Denne protokol illustrerer væsentlige modifikationer af polyribosome fraktionering med henblik på at studere translatome in vivo CNS prøver. Det giver mulighed for en samlet vurdering af oversættelse og transkription regulering gennem isolation og sammenligning af total RNA til ribosom bundne RNA fraktioner.
Flere processer er involveret i genekspression, herunder transkription, translation og stabiliteten af mRNA'er og proteiner. Hvert af disse trin er stramt reguleret, hvilket påvirker den endelige dynamik af protein overflod. Forskellige reguleringsmekanismer findes ved omregning trin, rendering mRNA niveauer alene en upålidelig indikator for genekspression. Desuden har den lokale regulering af mRNA translation været særligt involveret i neuronale funktioner, skiftende 'translatomics' til fokus i neurobiologi. Den præsenterede metode kan bruges til at bygge bro transcriptomics og proteomics.
Her beskriver vi væsentlige ændringer af teknikken med polyribosome fraktionering, der afhører translatome baseret på foreningen af oversatte aktivt mRNAs til flere ribosomer og deres differentieret sedimentation i saccharosegradienter. Traditionelt arbejder med in vivo prøver, især i central nervesystem (CNS), har vist sig udfordrende på grund af de begrænsede mængder materiale og tilstedeværelsen af fedtvæv komponenter. For at afhjælpe dette, er den beskrevne protokol specifikt optimeret til brug med minimal mængde af CNS-materiale, som påvist ved anvendelse af enkelt mus rygmarv og hjerne. Kort fortalt, er CNS-væv udvundet og oversætte ribosomer er immobiliserede på mRNA'er med cycloheximid. Myelin flotation udføres derefter for at fjerne lipidrige komponenter. Fraktionering udføres på en saccharosegradient hvor mRNA'er adskilles efter deres ribosomale belastning. Isolerede fraktioner er egnet til en række af downstream analyser, herunder nye genom bred assay teknologier.
Genekspression er bestemt af den kombinerede virkning af transkription, translation og stabilitet af mRNA og proteiner med oversættelse bærer mest fremherskende effekt 1. Det er nu klart, at hvert af disse trin, er stærkt reguleret. Micro-RNA, dannelse af RNA-granulat, alternative og cytoplasmatisk polyadenylering er nogle eksempler på post-transkriptionel regulering af genekspression 2,3. Hver af disse mekanismer afkobler transskription fra oversættelse og påvirker proteom i det biologiske system af interesse. Således overraskende, mRNA niveauer alene er en ufuldkommen udlæsning af protein niveau 4. Kvantitativ proteomics giver den mest direkte vurdering af genekspression, men på trods af de seneste fremskridt, er der stadig betydelige begrænsninger på følsomhed og protein sekvens opløsning. Derfor løse translatome, repertoire oversætte mRNAs, tilbyder en fremragende kompromis mellem at studeretranskriptom og proteomanalyse. Det er mere præcis end transcriptomics i vurderingen af den endelige genekspression, og giver både højere dækning og sekvens opløsning end proteomics.
I pattedyr systemer, de fleste af oversættelse begivenheder begynder via cap-afhængige indvielse. En gruppe af eukaryote initiation faktorer sammen med 40S lille ribosomale underenhed samle på 5'-cap-af et mRNA. Komplekset scanner derefter mRNA og efter at have nået startkodonen AUG rekrutterer den 60S store ribosomale underenhed at danne en komplet 80S ribosom. Forlængelsen fase forløber med ribosomet bevæger sig langs mRNA med forlængelsesegenskaber faktorer bistå inkorporering af aminosyrer fra belastede tRNAs til den spirende peptidkæde. Flere ribosomer kan fortsætte langs en enkelt mRNA samtidigt og har vist sig at antallet af tilknyttede ribosomer at korrelere med hastigheden af proteinsyntese 5,6. Dette gør ribosomale lastning en pålidelig indikation for translation og tillader adskillelse af aktivt oversætte mRNA'er baseret på sedimentationshastighed. Ud over at kvantificering af oversætte mRNAs kan sekvens information opnås at identificere motiver involveret i oversættelse regulering. RNA Også bindende proteiner og andre oversættelse faktorer kan isoleres fra forskellige fraktioner, lette undersøgelsen og opdagelsen af beslægtede regulatoriske proteiner.
I nervesystemet er translationel kontrol er bundet til processer, såsom mRNA oplagring, transport og lokalt proteinsyntese. Vækstkegler har vist sig at være bærere af en specifik lokaliseret pool af mRNA'er er adskilt fra resten af Axon 7. Desuden axoner besidder evnen til lokalt at syntetisere proteiner 8,9. Som et resultat heraf, har lokal styring af oversættelse blevet en afgørende emne for undersøgelse i neurobiologi. Potentiale polyribosome fraktionering at løse dette er illustreret i flere undersøgelser, hvor teknikken blev anvendt til atundersøge Axon vejledning i rygmarv udvikling, og demonstrerede aktiviteten-afhængige oversættelse af BDNF i hjernen 10,11.
Selv polyribosome fraktionering er ikke en ny teknik, er det stadig en særdeles udfordrende. Baseret på input-materiale, kan væsentlig optimering være nødvendig. Dette er især tilfældet for in vivo CNS prøver, når mængden af materiale er ofte en begrænsning og fede vævskomponenter hindre isolering af oversætte mRNA'er. Mest offentliggjorte fraktioneringstrin protokoller behandle gær eller mammale cellelinjer, og der er etablerede protokoller for hjernen 12,13,14. I modsætning hertil er der næppe nogen publikationer, der beskriver fraktionering af rygmarv, og tidligere protokoller kræver rygmarv fra et stort antal dyr, der skal pooled 15.. Af disse grunde blev der flere væsentlige ændringer foretages for at tilpasse fraktionering protokol for CNS-væv, herunder enkelt mus rygmarven. Ribosom immobilisering med cycloheximid udføres under dyretransporter perfusion at undgå dissociation af ribosomer During den lange proces af væv ekstraktion. Efterfølgende polysomalt RNA udvindes på en bestemt måde for at maksimere polyribosome udbytte. Først kontrolleres homogenisering af væv ved douncing holder kernen intakt og forhindrer DNA-kontaminering. Kernen fjernes derpå pålideligt ved centrifugering. Kombinationen af de detergenter NP-40 og natriumdeoxycholat sikrer lysis af det endoplasmatiske reticulum og frigivelse af dets membranassocierede ribosomer. Desuden UV-absorberende komponenter i lipidrig myelin tilsløre polyribosome profiler. Myelin flotation er derfor nødvendigt, hvis tætte forbindelser, såsom polyribosomer pelleteres og lettere forbindelser, såsom myelin flyde og fjernes 16. Polyribosomer derefter sedimenteret i en 17,5% til 50% saccharosegradient. Stedet for manuelt lagdeling og frysning hver saccharose lag kan gradienter også fremstilles under anvendelse af en gradient mixer. Ekstraktion af RNA fra fraktioner under anvendelse af sure phenol / chloroform giver DNA fjernes med minimal RNA tab. Dog kan faseinversion forekomme ved tætte sucrose fraktioner (ovennævnte fraktion 16).
Denne protokol giver fordele i forhold til andre konventionelle metoder, der fokuseres på omfanget af oversættelsen. For eksempel har både målingen af fosforyleret S6 (en fremtrædende oversættelse markør) samt mærkning af spirende kæder med radioisotoper giver oplysninger om globale oversættelse niveauer, men afslører lidt om, hvad der specifikt er ved at blive oversat. Polyribosome fraktionering, på den anden side, ikke kun tillader vurdering af den globale oversættelse, men også af identitet oversætte mRNAs og de dermed forbundne regulatoriske proteiner. Kvantitativ real time PCR kan udføres på isolerede RNA til en hurtig læsning af udvalgte mRNAs, og microarrays og næste generation RNA sekventering kan udføres for genom studier. De optimeringer præsenteres her tillader teknikken skal bruges med minimale mængder af CNS-væv, derfor aftagening af antallet af dyr, der er nødvendigt, og forbedring af den samlede eksperimentel kvalitet ved at reducere væv behandlingstid. På den anden side kan denne teknik ikke skelne Stalled ribosomer fra oversætte dem. Udskrifter transporterer fastkørte ribosomer vil sedimentere i de tunge fraktioner, og det bør holdes for øje i tolkningen af data.
Der er de seneste rapporteret teknikker, nemlig RiboTaq og TRAP, hvor ribosomer er mærket med epitopmærker eller journalister i henholdsvis en celletype specifik måde og tilhørende mRNAs isoleret ved immunoudfældning 17,18. Denne teknik kan kobles til polyribosome fraktionering at tilbyde høj opløsning udlæses til specifikke cellepopulationer. Ribosom mund-udskrivning er en anden ny teknik, der involverer nuklease fordøjelse til at generere små fragmenter, eller "fodspor", af mRNAs, der er beskyttet af ribosomer. Biblioteker dannes derefter ud fra disse fodspor og sekventeret. Denne metode PROVIdes en codon-specifikke hele genomet analyse på oversættelse og er i stand til at identificere fastkørte ribosomer, ikke-Aug startkodoner og små opstrøms åbne læserammer, som ikke kan opnås ved polyribosome fraktionering 19. Dog kan polyribosome fraktionering kobles til ribosomet profilering til isolering af nedbrudte fragmenter, der indeholder en enkelt ribosomer, og dermed berigende for de molekylære arter, der er nødvendige for bibliotek forberedelse i hvor høj prøve renhed er ofte påkrævet. Tilsammen polyribosome fraktionering er en fleksibel metode med varig betydning og kan kobles til forskellige efterfølgende anvendelser, herunder genom assays som næste generation sekventering.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af det tyske Forbundsministeriet for Uddannelse og Forskning (BMBF), den Systembiologi til signalering i Cancer (Helmholtz Alliance om Systembiologi) og den tyske Cancer Research Center (DKFZ).
Hank’s balanced salts solution | Gibco | 14170-138 | |
Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 mL, 14 x 95mm | Beckman Coulter | 331374 | |
Diethylpyrocarbonate | Sigma | D5758 | caution |
Cycloheximide | Sigma | C7698 | danger |
Dithiothreitol | Sigma | 43815 | warning |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 11697498001 | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride solution | Sigma | 93482 | danger |
RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2611 | |
Nonidet P-40 | Roche | 11332473001 | danger |
Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | warning |
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion | AM9722 | danger |
GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
Equipment | |||
Dounce Tissue Grinder, 1mL/7ml | Wheaton | 357538/357542 | |
Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 mL, 40,000 rpm, 285,000 x g | Beckman Coulter | 331302 | |
Density Gradient Fractionator | Teledyne Isco | ||
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies |