このプロトコルは、in vivoでのCNSサンプルのtranslatomeを研究するためにポリリボソーム分画の本質的な変更を示している。これは、結合したRNA画分をリボソームへの全RNAの単離と比較を通じて翻訳と転写制御の全体的な評価が可能になります。
複数のプロセスは、mRNAおよびタンパク質の転写、翻訳および安定性を含む遺伝子発現に関与している。これらのステップの各々は、緊密に、タンパク質存在量の最終的な動力学に影響を与え、調節される。種々の調節機構は、単独で、遺伝子発現の信頼できないインジケータをmRNAレベルを描画、変換ステップに存在する。また、mRNAの翻訳のローカル規制は特に神経生物学での注目の的に「translatomics」をシフトする、神経機能に関与している。提示方法は、トランスクリプトミクスおよびプロテオミクスをブリッジするために使用することができる。
ここでは、複数のリボソームとショ糖勾配での差動沈降に積極的に翻訳されたmRNAの関連付けに基づいてtranslatomeに質問ポリリボソーム分画の技術に不可欠な変更について説明します。伝統的に、特にセントラのin vivoサンプルでの作業lの中枢神経系(CNS)、材料の制限された量および脂肪組織成分の存在のために困難なことが証明されている。これに対処するために、記載されたプロトコルは、特に単一のマウス脊髄および脳の使用によって実証されるように、CNS材料の最小量で使用するために最適化される。簡単に説明すると、CNS組織を抽出し、翻訳をリボソームとmRNAのシクロヘキシミド上に固定化される。ミエリン浮選は、その後、脂質リッチ成分を除去する。分別はmRNAは、そのリボソームの負荷に応じて分離してショ糖勾配上で実行される。単離された画分を新たなゲノムワイドなアッセイ技術を含む下流のアッセイの範囲に適している。
遺伝子発現は、翻訳は最も優勢な効果軸受1と、転写、翻訳およびmRNAおよびタンパク質の安定性の複合作用によって決定される。なお、これらのステップの各々は高度に調節されていることが今や明らかである。マイクロRNAは、RNA顆粒、代替のポリアデニル化および細胞質の形成は、遺伝子発現2,3の転写後調節のいくつかの例である。これらの機構の各々は、翻訳からの転写を脱共役し、関心のある生物系においてプロテオームに影響を与えます。従って、当然、単独でmRNAレベルは、タンパク質レベル4の不完全読み出される。定量的プロテオミクスは、しかし最近の進歩にもかかわらず、感度、タンパク質配列の解決にかなりの制限がまだある、遺伝子発現の最も直接的な評価を提供する。したがってtranslatomeに取り組む、翻訳mRNAのレパートリーは、勉強の間の優れた妥協点を提供していますトランスクリプトームやプロテオーム。これは、最終的な遺伝子発現を評価するトランスクリプトミクスよりも正確で、より高いカバレッジとプロテオミクスよりもシーケンスの解像度の両方を提供します。
哺乳動物系では、翻訳事象の大部分は、キャップ依存性開始介して開始する。一緒に40Sリボソーム小サブユニットと真核生物の開始因子群は、mRNAの5 'キャップに集合。複合体は、mRNAをスキャンして、開始コドンAUGに到達すると、完全な80Sリボソーム形成するために、60Sリボソーム大サブユニットを募集しています。リボソームは伸長因子は、新生ペプチド鎖に装填されたtRNAのアミノ酸の組み込みを補助するとは、mRNAに沿って移動すると伸長段階に進む。複数のリボソームは同時に単一のmRNAに沿って進むことができ、関連するリボソームの数は、タンパク質合成5,6の速度と相関することが示されている。これはTRANのための信頼できる指標をロードするリボソームを作るslation積極的に沈降速度に基づいてmRNAを翻訳するの分離を可能にする。のmRNAの翻訳の定量化に加えて、配列情報は、翻訳調節に関与するモチーフを同定するために得ることができる。また、RNA結合タンパク質および他の翻訳因子は、関連する調節タンパク質の研究および発見を容易にする、異なる画分から単離することができる。
神経系において、翻訳制御は、mRNAの貯蔵、輸送および局所タンパク質合成のようなプロセスに関連している。成長円錐は、軸索7の他の部分とは異なるmRNAの特定のローカライズされたプールを保有することが示されている。また、軸索は局所的にタンパク質8,9を合成する能力を有する。その結果、翻訳の局所制御は、神経生物学の研究の重要な話題になっている。これに対処するポリリボソーム分画の電位に技術が使用された、いくつかの研究で例示されている脊髄開発における軸索ガイダンスを調査し、脳10,11におけるBDNFの活性依存性の翻訳を示した。
ポリリボソーム画は新しい技術ではありませんが、それは特に難しい1のまま。入力された材料に基づく、実質的な最適化が必要であることができる。これは、特に材料の量は、多くの場合、組織成分、翻訳mRNAの単離を妨げる制限および脂肪酸であるインビボ CNS試料の場合である。大部分の公開された分画プロトコルは、酵母または哺乳動物細胞株に対処する、および脳12,13,14のための確立されたプロトコルが存在する。これとは対照的に、脊髄の分別を記述する任意の出版物はほとんど存在しており、以前のプロトコルが15をプールするために多数の動物から脊髄を必要とする。これらの理由から、いくつかの本質的な修飾は、単一のマウス脊髄を含むCNS組織、分別のためのプロトコルを適合させるために行われた。シクロヘキシミドとリボソーム固定化は、ドゥリンリボソームの解離を避けるために、動物の灌流の間に実行されている組織抽出のG長いプロセス。続いて、ポリソームRNAはポリリボソームの収率を最大にするために特定の方法で抽出される。まず、ダウンシングによる組織の制御された均質化は、完全な核を保持し、DNAの混入を防ぐことができます。核はその後、遠心分離により確実に除去されている。洗剤NP-40およびデオキシコール酸ナトリウムの組み合わせは、小胞体およびその膜結合リボソームのリリースの溶解を保証します。また、脂質の豊富なミエリン内の紫外線吸収成分は、ポリリボソームプロファイルを不明瞭。ミエリン浮選は、必要があるようなポリリボソームのような密度の高い化合物は、ペレット化される場合、そのようなミエリンfloatとして軽量化化合物および16を除去した。ポリリボソームは、その後、17.5%〜50%のショ糖勾配上で沈降されています。代わりに、手動で各ショ糖層を積層し、凍結の、グラデーションも勾配ミキサーを用いて調製することができる。酸性フェノール/クロロホルムを用いて画分からのRNAの抽出を可能にするDNAは、最小限の損失でRNAを除去する。しかし、位相反転は(端数16以上)密なショ糖画分で行うことができる。
