Summary
このプロトコルは、in vivoでのCNSサンプルのtranslatomeを研究するためにポリリボソーム分画の本質的な変更を示している。これは、結合したRNA画分をリボソームへの全RNAの単離と比較を通じて翻訳と転写制御の全体的な評価が可能になります。
Abstract
複数のプロセスは、mRNAおよびタンパク質の転写、翻訳および安定性を含む遺伝子発現に関与している。これらのステップの各々は、緊密に、タンパク質存在量の最終的な動力学に影響を与え、調節される。種々の調節機構は、単独で、遺伝子発現の信頼できないインジケータをmRNAレベルを描画、変換ステップに存在する。また、mRNAの翻訳のローカル規制は特に神経生物学での注目の的に「translatomics」をシフトする、神経機能に関与している。提示方法は、トランスクリプトミクスおよびプロテオミクスをブリッジするために使用することができる。
ここでは、複数のリボソームとショ糖勾配での差動沈降に積極的に翻訳されたmRNAの関連付けに基づいてtranslatomeに質問ポリリボソーム分画の技術に不可欠な変更について説明します。伝統的に、特にセントラのin vivoサンプルでの作業lの中枢神経系（CNS）、材料の制限された量および脂肪組織成分の存在のために困難なことが証明されている。これに対処するために、記載されたプロトコルは、特に単一のマウス脊髄および脳の使用によって実証されるように、CNS材料の最小量で使用するために最適化される。簡単に説明すると、CNS組織を抽出し、翻訳をリボソームとmRNAのシクロヘキシミド上に固定化される。ミエリン浮選は、その後、脂質リッチ成分を除去する。分別はmRNAは、そのリボソームの負荷に応じて分離してショ糖勾配上で実行される。単離された画分を新たなゲノムワイドなアッセイ技術を含む下流のアッセイの範囲に適している。
Introduction
遺伝子発現は、翻訳は最も優勢な効果軸受1と、転写、翻訳およびmRNAおよびタンパク質の安定性の複合作用によって決定される。なお、これらのステップの各々は高度に調節されていることが今や明らかである。マイクロRNAは、RNA顆粒、代替のポリアデニル化および細胞質の形成は、遺伝子発現2,3の転写後調節のいくつかの例である。これらの機構の各々は、翻訳からの転写を脱共役し、関心のある生物系においてプロテオームに影響を与えます。従って、当然、単独でmRNAレベルは、タンパク質レベル4の不完全読み出される。定量的プロテオミクスは、しかし最近の進歩にもかかわらず、感度、タンパク質配列の解決にかなりの制限がまだある、遺伝子発現の最も直接的な評価を提供する。したがってtranslatomeに取り組む、翻訳mRNAのレパートリーは、勉強の間の優れた妥協点を提供していますトランスクリプトームやプロテオーム。これは、最終的な遺伝子発現を評価するトランスクリプトミクスよりも正確で、より高いカバレッジとプロテオミクスよりもシーケンスの解像度の両方を提供します。
哺乳動物系では、翻訳事象の大部分は、キャップ依存性開始介して開始する。一緒に40Sリボソーム小サブユニットと真核生物の開始因子群は、mRNAの5 'キャップに集合。複合体は、mRNAをスキャンして、開始コドンAUGに到達すると、完全な80Sリボソーム形成するために、60Sリボソーム大サブユニットを募集しています。リボソームは伸長因子は、新生ペプチド鎖に装填されたtRNAのアミノ酸の組み込みを補助するとは、mRNAに沿って移動すると伸長段階に進む。複数のリボソームは同時に単一のmRNAに沿って進むことができ、関連するリボソームの数は、タンパク質合成5,6の速度と相関することが示されている。これはTRANのための信頼できる指標をロードするリボソームを作るslation積極的に沈降速度に基づいてmRNAを翻訳するの分離を可能にする。のmRNAの翻訳の定量化に加えて、配列情報は、翻訳調節に関与するモチーフを同定するために得ることができる。また、RNA結合タンパク質および他の翻訳因子は、関連する調節タンパク質の研究および発見を容易にする、異なる画分から単離することができる。
神経系において、翻訳制御は、mRNAの貯蔵、輸送および局所タンパク質合成のようなプロセスに関連している。成長円錐は、軸索7の他の部分とは異なるmRNAの特定のローカライズされたプールを保有することが示されている。また、軸索は局所的にタンパク質8,9を合成する能力を有する。その結果、翻訳の局所制御は、神経生物学の研究の重要な話題になっている。これに対処するポリリボソーム分画の電位に技術が使用された、いくつかの研究で例示されている脊髄開発における軸索ガイダンスを調査し、脳10,11におけるBDNFの活性依存性の翻訳を示した。
Protocol
全ての動物実験は、DKFZの制度ガイドラインに従って行った。
注意：サンプルのRNA分解酵素の混入を防ぐためRNaseのコンタミを回避するための基本的な予防措置を取り、DEPC処理水を用いてすべてのバッファを製造するために。
スクロース勾配の1。準備
- （ 表1参照）17.5、25.6、33.8、41.9および50％ショ糖溶液を調製する。ゆっくりポリアロマー超遠心管の底に50％スクロース溶液2mlを添加することにより、勾配の準備を開始。 -80℃で20分間チューブを配置することによって層をフリーズ
- 17.5％のショ糖に終わる、その間の凍結ステップでショ糖の割合を減少さでその後の層を追加します。下の層の融解を防ぐためにショ糖溶液の添加の間、氷上で勾配を維持する。
- たての1日の使用前に、ショ糖勾配を準備し、4℃で保管しAlternativelYは、実験前の夜、4℃で-80℃と融解で、事前に店舗に勾配を準備します。
2。組織調製（脊髄および/または脳）
- NaCl中のキシラジンおよびケタミンの過剰投与によりマウスを麻酔し、経関連転写上のリボソームを固定化する200μg/ mlののCHXを含むハンクス平衡塩溶液（HBSS）20mlで灌流。つま先のピンチに非応答で適切な麻酔を確認してください。
- 急速に組織を抽出します。頭蓋の背を開き、脳を抽出します。全体胸部および腰部脊柱の椎弓切除を行い、脊髄を抽出します。それぞれ、全脳（〜400ミリグラム）、または脊髄の4センチメートルピース（〜90 mg）を使用してください。
- シクロヘキシミドの取り込みの増加を可能にし、サイコロきれいなメスを用いて小片に：;：氷の冷たい均質化緩衝液A（ 表1参照）（4ミリリットル脳1ミリリットル脊髄）内に組織を移す。 Perfo氷の上のすべての更なるステップRM。
- 15分間インキュベートし、機械的にDounceホモジナイザーを用いて組織を均質化する。注意深く制御された均質化は、核がそのまま残ることを保証する必要がある。すべてのサンプルの比較可能性を確保するためにまったく同じように扱う。注：脳組織のために：しっかりフィット乳棒で5ストロークで組織を混乱させる。脊髄組織のために：しっかりフィット乳棒で5さらにストロークが続く遊嵌乳棒で5ストロークで混乱させる。
- トータルRNA単離のために-80℃で一定分量（脳と脊髄のための200μL400μL）、フラッシュ凍結して保存してください。
- 4℃で10分間、500×gでの遠心分離により核および未破砕の細胞及び組織断片を除去低速遠心分離は、リボソームの損失を防ぎます。
- NP-40およびデオキシコール酸ナトリウムの界面活性剤（1％の最終濃度まで各々）を加えることにより30分間核を含まない上清中で溶解する膜断片。
- このステップは、他の方法でポリリボソームプロファイルで信号をマスクするサンプルからの脂肪成分を除去する。まず、予備冷却超遠心バケット及び4℃でローターと2 M、1.1 Mを調製し、0.9 Mのショ糖溶液は、（ 表1参照）。
- 2 Mショ糖溶液の1.22倍容量の溶解液を混合し、ポリエチレン超遠心チューブに移す。 1.1 Mショ糖溶液で10mlを等量のすべてのチューブを埋める、その後0.9 Mショ糖溶液で慎重に重ねる。
- あらかじめ冷却超遠心バケットに超遠心管を配置します。 4℃、100,000×gで3時間遠心分離このプロセスの間に脂肪の成分が浮上し、上清中に残っているのに対し、ペレット内に堆積なるリボソーム。
4。ショ糖勾配分画
- 上清を除去し、均質化緩衝液Bでペレットを溶解する（ 表1を参照してください。
- あらかじめ冷却超遠心バケットに（準備が前のセクションで説明されている）、ショ糖勾配を配置します。慎重に勾配の上の層のサンプル。技術的なコントロールとして1ブランクのショ糖勾配を追加します。
- 均質化バッファーで各バケットの重量を調整します。 4℃で285,000×gで1.5時間遠心分離器のサンプル
- 遠心分離の終了前にイスコの精留塔30分の準備を開始。分留塔の別のモデルが使用される場合、製造業者のプロトコルに従う。
- UVランプのための適切な感度を（脳や脊髄のための0.05 AUFS 0.2 AUFS）を設定し、ウォームアップのためにそれをオンにします。チューブ穿孔を組み立て、管穿孔を通して60％ショ糖溶液にローリングポンプを介して接続してください。
- ショ糖（フローラットをポンピングすることによって設定をテストE：1ミリリットル/分）、特にグラデーションに気泡を導入する配管内の漏れがないことを確認してください。
- 手動でUV検出器に勾配バッファをポンピングし、ベースラインを補正することにより、ブランクバックグラウンド吸収。
- 慎重にローターから沈降したサンプルを、ショ糖勾配を含む超遠心バケットを削除して、氷の上に置きます。解像度の損失を防ぐために、勾配の任意の突沸を避ける。
- 分別装置で実行グラデーション。バックグラウンド吸収を評価し、適切な技術的なセットアップを確保するために、最初の空のグラデーションを実行します。
- UV検出器にグラデーションを取り付け、チューブ穿孔してチューブの底に穴を開け。上向きにUV検出器を通過して落下ディスペンサーに沈降したサンプルでグラデーションを変位さ60％ショ糖のポンプを起動します。
- 260nmでの吸光度をsedimentaを示すピークが、試料の吸収プロファイルを生成するために文書化されてリボソームサブユニット、モノソーム、およびリボソームのその後増えに関連するmRNAのTiONから。
- （2 mlチューブ内の600μlの各、）ドロップディスペンサーを経由して20分画にサンプルを収集。
個々の画分から5。RNA分離
- 個々の画分1％の最終濃度まで10％SDSを添加し、タンパク質をアンフォールドし、リボソームを解離するために、よく混ぜる。この時点で、サンプルは-80℃で凍結させることができる対処すべき質問に応じて、画分を吸光度プロファイルに従ってプールすることができる。
- また、DNAの混入の痕跡を除去した酸性フェノール/クロロホルム抽出とRNAを単離する。
- 各試料から（RTに予熱）酸性フェノール/クロロホルムの1ボリュームを追加し、65℃で10分間の熱、その後ヒュームフードの下で圧力を解放します。
- RTで17000×gで20分間遠心サンプル。慎重に新しい1.5ミリリットルに水相を転送チューブ。水相は、遠心分離後の一番下にあるかもしれない、より高密度ショ糖画分における位相反転に注意してください。
- RNAを沈殿させるために、1容積のイソプロパノール、1/9体積酢酸ナトリウム（pH5.2）、各サンプルに1μlのグリコブルーを追加する。 -80℃でサンプルを少なくとも1時間を保つ
- 17000×gで4℃で30分間遠心グリコブルーは、ペレットの可視化を提供します。上清を除去し、氷冷した80％エタノールと空気乾燥ペレットで一回ペレットを洗浄。 RNA分解酵素を含まない水でペレットを溶解する。
- ナノドロップによるRNAの量を定量化し、バイオアナライザチップによってRNAの完全性を分析します。提示されたプロトコルで得られるRNAは、マイクロアレイと深い配列決定を含む当該技術分野ハイスループットアッセイのすべての状態に適している。
Representative Results
図2は、分別後の代表ポリリボソームプロファイルを示す。細胞株について前述したように脳と脊髄のプロフィールは、特徴的な吸収曲線を示す。小さなリボソームサブユニット（40S）より軽い留分で沈殿物とに結合されたmRNAは、リボソーム大サブユニット（60S）とモノソーム（80S）が結合されたmRNAが続くのプロファイル上のピークとして最初に表示されます。複数のリボソームに結合したmRNAは、後ピークがバインドされたリボソームの増加数を示すとともに、重い画分で沈降する。グローバル翻訳プロファイルから評価することができる。一例として、脳組織は、よりアクティブな変換を示し、脊髄組織よりも比を高くするモノソームポリリボソームを有する。
個々の画分から抽出されたRNAは、18Sおよび28S rRNAの分布を示す、バイオアナライザにより評価した。 18S rRNAのライターsucrに沈降小さなリボソームサブユニットによると、以前のプロフィールに表示されます OSE画。全RNAの典型的な収量は、脳と脊髄のための2-4μgの10〜20μgのです。個々の画分からのRNA収量は、割合に応じて、それぞれ4μgの、脳と脊髄のための0.8μgのまである。ブランクスクロース勾配は既にDTTの存在に起因する260nmでのいくつかのバックグラウンド吸収を示す。このバックグラウンドは、サンプル値を正規化するために、データ分析時に減算することができる。 EDTA処理は沈降プロファイルが翻訳によるもの実証、ポリリボソームピークを崩壊した。
図1。ワークフローおよびin vivoでのポリリボソーム画の潜在的なアプリケーション。>この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
空のグラデーションと脳の図2。バイオアナライザによる抽出されたRNAの評価と脳と脊髄の（A）の代表的なポリリボソームプロファイル、。定量RT-PCRによる分画上のGAPDH mRNAの（B）の分布。（C）ポリリボソームプロファイルとないEDTA処理。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
| 1.1 | 2X勾配バッファ | 30mMのトリス-HCl pH7.4中、30のMgCl 2、600mMのNaCl、20mMの0μg/ mlのシクロヘキシミド（CHX）、2mMのジチオスレイトール（DTT） | |
| 1.1 | スクロース溶液17.5％ | 8.67グラムのスクロース、25ミリリットル2X勾配バッファ、最大50ミリリットルのDEPC H 2 0 | |
| 1.1 | スクロース溶液25.6％ | 12.8グラムのスクロース、25ミリリットル2X勾配バッファ、最大50ミリリットルのDEPC H 2 0 | |
| 1.1 | スクロース溶液33.8％ | 16.9グラムのスクロース、25ミリリットル2X勾配バッファ、最大50ミリリットルのDEPC H 2 0 | |
| 1.1 | スクロース溶液41.9％ | 20.95グラムのスクロース、25ミリリットル2X勾配バッファ、最大50ミリリットルのDEPC H 2 0 | |
| 1.1 | スクロース溶液、50％ | 25gのスクロース25mlの2×勾配緩衝液、最大50ミリリットルのDEPC H 2 0 | |
| 2.3 | 均質化緩衝液A | 0.25 Mスクロース、50mMのトリス/ HCl、pH7.4）で、5mMのMgCl 2、25mMのKClを | 200μg/ mlのCHX、1Xロシュ完全プロテアーゼ阻害剤、1mMのDTT、1mMのphenylmethanesulfonylfluoride（PMSF）、100 U / mlののRNAsin |
| 3.1 | 2Mショ糖溶液 | 68.4％スクロース、50mMトリス-HCl、pH7.4中、5mMのMgCl 2、25mMのKClを | 100μg/ mlのCHX、1×ロッシュ完全プロテアーゼインヒビター、1mMのDTT、1mMのPMSF |
| 3.1 | 1.1Mショ糖溶液 | 38.5％スクロース、50mMトリス-HCl、pH7.4中、5mMのMgCl 2、25mMのKClを | 100μg/ mlのCHX、1×ロッシュ完全プロテアーゼインヒビター、1mMのDTT、1mMのPMSF |
| 3.1 | 0.9Mショ糖溶液 | 30.8％スクロース、50mMトリス-HCl、pH7.4中、5mMのMgCl 2、25mMのKClを | 100μg/ mlのCHX、1×ロッシュ完全プロテアーゼインヒビター、1mMのDTT、1mMのPMSF |
| 4.1 | HomogenizationバッファB | 0.25 Mスクロース、50mMのトリス/ HCl、pH7.4中、5mMのMgCl 2、25mMのKClを、1％NP-40、1％デオキシコール酸ナトリウム | 200μg/ mlのCHX、1×ロッシュ完全プロテアーゼインヒビター、1mMのDTT、1mMのPMSF、100 U / mlでのRNAsin |
表1。 緩衝液および溶液のリスト。
Discussion
ポリリボソーム画は新しい技術ではありませんが、それは特に難しい1のまま。入力された材料に基づく、実質的な最適化が必要であることができる。これは、特に材料の量は、多くの場合、組織成分、翻訳mRNAの単離を妨げる制限および脂肪酸であるインビボ CNS試料の場合である。大部分の公開された分画プロトコルは、酵母または哺乳動物細胞株に対処する、および脳12,13,14のための確立されたプロトコルが存在する。これとは対照的に、脊髄の分別を記述する任意の出版物はほとんど存在しており、以前のプロトコルが15をプールするために多数の動物から脊髄を必要とする。これらの理由から、いくつかの本質的な修飾は、単一のマウス脊髄を含むCNS組織、分別のためのプロトコルを適合させるために行われた。シクロヘキシミドとリボソーム固定化は、ドゥリンリボソームの解離を避けるために、動物の灌流の間に実行されている組織抽出のG長いプロセス。続いて、ポリソームRNAはポリリボソームの収率を最大にするために特定の方法で抽出される。まず、ダウンシングによる組織の制御された均質化は、完全な核を保持し、DNAの混入を防ぐことができます。核はその後、遠心分離により確実に除去されている。洗剤NP-40およびデオキシコール酸ナトリウムの組み合わせは、小胞体およびその膜結合リボソームのリリースの溶解を保証します。また、脂質の豊富なミエリン内の紫外線吸収成分は、ポリリボソームプロファイルを不明瞭。ミエリン浮選は、必要があるようなポリリボソームのような密度の高い化合物は、ペレット化される場合、そのようなミエリンfloatとして軽量化化合物および16を除去した。ポリリボソームは、その後、17.5％〜50％のショ糖勾配上で沈降されています。代わりに、手動で各ショ糖層を積層し、凍結の、グラデーションも勾配ミキサーを用いて調製することができる。酸性フェノール/クロロホルムを用いて画分からのRNAの抽出を可能にするDNAは、最小限の損失でRNAを除去する。しかし、位相反転は（端数16以上）密なショ糖画分で行うことができる。
このプロトコルは、翻訳のレベルに取り組む他の従来の方法に比べて利点を提供します。例えば、リン酸化されたS6（著名な翻訳マーカー）の測定だけでなく、放射性同位元素で発生期の鎖のラベルの両方は、グローバルな翻訳レベルに関する情報を与えるが、特に翻訳されているものに少しを明らかにした。ポリリボソーム分画は、他の一方で、グローバルアセスメント翻訳だけでなくmRNAの翻訳および関連する調節タンパク質の同一性を可能にする。定量的リアルタイムPCRは、選択されたmRNAのうち迅速な読み取りのために単離されたRNA上で行うことができ、マイクロアレイおよび次世代のRNA配列決定は、ゲノムワイド研究のために行うことができる。ここに提示の最適化は、技術が減少するので、CNS組織の最小量で使用することを可能にする必要な動物の数をINGと組織処理時間を短縮することにより、全体的な実験の品質を向上させる。一方、この技術は、翻訳したものからのもの停止状態のリボソームを区別することができない。ストールしたリボソームを運ぶ転写物は、重質留分に沈降し、データを解釈する際に留意すべきである。
リボソームは、細胞型特異的な様式でそれぞれのエピトープタグまたはレポーターで標識し、免疫沈降17,18により単離したmRNAを対応付けた最近報告された技術、すなわちRiboTaqおよびTRAPがあります。この技術は、特定の細胞集団のために読み出さ高い分解能を提供するために分別ポリリボソームに結合することができる。リボソームフットプリントはリボソームによって保護されているmRNAの別の新規な小断片を生成するために、ヌクレアーゼ消化を伴う技法、または「フットプリント」である。ライブラリは、これらの足跡から生成され、配列決定される。このメソッドはPROVIDEの翻訳に対するコドン特異的全ゲノム解析やストールリボソームを識別することができる、非-AUGコドンとポリリボソーム分別19により達成することができない小さな上流のオープンリーディングフレームを開始。しかしながら、ポリリボソーム分画は、高純度の試料がしばしば必要とされるライブラリーを調製するために必要な分子種を富化、単リボソームを含有する消化された断片の単離のためのプロファイリングリボソームに結合することができる。一緒になって、ポリリボソーム分画は、永続的な重要性を持つ柔軟な方法であり、次世代シーケンシングのようなゲノムワイドアッセイを含む、様々なダウンストリームアプリケーションに接続することができる。
Disclosures
利害の対立が宣言されていません。
Acknowledgments
この作品は、教育研究のドイツ連邦環境省（BMBF）、（システム生物学上のヘルムホルツ·アライアンス）は、癌におけるシグナル伝達のシステム生物学とドイツ癌研究センター（DKFZ）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank’s balanced salts solution | Gibco | 14170-138 | |
| Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 ml, 14 x 95 mm | Beckman Coulter | 331374 | |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma | D5758 | caution |
| Cycloheximide | Sigma | C7698 | danger |
| Dithiothreitol | Sigma | 43815 | warning |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 11697498001 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride solution | Sigma | 93482 | danger |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2611 | |
| Nonidet P-40 | Roche | 11332473001 | danger |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | warning |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion | AM9722 | danger |
| GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
| Equipment | |||
| Dounce Tissue Grinder, 1 ml/7 ml | Wheaton | 357538/357542 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 ml, 40,000 rpm, 285,000 x g | Beckman Coulter | 331302 | |
| Density Gradient Fractionator | Teledyne Isco | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies |
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