課すことで、特定の培養条件により、ヒトES細胞、骨格筋形成を活性化するためにMyoDのを可能にします。注目すべきは、前のプロテオーム解析がBAF6を選択的に存在しないことを明らかにした0Cは、SWI / SNFのうち、ESCは11に。我々は3次元の収縮を形成するために集約することができた骨格筋芽細胞の均質な集団の生成につながる、筋原系統へのhESCのエピジェネティックなコミットメントを課すためにこの知識を使用構造（myospheres）機能的に模倣小型化された骨格筋7。実際、ヒトES細胞から骨格筋前駆細胞を生成する手法は、細胞など、細胞が分化シグナルに露出するまで、表現型潜伏ある筋原系統へのhESCのエピジェネティックなコミットメントに依存しています分化培地での集計·文化（特定のプロトコルを参照してください）。この戦略は、後成的骨格筋系譜にコミットし、骨格の組織学的および機能的特性を再現3次元収縮myospheresの形成に適しているヒトES細胞の均質な集団の拡大が可能に筋肉。 myospheresは筋疾患のモデル「皿の中の病気」のために悪用可能な小型化された筋肉の最初の証拠を提供しています。患者に由来するiPS細胞から生成されると、これらのmyospheresは治療用化合物のハイスループットスクリーニングのためのツールとして大きな可能性を提供することに加えて、長年の発達疑問を解明する可能性と希少疾患の病因を持っている。また、ゴメスら 12によるJoveのプロトコルに記載のようにmyosphere分析の一つの即時読み出しは、切片上で免疫組織化学によって提供され得ることに注意
Protocol
hESCの1。感染
このプロトコルは、高力価のレンチウイルスエンコーディングBAF60CおよびMyoDは13が必要です。これらの構築物は、リクエストに応じてご利用いただけます。
- 開始前の推奨事項
- 無フィーダー条件でのウイルス感染の間の細胞の取り込みは競 合を排除する（ 図2A）のための感染、プレートhESCの高効率を確保するためである。確かに、MEFを悪名高いヒトES細胞と比較し、MyoDの媒介変換の能力があるように感染しやすくなります。したがって、hESC培養物からのMEFを排除する感染率を増加させる。
- これは、感染の高効率を確保するために高力価のレンチウイルスを持っていることをお勧めします。感染の効率を改善するためのオプションが「 感染の確認」のセクションで説明します。
- 各ウェルに1 mg / mlのマトリゲルの1ミリリットルを追加することによって、マトリゲルでコーティングしたプレートを用意し、RT（またはO / Nで少なくとも1時間を残して4℃で密閉し前日に用意している場合）。
- 感染手続き
- 感染前の日
- 千×希釈（2の最終濃度）で培地中でヒトES細胞クローニングとリカバリのサプリメントを追加します。
- 0日目 - BAF60Cによる感染
注：最初のMyoDの感染が続くBAF60CでヒトES細胞への感染を実行します。- 37℃で5分間のTrypLE 1mlでインキュベートすることによって単一細胞懸濁液中の14のコロニーとして成長するhESCの6ウェルプレートのウェルを解離
- 15 mlチューブに移すサスペンション、1,200 rpmで5分間のhESC媒体および遠心分離機の9ミリリットルを追加します。
- 遠心分離の間、mTeSR1、ポリブレン（6 mg / ml）をし、ヒトES細胞クローニングとリカバリのサプリメント（2 mm）で1ミリリットルに追加することにより、きれいなチューブでの感染ミックスを調製する。
- 1 Cからの再懸濁細胞ペレット（約5×10 5 -1×10 6個の細胞hESCのonfluentウェル）感染ミックスの1ミリリットルとし、プラスチックに付着する細胞を防ぐ6ウェル低接着プレート上にプレート。
- 10 8 MOIでBAF60C-IRES-GFPウイルスを追加し、インキュベーター内で3時間インキュベートする
- ウイルスを含む細胞懸濁液を収集し、2マトリゲル被覆されたウェル中で均等に分割します。その後、各ウェルにmTeSR1 +ヒトES細胞クローニングとリカバリサプリメントの2ミリリットルを追加し、インキュベーター内で、O / Nのままにしておきます。
- 1日目
- 慎重にウイルスを含む培地を除去し、mTeSR1andヒトES細胞クローニングとリカバリサプリメントの2ミリリットルと交換してください。 図2（b）に示すように細胞が凝集を開始します。
- 2日目 - のMyoDによる感染
- 先に進む前に、感染の高い効率を持っていることを確認するために、蛍光顕微鏡下で細胞の蛍光状態を確認してください。そうでない場合に感染の確認 」の項を参照してください。イオン」。
- 細胞がコンフルエンスの少なくとも80％に達している場合は、次のように進みます。そうでなければ次に進む前に、追加の日を待つ。
- 培地を除去し、細胞を解離するためのTrypLE試薬1ミリリットルを加える。 37℃で5分間インキュベート
- 記載されfrom1.2.2.2として繰り返し- 10 8 MOIでMyoDのウイルスを追加する1.2.2.6。
- 3日目
- 慎重にウイルスを含む培地を除去し、mTeSR1andヒトES細胞クローニングとリカバリサプリメントの2ミリリットルと交換してください。
- マトリゲル上のプレートMEFを感染細胞の増殖を可能にするために、次の日のために2.5×10 5個/ cm 2でプレートをコーティングした。
- 4日目
- 培地を除去し、細胞を解離するためのTrypLE試薬1ミリリットルを加える。 37℃で5分間インキュベート
- 1,200 rpmで5分間のhESC媒体および遠心分離機の9ミリリットルを加え、15 mlのファルコンチューブに細胞を移す。
- R残したまま削除上清およびヒトES細胞培地6mlに再懸濁。
- 各ウェルのMEF-含有のために3ミリリットルを分配する1:2の分割比でMEFを含有6ウェルプレートとプレートのhESCからメディアを取り出します。
コロニーがコンフルエンスに達すると TIPは！、MyoD/BAF60C-infected 細胞のいくつかのウェルは、リザーブストックとして液体窒素中で凍結することができる。凍結培地は、KOSRの90％と10％のDMSOを加えた2 mMのヒトES細胞クローニングとリカバリのサプリメントが含まれています。残りのウェルはその後分化プロトコルにさらされる可能性-については、以下を参照してください。より多くの細胞がより多くmyospheresを生産するために必要な場合は、次のように感染したヒトES細胞をさらに増殖させることができます。 - 培地を除去し、37℃で5分間、1 mg / mlのコラゲナーゼIV 1mlでインキュベート
- コラゲナーゼIVを削除し、ヒトES細胞培地1mlを加える。
- 解剖顕微鏡下で10ミリリットルチップでコロニーをこすり。
- コローニの塊を集める15 mlチューブ中のESと3分間沈降することができます。そして、比1:4を使用したMEFプレートにヒトES細胞培地とプレートに上清、再懸濁を削除します。
- 感染前の日
- 感染症のチェック
- 細胞を増殖させるが、それは（ 代表的な結果を参照 ）RNA分析のために採取し、各段階での正確な生物学的状況を反映したバイオマーカーを確認するために、免疫蛍光法によるタンパク質発現分析を実行するためのスケールでの感染細胞をプレートすることをお勧めします。高力価のレンチウイルスに期待感染した細胞の割合は少なくとも80％であるべきである。
- 高い効率を確保するために、レンチウイルスベクターは、選択マーカー、蛍光および/または抗生物質耐性を導入すること、改変することができる。 BAF60Cを表現する私たちのレンチウイルスプラスミドは、GFP蛍光を運ぶ。
- 蛍光マーカーのためにヒトES細胞をソートする。感染の効率が低い例では、蛍光aを使用することをお勧めしますBAF60Cウイルスを発現する細胞を濃縮した後、高力価のMyoDのウイルスで細胞を感染させる（FACSソーティング）を選別ctivated細胞。
- ソート前日培地中のヒトES細胞クローニングとリカバリのサプリメントを追加します。
- ソートの日は、（0日目に書かれているように）のTrypLEにより細胞を解離し、FACS-試験管内のKO交換用の血清を加えたヒトES細胞のクローニングとリカバリサプリメントで細胞を懸濁します。
- ソートの最後に、ヒトES細胞クローニングとリカバリのサプリメントを追加するMEFプレート上のKO交換血清およびプレート内の細胞を収集します。
2。、EBのような誘導と分化
- 誘導および分化手順
- 0日目 - EB誘導
- ウェル（ 図2C）にコロニーの数が多いため、BAF60C/Myod-infected hESCに分化を開始する前に、確認してください。
- 各ウェルRの残したまま削除メディア、PBSで洗浄し、1 mg / mlのコラゲナーゼIVの1ミリリットルを加える。 37℃で5分間インキュベートする。
- コラゲナーゼを除去して、EB培地1mlを加える。
- 解剖顕微鏡下で急速に機械的に10 mlの先端でこすることによって400〜800細胞凝集体にコロニーを解離する。
- 15 mlチューブにコロニーのチャンクを収集し、3分間沈降することができます。上清を除去し、EB培地3mlに再懸濁し、6ウェルの低付着性プレートの1つのウェルに細胞懸濁液を移す。
- 1日目
- 先に進む前に、コロニーの大きさと細胞死を確認してください。大きな塊が存在する場合は、静かに5 mlのピペットで上下にピペッティングして3〜4回にそれらを破る。細胞死が非常に高い場合（多くの浮遊細胞及び破片）が重力により15 mlチューブ中で凝集体を収集することにより培地を交換し、新鮮なEB培地3mlでそれらプレート、次のように他の方法で進行する。
- 1.5を追加ウェル中の新鮮なEB培地1ml
- 2日目
- 15 mLチューブ内の井戸から凝集体を収集することにより、メディアを変更します。彼らは2分間落ち着くましょう。
- 、上清を取り除き、新鮮なEB培地3mlに交換し、同じ井戸に再配布します。
- 3日目
- ウェル中に新鮮なEB培地の1.5ミリリットルを追加します。
- 4日目
- 「2日目」で説明したように進んでください。
- 5日目- EB様クラスター（ 図2D）の筋原性分化。
- 2.1.3.1で説明したように凝集体を収集し、2mlのPBSで1回洗浄;集約されたが沈降することができます。
- PBSを除去して、DM培地3mlを追加します。同じウェル上のプレート。
- 6日目 - 20日目
- D6からD20に3日ごとに新しい培地と培地を交換してください。代表myospheresは、Fに示されているigure 2E。
- 0日目 - EB誘導
- myosphere分化をチェックする
- 先に進む前に、以前のJoveのプロトコル12で説明したように、OCTコンパウンドに埋め込 まmyospheresのセクションを行うことで、myospheres内筋形成分化の効率をチェックすることをお勧めします。 （ 代表的な結果を参照 ）などmyognenin（クローンF5D、DSHB）およびミオシン重鎖（クローンMF20、DSHB）などの筋原性マーカーの免疫蛍光染色を行う。
TIPは！EB切片上での染色ミオゲニンで成功するためには、5分間のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、0.5％で処理することによって抗原回復を行うことが重要である。加えて、F5DおよびMF20抗体を用いて二重染色のためにこのプロトコルを使用することが可能である。
- 先に進む前に、以前のJoveのプロトコル12で説明したように、OCTコンパウンドに埋め込 まmyospheresのセクションを行うことで、myospheres内筋形成分化の効率をチェックすることをお勧めします。 （ 代表的な結果を参照 ）などmyognenin（クローンF5D、DSHB）およびミオシン重鎖（クローンMF20、DSHB）などの筋原性マーカーの免疫蛍光染色を行う。
3。メディアのレシピ
- ESC培地
DMEM-F12
1mMのL-グルタミン
20％ノックアウトのSerUM交換用培地（KOSR）
0.1mMの非必須アミノ酸（NEAA）
50 U / mlペニシリン/ストレプトマイシン（ペニシリン/ストレプトマイシン）
0.1mMのβ-メルカプトエタノール
8 ng / mlの塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF） - EB培地
のDMEM F12を
1mMのL-グルタミン
15パーセントのFBS
5％ウマ血清 - DM媒体
DMEF F12]
1X ITS液体培地サプリメント
1XのN-2サプリメント
Representative Results
図1Aは、プロトコルの概略は、hESCにmyospheresを生成することが提案示す。 （矢印で示す）を制御する重要なステップは、ヒトES細胞における感染効率及びmyospheres内の筋原性変換である。
我々の実験では、GFP蛍光を運ぶレンチウイルスベクターをコードするBAF60Cを活用する。我々は通常BAF60Cを表現する人口を濃縮するために、感染後BAF60Cし、FACSソート72時間で細胞を感染させる。細胞がコンフルエンスの70〜80％に達するとき、私たちはMyoDのレンチウイルスを感染させる。最初の感染後に、それは通常その合流点に到達するために、細胞のために2か3日かかります。
図1Bは、感染していないヒトES細胞の誘導倍率と比較ような外因性の遺伝子の発現レベルを示す。 図1Cは、導入された因子のタンパク質レベルでの発現および分布を示す。 BAF60C MyoDの発現はMyoDの抗体を用いて免疫蛍光により検出しながら発現は、GFP蛍光として示されている。我々は、EBのような凝集体に感染したヒトES細胞の分化を開始する日0日を考えてみましょう。 DM培地で15日後、myospheresの部分（通常は1全体ウェル）をOCT化合物12に埋め込 まれ、筋原変換効率をチェックするために筋原性マーカーについて免疫蛍光を実行するように区分されている。 図1Dはミオゲニンおよびミオシン重鎖のための代表的な染色を示す最適な筋原性分化。 Myospheresは、おそらく小さいmyospheresとの融合の結果として、異なる、または異常な形状を有することができる。 10日目から出発し、それは（ 映画1及び2を参照 ）myospheresで散発収縮を観察することができる。
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図1ヒトES細胞からmyospheresの生成に使用されるプロトコルの。A）の回路図B）としてBAF60CとのMyoD（H9-BM）定量RT-PCRにより監視され、誘導倍率と表現に感染したhESCにおける外来遺伝子のmRNAレベル、原因ベクターにおけるIRES-GFP要素にMyoDの染色（赤）とBAF60C蛍光（緑）を示す感染したヒトES細胞（H9-CTR）。C）免疫蛍光画像を模擬するために比較するD）ミオゲニンについて染色myosphere切片で実施免疫蛍光（MYOG ）、ミオシン重鎖（MyHCの）およびDAPI用対比（免疫蛍光詳細を参照してください）。スケールバーは100μmである。
図2。の様々な段階での細胞の外観の代表的な写真分化（パートII）への感染（パートI）からプロトコル。スケールバーは100μmである。 D5はD1からのEB様構造は、（D）の形状で、主に円形であるのに対し、予測不可能な形を提示し、文化の中で異質である。図1（a）にスキームに従って15日間かけて成長しmyospheres; EとFの2つの例を参照してください。
Discussion
ここで提案されているプロトコルは、直接ヒトES細胞から収縮筋線維（myospheres）の3次元のクラスタを生成する方法について説明します。提案された戦略は、スクリーニングアッセイと発達研究の両方のためのモデル」皿に疾患」として適切であり得る懸濁液中のミニ筋肉を生成するためにこれまでにないと異常性を秘めています。また、ヒトES細胞からmyospheresを生成するための方法は簡単で、一般的に回収された細胞の収量に悪影響を及ぼし、分化、中の任意のFACSソーティング工程を必要としない。それは単一細胞にEBの解離を意味するのでまた、分化中のソート手順が集計を妨害する。
提案手法は、多能性胚性幹細胞で発現していない特定の要因のMyoDおよびBaAF60CでヒトES細胞のエピジェネティックなreprogramingに基づいています。のMyoDおよびBAF60Cは「コア」とは、タンパク質の複雑な目を提供マークの転写は、骨格筋形成プログラムを起動に進み、そこからゲノム遺伝子座。二つの要因は、レンチウイルス感染により細胞に送達し、すべての細胞中の両方の因子の感染の高い効率を得ることが重要であるている。これは、選択マーカーを付与高力価のウイルスまたはウイルスを使用することによって達成することができる。培養条件はまた、筋形成分化の程度を最適化する際に重要な役割を果たす。骨格筋管に筋原前駆体の変換を達成するために - 私たちは、無血清限定培地（ITSインスリントランスフェリンを含む）中で培養した筋原前駆体のクラスターの中にヒトES細胞を表現MyoD/BAF60C分化のための血清ベースの分化プロトコルを提案する。しかしながら、他の定義されたメディアが同等以上の筋形成分化を達成することができる可能性がある。プロトコルの一電流制限は、他に含まれている、ウシ胎児血清の使用に依存していることである多くの動物性タンパク質や物質のING、ロット間のばらつきを示している。これはmyospheres内筋原変換効率の低下や不均一性の原因となります。注目すべきは、BAF60/MyoD-expressingヒトES細胞から派生したすべてのEB様構造はmyospheresいるわけではありません。つまり、いくつかは完全に筋線維から構成されるEB状の集合体である。 （結果を見る）プロトコルの最後に実行EB切片上で免疫染色により推定され、通常BAF60CとのMyoDを発現しているヒトES細胞から誘導されたmyospheresの数は百分の30から60まで変化することができる。唯一myospheres用培養皿を豊かにする可能性のあるアプローチは、筋原性レポーターを使用することです。これは部分的かに分化し、EB様クラスターを破棄し、唯一myospheres選択が容易になる。
最後に、導入された要因の時間的要件のメカニズムをよりよく理解するには、配信の方法を改善することは有用であろう。例えば、BAF60CおよびMyoDのは、SHのために必要な場合「キック」にORT時間右方向のセルは、修正されたmRNAの配信に基づいた方法が適用される場合があります。因子は、細胞がそれらの内因性タンパク質を利用する前に、より長い時間のために必要とされる場合には対照的に、エピソームアプローチが変動し、ゲノムへの組込みに起因する制御されない影響を排除することが推奨されるであろう。最後に、我々はそれが前に骨格筋へのhESCの変換を達成するためにするかのMyoD（決して後）と同時にBAF60Cを表現するために必須であることに注意してください。 BAF60Cの前に発現させるための必要条件は、おそらくゲノム6,15を通じて適切MyoDのクロマチン分布のためのエピジェネティックな風景を前の設定におけるその役割に依存しています。このように、将来のプロトコルは、化合物またはヒトES細胞におけるBAF60C発現を促進他の操作で改善される場合があります。
Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
PLPはサンフォード子供の健康研究センター准研究者でもある。 R01AR056712、R01AR052779、関節炎と筋骨格系の健康/国立研究所の国立研究所と皮膚疾患（NIAMS）、MDAおよびサンフォード児童保健研究賞からP30のAR061303：この作品は、PLPに次の補助金によって支えられてきた。本研究の一部プロジェクトでの欧州共同体の第七次フレームワーク計画からの研究資金の恩恵を受けているFP7-健康- 2009 ENDOSTEM 241440（ 修理や筋肉組織の維持のために血管系に関連する幹細胞や筋肉幹細胞の活性化）SAはサポートされていました。 CIRMフェローシップ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Corning | 3506 | |
| 6-well low attachment plate | Corning | 3471 | |
| GFR Matrigel | BD Biosciencies | 356231 | |
| MEFs (growth arrested)14 | |||
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 15-090-CV | |
| KOSR | Invitrogen | 10828-028 | |
| 1 mM L-glutamine (100X) | Invitrogen | 35050-61 | |
| Pen/Strep (100X) | Invitrogen | 15070-063 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-050 | |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | |
| N2-supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
| TrypLE express | Invitrogen | 12605-010 | |
| FBS | HyClone | SH30396.03 | |
| HS | Invitrogen | 16050114 | |
| hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-100 | |
| bfgf | Sigma | 4114-TC | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Anti-MyoD | BD Biosciences | 554130 | |
| Anti-MyHC | DSHB | MF20 | |
| Anti-myogenin | DSHB | F5D |
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