このプロトコルは、翻訳のレベルに取り組む他の従来の方法に比べて利点を提供します。例えば、リン酸化されたS6(著名な翻訳マーカー)の測定だけでなく、放射性同位元素で発生期の鎖のラベルの両方は、グローバルな翻訳レベルに関する情報を与えるが、特に翻訳されているものに少しを明らかにした。ポリリボソーム分画は、他の一方で、グローバルアセスメント翻訳だけでなくmRNAの翻訳および関連する調節タンパク質の同一性を可能にする。定量的リアルタイムPCRは、選択されたmRNAのうち迅速な読み取りのために単離されたRNA上で行うことができ、マイクロアレイおよび次世代のRNA配列決定は、ゲノムワイド研究のために行うことができる。ここに提示の最適化は、技術が減少するので、CNS組織の最小量で使用することを可能にする必要な動物の数をINGと組織処理時間を短縮することにより、全体的な実験の品質を向上させる。一方、この技術は、翻訳したものからのもの停止状態のリボソームを区別することができない。ストールしたリボソームを運ぶ転写物は、重質留分に沈降し、データを解釈する際に留意すべきである。
リボソームは、細胞型特異的な様式でそれぞれのエピトープタグまたはレポーターで標識し、免疫沈降17,18により単離したmRNAを対応付けた最近報告された技術、すなわちRiboTaqおよびTRAPがあります。この技術は、特定の細胞集団のために読み出さ高い分解能を提供するために分別ポリリボソームに結合することができる。リボソームフットプリントはリボソームによって保護されているmRNAの別の新規な小断片を生成するために、ヌクレアーゼ消化を伴う技法、または「フットプリント」である。ライブラリは、これらの足跡から生成され、配列決定される。このメソッドはPROVIDEの翻訳に対するコドン特異的全ゲノム解析やストールリボソームを識別することができる、非-AUGコドンとポリリボソーム分別19により達成することができない小さな上流のオープンリーディングフレームを開始。しかしながら、ポリリボソーム分画は、高純度の試料がしばしば必要とされるライブラリーを調製するために必要な分子種を富化、単リボソームを含有する消化された断片の単離のためのプロファイリングリボソームに結合することができる。一緒になって、ポリリボソーム分画は、永続的な重要性を持つ柔軟な方法であり、次世代シーケンシングのようなゲノムワイドアッセイを含む、様々なダウンストリームアプリケーションに接続することができる。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、教育研究のドイツ連邦環境省(BMBF)、(システム生物学上のヘルムホルツ·アライアンス)は、癌におけるシグナル伝達のシステム生物学とドイツ癌研究センター(DKFZ)によってサポートされていました。
Hank’s balanced salts solution | Gibco | 14170-138 | |
Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 mL, 14 x 95mm | Beckman Coulter | 331374 | |
Diethylpyrocarbonate | Sigma | D5758 | caution |
Cycloheximide | Sigma | C7698 | danger |
Dithiothreitol | Sigma | 43815 | warning |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 11697498001 | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride solution | Sigma | 93482 | danger |
RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2611 | |
Nonidet P-40 | Roche | 11332473001 | danger |
Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | warning |
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion | AM9722 | danger |
GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
Equipment | |||
Dounce Tissue Grinder, 1mL/7ml | Wheaton | 357538/357542 | |
Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 mL, 40,000 rpm, 285,000 x g | Beckman Coulter | 331302 | |
Density Gradient Fractionator | Teledyne Isco | ||
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies |