Detta protokoll illustrerar väsentliga modifieringar av polyribosome fraktionering i syfte att studera den translatome av in vivo CNS-prover. Det gör att helhetsbedömning av översättning och transkriptionsreglering genom isolering och jämförelse av total RNA till ribosomen bundna RNA-fraktioner.
Flera processer är involverade i genexpression, inklusive transkription, translation och stabilitet av mRNA och proteiner. Vart och ett av dessa steg är hårt reglerad, som påverkar de slutliga dynamiken i protein överflöd. Olika regleringsmekanismer finns på översättningssteget, vilket gör mRNA-nivåer enbart en otillförlitlig indikator på genuttryck. Dessutom har lokal reglering av mRNA-translation varit särskilt inblandad i neuronala funktioner, flytta "translatomics" till fokus i neurobiologi. Denna metod kan användas för att överbrygga transkriptomik och proteomik.
Här beskriver vi viktiga ändringar i tekniken med polyribosome fraktionering, som förhör den translatome bygger på föreningen av aktivt översatta mRNA till flera ribosomer och deras differentiell sedimentation i sackarosgradienter. Traditionellt arbetar med in vivo-prov, i synnerhet av central nervsystemet (CNS), har visat sig vara en utmaning på grund av de begränsade mängder material och förekomsten av fettkomponenter vävnad. För att åtgärda detta är beskrivna protokollet specifikt optimerad för användning med minimal mängd av CNS-material, vilket framgår av användningen av enda mus ryggmärg och hjärna. I korthet är CNS-vävnad utvinns och översätta ribosomer är immobiliserade på mRNA med cykloheximid. Myelin flotation utförs sedan för att avlägsna de fettrika komponenter. Fraktionering utförs på en sackarosgradient där mRNA separeras enligt deras ribosomala lastning. Isolerade fraktioner är lämpliga för en rad efterföljande analyser, bland annat nya genomet bred analystekniker.
Gene expression bestäms av den kombinerade effekten av transkription, translation och stabilitet av mRNA och proteiner, med översättning bär den mest dominerande effekten 1. Det är nu uppenbart att var och en av dessa steg är starkt reglerad. Mikro-RNA, bildning av RNA-granulat, alternativ och cytoplasmatisk polyadenylation är några exempel på posttranskriptionell reglering av genuttryck 2,3. Var och en av dessa mekanismer kopplas transkription från översättning och påverkar proteomen i det biologiska systemet av intresse. Således, föga förvånande, mRNA-nivåer enbart är en ofullkomlig avläsning av proteinnivåer 4. Kvantitativ proteomik ger den mest direkta bedömningen av genuttryck, men trots nya framsteg, finns det fortfarande betydande begränsningar för känslighet och proteinsekvens upplösning. Därför itu med translatome, repertoar översätta mRNA, erbjuder en utmärkt kompromiss mellan att studeratranskriptom-och proteom. Det är mer exakt än transkriptomik att bedöma slut genuttryck, och ger både högre täckning och sekvens upplösning än proteomik.
I däggdjurssystem, majoriteten av händelser översättnings börja via cap-beroende inledande. En grupp av eukaryota initieringsfaktorer tillsammans med 40S lilla subenheten montera vid 5'-cap av ett mRNA. Komplexet skannar sedan mRNA och på att nå startkodonet augusti, rekryterar den 60S ribosomens stora subenhet för att bilda en komplett 80S ribosomen. Förlängningen scen fortsätter med ribosomen rör sig längs mRNA, med elongeringsfaktorer bistå inkorporeringen av aminosyror från laddade tRNA till den begynnande peptidkedjan. Flera ribosomer kan fortsätta längs en enda mRNA samtidigt och antalet associerade ribosomer har visats korrelera med graden av proteinsyntes 5,6. Detta gör ribosomala lastning en pålitlig indikation för translation och möjliggör separation av aktivt översätta mRNA baserade på sänkan. Förutom kvantifiering av översätta mRNA, kan sekvensinformation fås att identifiera motiv som är involverade i översättning reglering. RNA också bindande proteiner och andra faktorer översättnings kan isoleras från olika fraktioner, underlätta studier och upptäckten av besläktade reglerande proteiner.
I nervsystemet, har translationell kontroll varit kopplade till processer såsom mRNA lagring, transport och lokal proteinsyntesen. Tillväxt kottar har visat sig hysa en viss lokal pool av mRNA skilda från resten av axonet 7. Dessutom axoner besitter förmågan att lokalt syntetisera proteiner 8,9. Som ett resultat har lokal kontroll av översättning blivit en viktig fråga för studier i neurobiologi. Potentialen hos polyribosome fraktione att åtgärda detta har visats i ett flertal studier, vid vilken teknik användes för attundersöka axon vägledning i ryggmärgen utveckling, och visade den aktivitetsberoende översättning av BDNF i hjärnan 10,11.
Även polyribosome fraktionering är inte en ny teknik, är det fortfarande ett särskilt utmanande. Baserat på insatsmaterial, kan betydande optimering vara nödvändig. Detta gäller särskilt för in vivo CNS-prov, där mängden material är ofta en begränsning och fet vävnadskomponenter hindra isolering av översätta mRNA. Mest publicerade fraktioneringsprotokoll behandlar jäst eller däggdjurscellinjer, och det finns etablerade protokoll för hjärnan 12,13,14. Däremot finns det knappt några publikationer som beskriver fraktionering av ryggmärg, och tidigare protokoll kräver ryggmärgen från ett stort antal djur som skall sammanslagna 15. Av dessa skäl har flera väsentliga modifieringar göras för att anpassa den fraktione protokoll för CNS-vävnad, inklusive enda mus ryggmärg. Ribosomen immobilisering med cykloheximid utförs under djur perfusion för att undvika dissociation av ribosomer During den långa processen av vävnad extraktion. Därefter polysomal RNA utvinns på ett specifikt sätt för att maximera polyribosome avkastning. Först kontrolleras homogenisering av vävnaden genom douncing, håller kärnan intakt och förhindrar DNA-kontaminering. Kärnan avlägsnas därefter tillförlitligt genom centrifugering. Kombinationen av de detergenter NP-40 och natriumdeoxicholat säkerställer lys av det endoplasmatiska retiklet och frisättning av dess membranassocierade ribosomer. Dessutom, UV-absorberande komponenter inom lipid rika myelin skymma polyribosome profilerna. Myelin flotation är därför nödvändigt, där täta föreningar såsom polyribosomer pelleteras och lättare föreningar såsom myelin float och tas bort 16. Polyribosomer sedan sediment över en 17,5% till 50% sackaros lutning. Istället för att manuellt skiktning och frysa varje sackaros lager, kan övertoningar också framställas med en lutning mixer. Extraktion av RNA från fraktioner med användning av sur fenol / kloroform tillåter DNA tas bort med minimal RNA förlust. Dock kan fas inversion uppstå vid täta sackaros fraktioner (ovan fraktion 16).
Detta protokoll ger fördelar jämfört med andra konventionella metoder som behandlar nivån på översättning. Till exempel, både mätning av fosforyleras S6 (en framstående översättnings markör) samt märkning av begynnande kedjor med radioisotoper ger information om globala översättningsnivåer men avslöjar lite om vad som specifikt översätts. Polyribosome fraktionering, å andra sidan, gör det inte bara bedömning av global översättning, utan även identiteten på översätta mRNA och de relaterade regulatoriska proteiner. Kvantitativ realtids-PCR kan utföras på isolerade RNA för en snabb läsning av utvalda mRNA, och microarrays och nästa generation RNA-sekvensering kan utföras för genomet breda studier. De optimeringar som presenteras här tillåta den teknik som ska användas med minimala mängder av CNS-vävnad, därför minskaning av antalet djur som behövs och förbättra den totala experiment kvalitet genom att minska vävnads handläggningstiden. Å andra sidan kan denna teknik inte skilja avstannat ribosomer från översätta sådana. Avskrifter bär strandade ribosomer sedimenterar i de tunga fraktionerna, och detta bör hållas i minnet vid tolkningen av data.
Det finns senare rapporterade tekniker, nämligen RiboTaq och TRAP, där ribosomer är märkta med epitopmärkningar eller reportrar respektive i en celltyp specifika sätt och tillhörande mRNA isoleras genom immunoutfällning 17,18. Denna teknik kan vara kopplad till polyribosome fraktionering för att erbjuda hög upplösning utläses för specifika cellpopulationer. Ribosomen fot-utskrifter är en annan ny teknik som innebär nukleasklyvning att generera små fragment, eller "fotspår", av mRNA som skyddas av ribosomer. Biblioteken är sedan genereras från dessa fotspår och sekvenseras. Denna metod PROVIdes ett kodon specifik hel genomanalys på översättning och kan identifiera strandade ribosomer, icke-augusti startar kodon och små uppströms öppna läsramar, som inte kan uppnås genom polyribosome fraktione 19. Emellertid kan polyribosome fraktione kopplas till ribosomen profilering för isolering av spjälkade fragmenten innehållande ensamma ribosomer och därigenom anrika för de molekylära arter som krävs för biblioteket beredning i vilken hög prov renhet krävs ofta. Sammantaget är polyribosome fraktione en flexibel metod med varaktig betydelse och kan kopplas till olika efterföljande tillämpningar, inklusive genomet breda analyser som nästa generations sekvensering.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF), den systembiologi för Signalering i Cancer (Helmholtz Alliance på Systembiologi) och den tyska Cancer Research Center (DKFZ).
Hank’s balanced salts solution | Gibco | 14170-138 | |
Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 mL, 14 x 95mm | Beckman Coulter | 331374 | |
Diethylpyrocarbonate | Sigma | D5758 | caution |
Cycloheximide | Sigma | C7698 | danger |
Dithiothreitol | Sigma | 43815 | warning |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 11697498001 | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride solution | Sigma | 93482 | danger |
RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2611 | |
Nonidet P-40 | Roche | 11332473001 | danger |
Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | warning |
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion | AM9722 | danger |
GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
Equipment | |||
Dounce Tissue Grinder, 1mL/7ml | Wheaton | 357538/357542 | |
Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 mL, 40,000 rpm, 285,000 x g | Beckman Coulter | 331302 | |
Density Gradient Fractionator | Teledyne Isco | ||
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies |