Summary
本协议描述为同步功能磁共振成像和深部脑刺激在啮齿动物的标准方法。这些实验工具的结合使用使得全球下游业务的探索响应电刺激在几乎所有的大脑目标。
Abstract
为了形象化全球和下游神经元对脑深部电刺激（DBS）在不同的目标，我们已经开发了一个协议，用于使用血氧水平依赖（BOLD）的功能磁共振成像（fMRI）与星展同时啮齿动物形象。星展功能磁共振成像提出了一些技术挑战，包括电极植入的准确性，由电极，选择麻醉和麻痹的创建，以尽量减少任何神经元的影响，同时消除了动物的运动，并维持生理参数的MR文物，偏离它可以混淆BOLD信号。我们实验室已经开发出一套能够克服大多数这些可能出现的问题的程序。对于电刺激，一个自制的双极钨微电极时，在刺激部位在麻醉学科插入立体定位。在准备成像，老鼠被固定在一个塑料头盔和转移到磁铁孔。扫描时镇静和麻痹，右美托咪和泮库溴铵的鸡尾酒不断注入，随着异氟醚的最小剂量，这最大限度地减少准备挥发性麻醉药的BOLD天花板效应。在这个例子中实验，丘脑底核（STN）的刺激产生这是在同侧皮层区域主要是观察集中在运动皮层BOLD信号。同时DBS和功能磁共振成像允许的神经回路的调制明确依赖于刺激位置和刺激参数，并允许自由观察区域偏见的神经调制的。这种技术可以用来探索在几乎任何脑区的神经调制电路的下游效应，对实验和临床DBS影响。
Introduction
确定神经回路活动的全球下游效应代表了系统神经科学许多领域的一个重大挑战和目标。工具贫乏当前可用以满足这种需要，并因此存在于相应的实验设置的提高可访问性的要求。一种这样的方法，用于评估神经电路激活的全局结果依赖于同时应用脑深部电刺激（DBS）和功能性磁共振成像（fMRI）。 DBS-fMRI的允许的下游响应于一个空间尺度大电路激活的检测，并且可以在几乎任何刺激靶被应用。这个工具是非常适合平移临床前研究，包括反应治疗高频率的刺激表征。
除了获得合适的MRI扫描仪，成功DBS-fMRI的实验需要考虑许多variabl的ES，包括电极类型，镇静方法和维护生理参数。例如，电极的选择应基于与刺激功效（ 例如 ，引线尺寸和电导，单-与双极性），以及MR兼容性和电极的工件尺寸的因素。电极工件根据电极的材料和尺寸，以及所使用的扫描序列有所不同;彻底预实验测试应采用确定每个研究合适的电极类型。一般情况下，钨电极微丝推荐此协议。麻痹和镇静药的选择应以有效地固定在动物和减少某些镇静剂对血氧水平依赖（BOLD）信号的抑制效果。最后，重要的是维持动物在最佳的生理参数，包括体温和血氧饱和度。
我们已经开发了星展银行的协议- 功能磁共振成像克服了这些潜在的障碍，并在我们的手中，可以提供强大且一致的结果。此外，这些实验程序可以很容易地采用功能磁共振成像与另类的刺激方法，包括光遗传学刺激的组合。
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Protocol
伦理声明：此程序是按照健康指引的动物研究（指南实验动物的护理和使用）的国家机构，并获北卡罗来纳机构动物护理和使用委员会的大学。
1。电极植入
第一步是电极植入。在此步骤中，将电极单方面注入底丘脑核（STN），小核与使用以下方法帕金森氏病治疗的平移意义：
- 这是一个短期的生存术，因而无菌技术是必不可少的：使用高压釜，或消毒液高压灭菌的地方是不可能的（ 如电极不育） 注意消毒所有的手术设备。手术后，动物可以经过一个短暂的复苏期（48小时）或最多几个星期成像后。
- 麻醉大鼠（成年SD大鼠250-400克）用2.5％异氟醚通过气管插管和小动物呼吸机管理。修复大鼠的立体定向手术框，并使用无菌技术准备手术部位。
- 准备并确保电极是无菌的。自制的双通道钨微丝电极用于此过程中，尽管许多MRI兼容电极类型将工作。所用的电极类型可能影响组织的由过程，组织的刺激区域，植入的准确度，机械的损伤的区域，从而影响了整体的实验结果。如果电极类型是不能够进行高压灭菌，用聚维酮碘的消毒灭菌的电极，只要是可能的。
- 用剪刀取出头皮过植入部位的直径为大约1.5厘米，揭露前囟和lambda头骨上。去除肌肉和筋膜覆盖在颅骨并停止使用所有电灼止血。
- 划伤颅骨表面在用手术刀沿多个方向，以提高牙科用粘固剂粘合性（步骤1.8）。级前囟门和Lambda在水平方向上。
- 要针对STN，在3.6毫米后到前囟门和2.5mm的横向中线，用小尖电钻创建一个钻孔尺寸约为直径1.5毫米注：STN的参考中的确切位置，立体坐标可通过大鼠品系，体重和性别而变化。同性别的成年大鼠，应尽量减少使用中的位置的任何变化。如果可能的话，预操作解剖扫描术或电记录应被用来确定在一个单独被摄体基础的STN位置。此外，电极终端站点应组织学验证，以确保目标的准确性。
- 认真做一个切口在硬脑膜，并用小钝钳硬脑膜移动到第两侧Ë孔。用无菌棉浸泡在盐水停止任何出血。创建孔，用于一个或多个MR兼容的螺丝），轻轻地插入它们在颅骨直到它们是稳定的。螺钉可以被放置在它们不会破坏放置在外部连接器，用于对DBS电极的任何位置（ 例如 ，不直接背后的STN同侧的电极）。我们推荐的展示位置在头骨的侧边，非常直接后路给lambda缝合。在这一点上，头骨比较厚，减少了螺丝会损坏皮质的可能性“。 注意：切4-5毫米的长度黄铜螺丝是用来在这个协议中，虽然塑料螺丝也适用。
- 放置在立体定位臂的电极，以确保它是直的和竖直的。触摸电极前囟门，然后将电极正是3.6毫米后到前囟门和2.5mm的横向中线和触摸皮质表面用电极。从皮质表面，腹部插入电极7.8毫米。这些坐标是参考一个神经解剖学图谱1确定。
- 将一层牙科水泥在颅骨包括颅骨螺钉和电极插入点。等到水泥是从立体定位框架取出电极之前完全硬化。弯曲电极向后和使用额外的水泥覆盖电极系和连接器的耐用性的其余部分。
2。功能磁共振成像准备
第二步是设置的功能磁共振成像，包括生理监测设备的线圈和设置的定位。
- 保护动物的头，以防止在扫描过程中移动注：自定义塑料耳内杆系统在这里用于头部固定。将棒插入耳道，并固定到头盔使头部转动顺畅在日Ë垂直方向，没有水平旋转。通过固定上齿向装置固定头位置。
- 完全麻醉大鼠和监测呼气末二氧化碳 ，以确保在所有扫描的稳定性。维持麻醉，通风和控制呼气末二氧化碳在扫描期间2层 ，结合一个异氟烷蒸发器的MR兼容的小 动物的通风系统是用在这里，虽然以类似的方式，可以使用多种麻醉剂和镇静药。呼吸用适当的音量，大约500毫升/分钟的空气作为起始体积设定为45次/ min。异氟醚设定为2％，而大鼠转移到扫描室。装上呼吸机的输出到老鼠的气管插管，并按下牢牢固定。 Capnometry应该使用作为紧密相连的气管导管连接器尽可能管被收购。调节通风量，以产生2.6％的呼气末二氧化碳至3.3％。 使用MR兼容的小动物保持器插入到大鼠用循环热水浴的温度控制在扫描仪。用胶带将浴垫到容器，并使用干净的吸水纸覆盖它。将鼠到热水床。
- 温度和二氧化碳含量的监测是必不可少的BOLD功能磁共振成像，而动脉血氧饱和度和心脏率也是有用的生理参数。插入的MR兼容的直肠温度探头，并将其带至尾基部，然后调整水浴的温度，以维持正常的体温在37°C。监测使用小动物脉搏血氧饱和度的系统，保持它们在95〜98％和250-350 BPM，分别可以根据所使用的麻醉剂的类型而变化的动脉血氧饱和度和心脏速率。血氧饱和度和心脏速率均由麻醉，通风量和通风量的深度影响。通风量和速度可能需要仔细平衡，以维持足够的潮气末二氧化碳水平和充足的血氧饱和度。
- 表面线圈所需要的功能磁共振成像BOLD收购。将表面线圈尽可能靠近头的表面成为可能。一旦固定，将牙膏头部上的水泥盖的表面上，以减少邻近脑表面敏感伪影注意 ：我们使用自制的收发表面线圈具有约1.6厘米的内部直径，虽然较大的表面线圈可以是用于优化在更深的皮层下区域中的BOLD响应。
- 刺激电极连接到一个可编程的电刺激系统注 ：我们使用一个定制的可编程的TTL触发系统连接到一个双极刺激，提供从MR扫描同步到射频激发电脉冲。
- 对于fMRI数据采集过程中镇静和麻痹，使用右美托咪的鸡尾酒（0.1毫克/公斤/小时，IP）和泮库溴铵（1毫克/千克/小时，IP），联合小剂量异氟醚0.5％，以防止癫痫活动2。用于药物输注，一个MR兼容的注射器泵必须如果泵被放置在磁场环境中使用。可替换地，非相容泵可放置提供了延长的导管管被使用的磁性环境之外。
3。功能磁共振成像数据采集
第三步是磁共振成像采集，包括定位，匀场，解剖扫描和功能性扫描。阿9.4特斯拉系统用自制的表面线圈是用在这里，虽然该技术可以适用于其它高场系统和商业上取得的MRI线圈。
- 将大鼠放入扫描仪和位置在磁铁的中心。使用三平面跟踪图像来精确居中大鼠磁铁内相对于感兴趣的大脑区域，并FASTMAP垫补到均质nize磁场在感兴趣的区域。
- 使用矢状T2加权RARE序列（FOV，2.56 x2.56厘米2;矩阵尺寸，256×256，层厚1.5毫米，TR / TE，1500至1511年质谱; RARE因子，8;翻转角，180°）找到前连合的位置，并对准后续图像到这个位置。对齐八片单杆GE-EPI扫描（FOV，2.56 x2.56厘米2，矩阵的大小，96×96，重建到128×128，层厚，1毫米; TR / TE，1000年至1014年MS）这一点与冠状方向。
- 对于功能的扫描，可使用70个连续EPI扫描与同步的刺激输出1第二时间分辨率，设置为20秒的休息，10秒的刺激，其次是40秒休息。允许的最小扫描间90秒，以允许对神经血管的恢复。掌握在每个刺激参数的多个重复扫描通过平均来提高信号的信噪比。使用一系列假的扫描（通常4-8）来扫描降噪前夕。确认BOLD响应在图像采集的时间，以确保实验的成功使用在第4节中描述的方法，虽然平均，配准和头骨剥离可在此设置可以跳过。
- 经过功能扫描完成后，使用T2加权稀土自旋回波序列（FOV，2.56 x2.56厘米2，矩阵的大小，256×256，层厚1毫米; TR / TE，三十三分之二千五百毫秒，平均，8 ）来测量体内的电极的解剖位置。获取多个冠状和矢状切片来测量沿前/后，内侧/外侧和背/腹轴的工件电极的尖端，并确认电极放置。高分辨率磁共振显微镜（FOV，1.8×1.28厘米;矩阵尺寸，360×256，层厚为0.5毫米; TR / TE，2500/12.6质谱; RARE因子，8;平均值，280）可以被用来检查电极道的去除对于后精确位置到附近的神经解剖结构，并确认电极放置3的精度。
4。功能磁共振成像数据处理与分析
第四步是处理和fMRI数据，包括产生的响应图和百分比BOLD信号变化的计算分析。在计算环境运行（ 如 MATLAB）或商业功能磁共振成像软件工具（ 例如 ，SPM，FSL，或AFNI）自定义程序可以使用。
- 与图像配准和数据的平均个体内通过频率初开始，其次是跨学科注 ：我们做到这一点使用SPM的代码。
- 剥离用权益手动定义区域（ROI）与信号阈值以消除非脑组织进行颅骨。自动颅骨剥离算法都可以使用。
- 通过计算血氧清晰度之间的关系的相关系数编译响应图ponse随着时间的推移和刺激范式为每个体素。延迟范式几秒钟来考虑延迟血流动力学反应可能是必要的。以P设定显著水准<0.05 Bonferroni校正后。其他的统计方法可以采用。修正使用随机场论或群集级别的修正基于高斯随机场多重比较来代替Bonferroni校正更敏感的分析4来执行注 ：根据目标脑区的血流动力学延迟可能会有所不同，药物制剂使用，和生理参数。至关重要的是，为了防止受试者内与受试者间变异性控制这些参数。
- 通过定义的ROI提取时间进程的数据量化BOLD响应。在相同的解剖结构平均在所有体素的百分比信号变化。采用一般线性模型体素明智的分析也可以用于5。
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Representative Results
根据在与植入到右侧的底丘脑核刺激电极的单个大鼠上述协议购入代表的功能数据。基本设置为星展银行的fMRI图像采集的示意图在图1中提供。刺激施加与上述协议相一致，以0.3毫安，130赫兹，0.09毫秒的脉冲宽度的频率的振幅。同侧运动皮层的鲁棒激活已使用该协议与丘脑底核的刺激目标一致可视化。用方波刺激模式，BOLD信号将预计相对于基线（未刺激状态）与一个时间过程相关的刺激周期进行调制。这里正BOLD响应于预期的脑区域（ 图2）中，用一个ON / OFF图案良好相关性的刺激范式观察到，考虑到一简要血流动力学延迟（ 图3）。从图 （ 图2）中 ，以重叠的神经解剖学图谱1可以被用于定义感兴趣的精确区域在个人大脑区域进行比较的BOLD效应。用于STN DBS在运动皮质的BOLD响应示于图3中 ，虽然关心区域可以被放置在任何脑部区域。这些反应然后可以扫描，然后在科目之间要识别制造刺激一致的响应大脑区域之间的平均值。针对其他神经解剖结构可能会产生不同的反应模式比在本实验中所示。此外，在电极放置即使是很小的程度的不准确性可能会产生较大的差异响应，如电极类型和电刺激参数5月3日的差异。
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图1。方案的基本功能磁共振成像的配置与表面线圈，电极位置和刺激同步。
图2。标有从单一的动物相关系数，用后到前片代表EPI图像显示左到右。颜色条表示相关系数在每个体素。
图3。典型％BOLD了从单一的动物的平均时间在多个扫描在相同的刺激参数：0.4毫安，130赫兹，0.09毫秒的脉冲宽度黄色条表示的，其中的刺激施加到丘脑下核的时间段。投资回报率是在运动皮层注意：这些刺激参数是在标准范围内为星展银行在STN，但可能需要进行修改，替代的刺激部位。
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Discussion
同时DBS和功能磁共振成像是一个有希望的实验工具包的全球下游反应，神经回路刺激的识别和表征， 在体内 。这种技术比其它可用的工具，如电生理记录的主要优点在于，功能磁共振成像，由此大量不同区域的脑组织可在任何靶检查其响应于DBS的相对中立性质。虽然所描述的协议是专用于DBS-fMRI的大鼠，DBS响应的神经影像也已成功地在其他模式生物，包括猪6进行。
也许这种技术是最明显的应用是DBS的适用治疗某些神经和精神障碍， 例如建模。帕金森氏病7-9。在帕金森氏症患者中，高频率的刺激在任的subthalamic核（STN）或内苍白球（GPI）是有效的许多运动症状10缓和。高频DBS在任一这些目标的结果在这两个典型的马达和边缘区域S6内大量的活化。这些空间上的动态磁共振成像响应的表征，当由行为分析的补充，可有助于治疗DBS电路的识别。从这些研究中得出的结论应该很容易转化为诊所，专门为星展银行在现有的目标和星展延伸到各种疾病和病症的新目标细化。
功能磁共振成像的一般限制已经被广泛审阅其他地方11，虽然有几个具体的限制，特别是相关的DBS-fMRI的。星展银行可能会导致可能无法充分解决了功能磁共振成像在细胞活动12暂时动态变化。对于需要更精细的实验时间分辨率比目前可以通过功能磁共振成像单独提供的，我们建议电生理记录，这可能与功能磁共振成像13-15一并收购。另外一个问题是关于响应神经活动16-21观察到的复杂的BOLD信号。功能磁共振成像允许的星展调制区的检测，但应谨慎推断这种调制单独的基于fMRI数据的方向时服用。多种功能磁共振成像方式（ 如粗体，脑血流量，脑血容量，功能连接和锰增强MRI），以及电生理和病理数据的应用，应加强这方面的结论。
许多在这个协议提供的详细信息可以很容易地采用另类的刺激方法，包括光遗传学靶向22。对于光遗传学实验，激光驱动器可与刺激的软件接口来获得TTL触发的拉斯呃脉冲。对于这样的实验中，用适当长度的接线电缆，以使光纤可联接到位于扫描器房间外的激光驱动器是很重要的。光的fMRI允许的遗传背景明确，细胞群内由活动的选择性调制引起的，而电DBS-fMRI的反应不能容易地归因于招募具体电路的神经血管变化的检测。然而，电星展银行很可能为研究治疗DBS，该公司仅依赖于电刺激在患者群体较大的平移值。
担忧的安全性和局部组织损伤是重要的考虑因素，同时与DBS在临床和动物研究设置神经影像学，并已广泛讨论其他地方（卡迈克尔23,24）。虽然许多MRI序列具有引起显著加热和组织损伤的可能性，刺激参数一第二在这个协议的扫描序列的设计，以尽量减少这些因素的影响，每个扫描序列的特别休息时间之间的长度。因此，几十扫描后的反应，以刺激是一致持久的试点研究，以及局部组织损伤的迹象都看到验尸成像，确认该协议是安全的问候当前的交付和使用的电极磁共振兼容性。
所描述的DBS-fMRI的过程，再加上丰富的应对星展提供了关于区域调制模式信息的灵活性，使这个过程非常适用于各种的系统级神经科学的应用。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢Shaili桑杰·贾和希瑟Decot与拍摄服务。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane (Forane) | Baxter | 1001936060 | |
| Dexmedetomidine (Dexdomitor) | Pfizer | 145108-58-3 | |
| Pancuronium Bromide | Selleckchem | S2497 | |
| 9.4 T Small Animal MRI | Bruker | BioSpec System with BGA-9S gradient | |
| Sterotactic Frame | Kopf | Model 962 | |
| Small Animal Ventilator | CWE, Inc. | 12-02100 | Model SAR-830 |
| Dental Cement | A-M Systems | 525000 | Teets Cold Curing |
| MouseOx Plus System | STARR Life Science Corp. | ||
| Capnometer | Surgivet, Smith Medical | V9004 Series | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | Model A365 | |
| MR-compatible Brass Screws | McMaster Carr | 94070A031 | 0-80 thread size, 1/4 in. Can be cut to desired length. |
| Tungsten Wire | California Fine Wire Company | 100211 | Used to construct MR-compatible stimulating microelectrode |
| Syringe Pump | Harvard Appartus | Model PHD 2000 (not MRI-compatible) |
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