Summary
نحن هنا وصف سير العمل بسرعة لتحليل واستكشاف مجموعات من الصور مضان المجهري باستخدام PhenoRipper، منصة تحليل الصورة وضعت مؤخرا.
Abstract
على الرغم من التقدم السريع في الإنتاجية العالية المجهري، كمي المقايسات الصورة القائمة لا تزال تشكل تحديات كبيرة. في حين أن مجموعة متنوعة من أدوات تحليل الصور المتخصصة المتاحة، معظم سير العمل التقليدية القائمة صورة التحليل بوجود منحنيات التعلم حاد (لضبط المعلمات التحليل) وينتج في أوقات التحول الطويلة بين التصوير والتحليل. على وجه الخصوص، وتجزئة الخلية، وعملية تحديد الخلايا الفردية في صورة، هو عقبة رئيسية في هذا الصدد.
هنا نقدم بديل، الخلية خالية من تجزئة العمل على أساس PhenoRipper، وهو منصة البرمجيات مفتوحة المصدر مصممة لتحليل السريع واستكشاف الصور المجهري. هو الأمثل لخطوط الأنابيب المعروضة هنا للصور المناعي المجهري الثقافات الخلية ويتطلب الحد الأدنى من تدخل المستخدم. في غضون نصف ساعة، ويمكن PhenoRipper تحليل البيانات من تجربة 96 جيدا نموذجية وتوليد ملامح الصورة. يمكن للمستخدمينثم بصريا استكشاف البيانات الخاصة بهم، وأداء مراقبة الجودة على تجربتهم، وضمان استجابة للاضطرابات والتحقق من استنساخ مكررات. هذا يسهل دورة التقييم السريع بين التحليل والتجربة، وهو أمر حاسم خلال الفحص الأمثل. هذا البروتوكول هو مفيد وليس مجرد تحليل مرور الأول لمراقبة الجودة، ولكن أيضا يمكن أن تستخدم كحل نهاية إلى نهاية، وخاصة بالنسبة للفحص. سير العمل الموصوفة هنا إلى جداول مجموعات كبيرة من البيانات مثل تلك الصادرة من شاشات عالية الإنتاجية، ولقد ثبت لظروف تجريبية بواسطة مجموعة النمط الظاهري بدقة أكثر من مجموعة واسعة من النظم البيولوجية. يوفر واجهة بديهية PhenoBrowser إطارا لاستكشاف الفضاء المظهري وتتصل خصائص الصورة إلى الشروح البيولوجية. أخذت معا، فإن بروتوكول الموصوفة هنا خفض الحواجز التي تحول دون اعتماد التحليل الكمي للشاشات الصورة القائمة.
Introduction
على مدى العقد الماضي، أعطت التقدم السريع في تكنولوجيا التصوير العديد من مختبرات القدرة على أداء عالية الإنتاجية المجهري. تحول التحدي الآن من واحدة من التصوير إلى واحد من التحليل. كيف يمكننا أن تميز، قارن، واستكشاف سيل من الظواهر المعقدة حتى الآن خفية إنشاؤها بواسطة عالية الإنتاجية الشاشة التصوير نموذجية؟
وقد منح عدد من منصات صورة التحليل والمعلوماتية مستخدمين أدوات العمل المتطورة 1-3 لاستخراج المعلومات البيولوجية من مجموعات كبيرة من الصور. ومع ذلك لا تزال هناك الكثير من العقبات كبيرة في تحليل البيانات من على شاشات الصورة القائمة على الإنتاجية العالية. الصعوبات التي ينطوي مع اختيار الأوصاف المناسبة للصور وضبط من المعلمات حسابي (لنظام الفائدة) غالبا ما تؤدي في أوقات الإعداد الطويلة، لا سيما بالنسبة للمستخدمين بدون خبرة صورة التحليل. على وجه الخصوص، وتجزئة الخلية، وعملية تحديد الخلايا الفردية فين الصورة، هو عقبة رئيسية في هذا الصدد. تجزئة يمكن أن تكون حساسة للغاية لمعلمات التجريبية مثل نوع من الخلايا، كثافة الخلية وعلامات الحيوية، وكثيرا ما يتطلب التكيف المتكررة لمجموعة البيانات الكبيرة. لهذه الأسباب، تحليل الصور غالبا ما يكون خطوة مستقلة، محطة يؤديها المتخصصين بدلا من جزءا لا يتجزأ من سير العمل التجريبية. هذا ما يحول دون دورة التقييم السريع بين التحليل والتجربة، جزءا أساسيا من التنمية الفحص.
نحن هنا وصف سير عمل البديلة التي هو الأمثل لارتفاع الإنتاجية مضان المجهري ويتجنب العديد من الصعوبات المذكورة آنفا. تحقيقا لهذه الغاية، ونحن الاستفادة من PhenoRipper 4، منصة برمجيات المصدر المفتوح للاستكشاف وتحليل الصور المجهري السريع. بشكل ملحوظ، PhenoRipper يتجنب العديد من التحديات التي ينطوي مع تجزئة الخلية من خلال عدم محاولة التعرف على الخلايا واحد. بدلا من ذلك، PhenoRipper يقسم الصور إلى بكسلكتل من حجم التحت خلوية وتميز في الصور من حيث الكتل التي تحتوي عليها. على وجه التحديد، لمحات PhenoRipper كتل من حيث المستندة إلى colocalization علامة الميزات وتلقائيا يحدد 4 أنواع كتلة الأكثر تمثيلا في الصور التدريب. PhenoRipper ثم يعين على كل كتلة الأكثر مماثلة نوع كتلة ممثل، وأخيرا الصور يميز على أساس أنواع من الكتل التي تحتوي عليها.
بالمقارنة مع النهج القائم على خلية واحدة أكثر تقليدية، وهذا النهج يتطلب الحد الأدنى من ضبط والخبرة ما يرام. على هذا النحو، يحتاج المستخدمون فقط إلى وضع معلمتين: حجم كتلة وكثافة عتبة (لتجاهل أجزاء noncellular من الصورة)، وكلاهما مع مجموعة ردود الفعل الرسومية. الأهم من ذلك، وقد تبين سير العمل الموصوفة هنا 4 لتوسيع نطاق بسهولة إلى مجموعات البيانات أكبر من ذلك بكثير، حيث السرعة والحد الأدنى من ضبط يوفر وقتا كبيرا ومكاسب الموثوقية. في الممارسة العملية، نجد أن هذا التطبيقصرصور يقلل من الوقت اللازم لإعداد كل من وتشغيلها بواسطة أوامر متعددة من حجم 4.
الناتج الرئيسي لPhenoRipper هو تمثيل مرئي للصورة التشابه، والتي تمكن المستخدم لتحديد مجموعات من الظروف التجريبية التي تسبب الخلايا لعرض الظواهر المشابهة. التجمعات PhenoRipper يجد عادة ما يكون مقارنة "للتفسير البيولوجي" لتلك التي تم إنشاؤها بواسطة أكثر من ذلك، أساليب خلية مقرها تستغرق وقتا طويلا 4. في الممارسة العملية، وهذا يعني أن في كثير من الأحيان، في غضون نصف ساعة من إجراء 96 تجربة جيدة مضان المجهري نموذجي، وهو مجرب بدون خبرة سابقة الصورة التحليل يمكن الحصول على قراءات موثوقة حول أداء التجربة له أو لها. يمكن المجرب ثم البدء في استكشاف العلاقات بين ظروف تجريبية مختلفة وتتعلق هذه العلاقات إلى الظواهر الصورة.
ونحن لشرح سير العمل هذا هنا من خلال تحليل الآثارالمخدرات في صفوف الآلية واضحة على خلايا هيلا ملطخة عن علامات الحمض النووي وهيكل الخلية. تم تجميع الصور من الخلايا تعامل مع نفس الفئة من الأدوية معا، وظهرت الصور رديئة الجودة (تلطيخ التحف، للخروج من خلايا التركيز وهلم جرا)، والقيم المتطرفة، مما يجعلها سهلة لتحديد ويحتمل تجاهل.
في حين أن هذا العمل مفيد لعدد كبير من المقايسات الصورة القائمة، وهناك العديد من الحالات التي يكون فيها بوضوح نهجا مختلفا من المحتمل أن تكون أكثر إفادة. على سبيل المثال، الإخراج من PhenoRipper هو في المقام الأول مقارنة النسبية للأنماط مضان عبر الظروف التجريبية. إذا كان مطلوبا لتوصيف المطلقة سمة محددة خلية واحدة بدلا من ذلك (على سبيل المثال عدد البقع في خلية)، سوف تكون هناك حاجة إلى تحليل واحد المستندة إلى الخلية. مع ذلك، وحتى في هذا النوع من الحالات، ومن المرجح أن كشف التغيرات في هذه الظواهر وحيدة الخلية، وبالتالي PhenoRipper أن تكون أداة مفيدة لفحص الأمثلmization.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد العينات والتصوير
- خلية ثقافة
- تقسيم الثقافات بشكل روتيني والحفاظ على 20-70٪ التقاء. يوم واحد قبل التجربة، وتنمو خلايا هيلا في DMEM (Dulbecco لتعديل النسر متوسطة، انظر جدول المواد) وتستكمل مع FBS 10٪ (مصل بقري جنيني) و 1X البنسلين / الستربتوميسين.
- في يوم من التجربة، وخلايا الانقسام المتزايد في الثقافة (حوالي 50٪ متموجة).
- غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني (الفوسفات مخزنة المالحة)، تعرض إلى حوالي 2 مل من التربسين / EDTA (حمض Ethylenediaminetetraacetic) لبضع ثوان. نضح الزائدة التربسين / EDTA والحفاظ على خلايا استحم في طبقة رقيقة من التربسين / EDTA في غطاء محرك السيارة على RT ل~ 3 دقائق.
- ميكانيكيا يهز القوارير مرتين وفصل الخلايا مع المصل تستكمل وسائل الإعلام. عد الخلايا وتضعف إلى 5،000 cells/50 ميكرولتر من وسائل الإعلام وعلى الفور لوحة 50 ميكرولتر / جيد على لوحة الزجاج 384 جيدا أسفل باستخدام الروبوت الآلي التعامل مع السائل (فقط 30 جيدوتستخدم لوحة من ليالي هنا).
- احتضان لوحة في RT لمدة 30 دقيقة لتقليل آثار الحافة في الآبار 5. بعد لوحات RT الحضانة، والمكان في 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 حاضنة بين عشية وضحاها.
- سيتم يعاير كل المخدرات في مكررة. إضافة 25 ميكرولتر من المخدرات إلى الآبار المقابلة على لوحة تحتوي على وسائل الإعلام بالفعل.
- إصلاح اللوحة مع 4٪ محلول بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني في 24 العلاج من تعاطي المخدرات آخر ساعة.
- تلطيخ
يتم سرد الأجسام المضادة المحددة الابتدائية، والأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى والبقع الفلورسنت الأخرى التي تم استخدامها هنا في جدول المواد.- Permeabilize خلايا ثابتة مع 0.2٪ تريتون X-100 الحل في TBS (المالحة تريس مخزنة) لمدة 3 دقائق، وتغسل مع TBST (المالحة تريس مخزنة + توين 20) 3X. إضافة 5٪ BSA (الأبقار مصل الزلال) حل في TBST للحظر.
- احتضان لوحة في RT لمدة 2 ساعة ثم يغسل مع TBST 3X.
- جعل مخفف الأجسام المضادة الأوليةالأيونات في 5٪ BSA في TBST (انظر جدول المواد)، وإضافة 10 ميكرولتر / جيد. احتضان لوحة في RT لمدة 2 ساعة، ثم يغسل 3X مع TBST.
- جعل dilutionin الضد الثانوية 5٪ BSA في TBST (انظر جدول المواد)، وإضافة 10 ميكرولتر / جيد.
- احتضان لوحة في الظلام في RT لمدة 2 ساعة ثم يغسل مرتين مع TBST.
- تحضير التخفيفات لهويشت وphalloidin (انظر جدول المواد) في برنامج تلفزيوني وإضافة 10 ميكرولتر / جيد.
- احتضان لوحة في الظلام لمدة 30 دقيقة في RT.
- بعد 2 يغسل TBST، بطانات في احباط وتخزينها في 4 درجات ثاني / N.
- التصوير
الحصول على الصور باستخدام المجهر epifluorescence باستخدام الهدف 20X مع الكاميرا 1X1 binning. الحصول على ستة عشر صور لكل بئر، ليصبح المجموع 480 صور (قنوات X3).
2. تحليل الصور
تحميل وتثبيت PhenoRipper من phenoripper.org، وإطلاق PhenoRipper لبدء تحليل معهد العالم العربيغيس. يدعم PhenoRipper حاليا TIFF، PNG، و JPEG وجميع الأشكال الأخرى التي يدعمها MATLAB (البرمجيات عادة المجهر دعم التصدير إلى TIFF).
2.1 بيانات تحميل
- لا يوجد اصطلاح التسمية / المنظمة القياسية للصور المجهري، والتي يمكن أن تجعل تحميل الصور والبيانات الوصفية ربط (أي الشرح التجريبية مثل نوع العلاج، وكذلك عدد وهلم جرا) الجزء الأكثر تحديا لسير العمل. اختيار واحد من الأساليب المقدمة (موضح أدناه).
- PhenoLoader: اختر هذا الخيار لشبه تلقائيا تحميل البيانات عندما يكون اسم الملف و / أو بنية الدليل يحتوي على معلومات كافية لصور مجموعات كما تريد (على سبيل المثال B16 HeLa_Drug5-DAPI.png قد تشير إلى أن الصورة هي من بئر B16، يتم التعامل مع الخلايا مع المخدرات التي ID هو 5، ويلتقط الصورة وصمة عار دابي النووية - مع هذا اصطلاح التسمية، وجميع الصور من A1 جيدا أو تعامل مع المخدرات 5 يمكن تجميعها بسهولة). سوف المعالجتوجيه المستخدم خطوة بخطوة لربط البيانات الوصفية مع مجموعات الصور وتحديد علامات على النحو التالي:
- انقر على "هيكل ملف" للوصول إلى إطار PhenoLoader.
- انقر على "تعريف الدليل الجذر" لتحديد الدليل الذي يحتوي على صورة البيانات. ثم تحديد الملفات التي لا تستخدم (الملفات غير المستخدمة) لتحليل (اختياري، يمكن أن تترك فارغة).
- انقر على "تعريف علامات" لتحديد المؤشرات الحيوية المستخدمة في التجربة وربطها مع الصور. على وجه التحديد، انقر على ملف صورة ثم تحديد جزء من اسم الملف الذي يعرف بشكل فريد المؤشرات الحيوية. أخيرا، أدخل اسما للكل العلامات البيولوجية.
- انقر على "تعريف الفوقية" لربط المعلومات مع كل صورة. على وجه التحديد، انقر على ملف الصورة، ومن ثم تحديد جزء من اسم الملف تحديد معلومات الصورة (على سبيل المثال "B16" لاسم أيضا). نافذة يسأل عن اسم المجموعة (على سبيل المثال "نحنليرة لبنانية ") سوف يطفو على السطح، أدخل اسما. سيتم عرض أعضاء المجموعة المستخرجة من اسم الملف على جدول المجموعة (على سبيل المثال على القائمة الكاملة للأسماء أيضا). لإضافة معلومات إضافية غير موجودة في اسم الملف، انقر على" (اختياري) التالي "الزر. انقر على" إضافة البيانات الوصفية المجموعة "، أدخل اسم مجموعة إضافية (على سبيل المثال" مخدرات ") ولكل قيمة من مجموعة محددة مسبقا (على سبيل المثال" حسنا ")، أدخل قيمته (على سبيل المثال" تاكسول ") وليس هناك حد لعدد من الجماعات الإضافية التي يمكن إضافتها.
- أخيرا، انقر على "إنشاء Metadatafile" لإنشاء ملف التعريف ومواصلة التحليل. إذا تم إنشاء ملف التعريف السابق، الخطوات المذكورة أعلاه يمكن تجنبها عن طريق تحميل الملف مباشرة باستخدام خيار "بيانات ميتا ملف" (وصفها في 3 أدناه).
- قوالب التعبير العادية استنادا: التعبيرات العادية هي نهج موحد لمطابقة أنماطفي النص. اختيار هذا الخيار عندما يكون اسم الملف و / أو بنية الدليل يحتوي على معلومات كافية لمجموعة الصور واصطلاح التسمية يطابق أحد القوالب الموجودة من قبل. القوالب المخصصة على أساس التعابير العادية ويمكن أيضا تعريف وإعادة استخدامها يدويا. ويوصى هذا الخيار للمستخدمين المتقدمين فقط مألوفة مع التعابير العادية.
- الفوقية الملف: اختر هذا الخيار لالتفصيل في نهاية المطاف. تحديد وتحميل فاصلة فصل القيم (CSV) ملف يحتوي على أسماء الملفات والبيانات الوصفية المرتبطة بها مع كل صورة. مثال على تنسيق الملف يتوفر على تحميل جزء من موقع على شبكة الإنترنت (phenoripper.org). ببساطة تحميل الملف من خلال واجهة لعرض المعلومات التي يحتوي عليها.
- PhenoLoader: اختر هذا الخيار لشبه تلقائيا تحميل البيانات عندما يكون اسم الملف و / أو بنية الدليل يحتوي على معلومات كافية لصور مجموعات كما تريد (على سبيل المثال B16 HeLa_Drug5-DAPI.png قد تشير إلى أن الصورة هي من بئر B16، يتم التعامل مع الخلايا مع المخدرات التي ID هو 5، ويلتقط الصورة وصمة عار دابي النووية - مع هذا اصطلاح التسمية، وجميع الصور من A1 جيدا أو تعامل مع المخدرات 5 يمكن تجميعها بسهولة). سوف المعالجتوجيه المستخدم خطوة بخطوة لربط البيانات الوصفية مع مجموعات الصور وتحديد علامات على النحو التالي:
- حدد الحقل البيانات الوصفية التي تحدد مكررات في التجربة لتجنب أخذ العينات زائدة عن الحاجة. لمجموعات البيانات التي تحتوي على مكررات (يجب أن يكون على سبيل المثال جميع الصور في بئر مماثلة)، تجميعها معا (مثلا جيدا) يمكن الظهورأداء اوفه. في معظم الحالات فمن المعقول أن تختار الخيار الافتراضي "عشوائية (لا أعرف)" الذي يختار مجموعة فرعية عشوائي.
2.2 إعداد تحليل معلمات
انقر على "مجموعة معلمات" لتعريف المعلمات المطلوبة لمعالجة البيانات. المعلمات لتعريف هي على اللوحة اليسرى. تعرض لوحة الحق عينة من مجموعة البيانات المدمجة. انقر على الأسهم يسار / يمين للتبديل بين الصور المختلفة.
- عتبة كثافة: اختيار قيمة العتبة المناسبة لتحديد ما يقرب من الأجزاء الخلوية (بدلا من الخلفية، والمناطق noncellular) من الصور. وprecalculated عتبة بواسطة PhenoRipper، ولكن يمكن تعديلها لتحسين تسليط الضوء على المناطق الخلوية باستخدام شريط التمرير متوفرة في أعلى الصورة. إذا لم يعمل عتبة اختار في جميع الصور، وانخفاض عتبة بحيث تشمل المناطق noncellular بدلا من اسقاط المناطق الخلوية.
- كتلة Sإيزي: اختيار حجم الكتلة المناسبة (بالبكسل) لشبكة الصورة. سيتم فرضه كتل من الحجم المحدد على الصورة. ضبط حجم الكتلة للحصول على ما معدله 20-30 كتل / خلية. لركب الشبكة فوق الصورة، انقر على مربع الاختيار أمام حقل "حجم الكتلة".
- معلمات اختيارية: إذا كانت الصور تحجيم السيارات لا تعرض علامات مع شدة النسبي المطلوب (غير المشبعة مثل لون واحد) أو إذا كان في حاجة إلى إسقاط علامات من التحليل، واستخدام "ضبط شدة قناة" الخيار. لتحديد المناطق الخلوية على مجموعة فرعية من علامات استخدام "القنوات المستخدمة لعتبة" الخيار. الخيارات الافتراضية من المعلمات الأخرى وعادة ما تكون كافية، ولكن إذا لزم الأمر، وضبط لهم باستخدام "خيارات تحليل متقدمة".
- تشغيل تحليل عن طريق الضغط على "PhenoRip" على لوحة التطبيق الرئيسي. وسوف يحدد تلقائيا PhenoRipper أنواع كتلة المتكررة في الصور. سيتم إنشاء ملفات تعريف المظهري لكل صورة على أساس أجزاء من أنواع مختلفة كتلة فيه.
3. استكشاف النتائج
- استكشاف العلاقات بين التشكيلات المظهري من الصور باستخدام PhenoBrowser (الشكل 1). تتكون واجهة PhenoBrowser من أربع لوحات: لوحة أعلى اليسار هو تمثيل رسومي (مؤامرة مبعثر) من التشابه النسبي بين مختلف الصور / الشروط، الفريقين على حق الصور عرض عينة ظروف المحددة، واللوحة النهائية (شريط الرسم البياني ) يقارن الشخصية المظهرية.
- "تجاهل إطارات فارغة" باستخدام القائمة "معالجة البيانات".
- إزالة صور ذات نوعية رديئة: أولا، لدراسة الصور الفردية إيقاف التجميع من القائمة "معالجة البيانات". المقبل، انقر فوق من خلال نقاط عزلاء في مؤامرة مبعثر وتجاهل الصور منخفضة الجودة (على سبيل المثال من التركيز، قطعة أثرية تلطيخ).
- استكشاف البيانات: بيانات التعريف التي تقرر يعرف الحقلوحدة أساسية للمقارنة (على سبيل المثال للمقارنة بين العقاقير والصور مع نفس قيمة الحقل الفوقية "المخدرات" بحاجة إلى أن تجمع معا). طي كافة الصور مع نفس قيمة هذا الحقل الفوقية إلى نقطة بيانات واحدة مع "المجموعة حسب". على سبيل المثال، سوف تجمع من خلال المخدرات متوسط الصور داخل كل لانتاج المخدرات نقطة واحدة في المخدرات. تعكس النقاط القريبة (أو البعيد) في مؤامرة مبعثر الظروف التي تثير الظواهر الخلوية مماثلة (أو متباينة). لون أو تسمية نقطة (القائمة عرض البيانات) على أساس البيانات الوصفية المتوفرة للمساعدة للتفسير. مؤامرة 3D هو للتدوير من خلال النقر على مربع الاختيار "تدوير" وبالضغط على الزر الأيسر وسحب الماوس فوقها.
- حدد وجهتي نظر مختلفتين لمقارنتها مباشرة. فإن لوحات عرض الصور صورة عينة لكل نقطة، وسوف تظهر لوحة الرسم البياني شريط أنواع كتلة التي هي الأكثر مختلفة بين النقطتين الترددات حدوثها.
- إطلاق جlustergram من "القائمة Clustergram" لتقديم وجهة نظر أكثر عالمية للعلاقة بين أنواع كتلة والظروف التجريبية. من خلال تجميع كلا النوعين كتلة والظروف، وهذا يسلط الضوء على تمثيل الظواهر الخلوية التي تميز أفضل مجموعات من الظروف (الشكل 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن هنا اختبار قدرة هذا العمل على الأدوية المجموعة على أساس آلية عملها. وكانت المصنفة خلايا هيلا في 30 بئرا من لوحة 384 جيدا والملون لDNA / الأكتين / α-تويولين. يتم سرد الأجسام المضادة المحددة الابتدائية، والأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى، والبقع الفلورسنت الأخرى التي تم استخدامها في جدول المواد. وعولج 15 بئرا مع الأدوية التي تنتمي إلى ثلاث فئات الآلية (تثبيط deacetylase هيستون، واستهداف أنيبيب والحمض النووي الضارة) لمدة 24 ساعة وتصويرها باستخدام مجهر epifluorescence في 20X التكبير الهدف. تم الحصول عليها ستة عشر صور لكل بئر، ليصبح المجموع 480 صور (قنوات X3). البيانات الموضحة هنا يمكن تحميلها من www.phenoripper.org.
كما هو موضح أعلاه، تم استخدام PhenoRipper لتحليل هذه الصور. تم تعيين عتبة المقدمة إلى 5٪ (أي 5٪ من أقصى كثافة ممكنة) وحجم الكتلة إلى 20 بكسل (الارقام .. ه 2). استغرق تحليل بيانات هذه المجموعة ما يقرب من 10 دقيقة على جهاز كمبيوتر سطح المكتب القياسية (64 بت و 8 آلة الأساسية في 3.2 غيغاهرتز، مع 16 جيجابايت من ذاكرة الوصول العشوائي). تم استخدام واجهة PhenoBrowser (الشكل 3) لاستكشاف النتائج. وكانت القطع الأثرية التصوير مثل سوء تلطيخ وإطارات فارغة من السهل تحديد لأنها وقفت القيم المتطرفة واضحة (الشكل 4). وتصور أوجه التشابه المظهري النسبية بين الصور في لوحة العلوي الأيسر من الشكل 3 باستخدام التحجيم متعدد الأبعاد. كل نقطة تمثل صورة واحدة ملونة من قبل آلية المخدرات لها في العمل. ويبين هذا المخطط أن ملامح المظهري يمكن استخدامها لجماعات المخدرات عن طريق آلية عملها. A clustergram البيانات (الشكل 5) ويتعلق هذا التجمع لمحات المظهري.
s/ftp_upload/51280/51280fig1.jpg "العرض =" 600px ل"/>
الشكل 1. سير العمل للفحص المجهري مضان باستخدام PhenoRipper. هي المصنفة خطوط الخليوي في لوحة، ثم تضاف الاضطرابات إلى كل بئر والمحتضنة لوحة. يتم الحصول على الصور باستخدام المجهر الآلي ثم تحليلها بسرعة باستخدام PhenoRipper. وبالتالي، لا يعرف نتائج التجربة الحالية بعد فترة وجيزة من التصوير، ويمكن، إذا لزم الأمر، يمكن استخدامها لتحسين الإعداد للتكرار في المستقبل. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 2. يتم تعيين حجم كتلة وكثافة عتبة باستخدام واجهة رسومية مع الوقت الحقيقي feedbac البصرية: إعداد المعلمات PhenoRipper ك. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الرقم 3. واجهة PhenoBrowser لاستكشاف النتائج PhenoRipper: تنقسم واجهة PhenoBrowser في أربع لوحات: لوحة أعلى اليسار هو مؤامرة مبعثر عرض أوجه التشابه النسبي بين مختلف الصور / الشروط، الفريقين على حق الصور عرض عينة ظروف المحددة، واليسرى السفلى لوحة يقارن الشخصية المظهرية. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
load/51280/51280fig1highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/51280/51280fig4.jpg "العرض =" 600px ل"/>
الشكل 4. مثال على قيمة عزلاء في مؤامرة مبعثر (تمييز) يدل على القطع الأثرية تلطيخ (انظر الفيديو). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الرقم 5. التمثيل Clustergram لمحات PhenoRipper: كل صف يمثل دواء واحد، ولكل عمود نوع كتلة. القيم رمادي النطاق تعكس ملامح المظهري، أي جزء صغير من أنواع مختلفة لكل كتلة المخدرات. تشير قيمة أخف جزء أعلى من هذا النوع الكتلة. المجموعات الهرمية يفصل إلى حد كبير للمخدرات مختلفة حسب الطبقة المخدرات (أحمر / أزرق / غراملون التابعين على اليمين). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
سير العمل الموصوفة هنا يسمح توصيف سريع وسهل والمقارنة بين الصور المجهري. أثبتنا أولا كيف يمكن أن يساعد هذا العمل الأمثل التجربة، على سبيل المثال عن طريق إجراء سريعا لمراقبة الجودة على الصور المجهري. المقبل، أثبتنا قدرته على تحليل البيانات الفرز الفائق الإنتاجية: كنا قادرين على المخدرات المجموعة على أساس آلية عملها. وكان هذا التجمع من المخدرات مماثلة لتلك التي وجدت باستخدام أساليب أكثر تعقيدا 6، حتى ولو كان PhenoRipper أوامر من حجم أسرع.
على الرغم من أننا قد وجدت هذا النهج قوية ضد تقلبات التجريبية المتفرقة، كما هو الحال مع أي نهج يستند إلى صورة، وسوف تتأثر قراءات عن طريق الآثار غير بيولوجية منتظمة. على سبيل المثال، والتباين لوحة إلى لوحة في كثافة علامة قد تحجب الآثار البيولوجية من الفائدة. يمكن تخفيض تأثير هذه القطع الأثرية عن طريق التصحيحات المناسبة 7، 8 مثل عفي وقت متأخر لوحة التطبيع والطرح الخلفية. ويمكن أيضا أن تتأثر الأوضاع الناتجة عن PhenoRipper بالتغيرات في كثافة الخلية. في حين أن هذا السلوك عادة المرغوب فيه (مما يعكس النمو أو البقاء على قيد الحياة)، وتأثيرها يمكن الحد من الامم المتحدة واختيار "استخدم معلومات الخلفية" الخيار في "معلمات المتقدم".
في اختيار الطريقة المناسبة للتحليل، يحتاج المستخدمون إلى النظر في المفاضلة بين السرعة وسهولة الاستخدام ومستوى التفاصيل التحليلية. طرق خالية من 9-11 تجزئة مثل PhenoRipper وعادة ما تكون أسرع وأسهل استخداما من الطرق التي تعتمد على خلية واحدة مثل CellProfiler 2. العيب أساليب خالية من تجزئة هو عدم القدرة على تحديد خصائص خلية واحدة محددة. وبالتالي يحتاج المستخدم لاتخاذ قرار بشأن النهج المناسب على أساس الاحتياجات له أو لها. عند مقارنة دقيقة أو مجموعة من الظروف التجريبية هو الهدف الرئيسي، وجدنا أن مستوىالتفاصيل التي استولت عليها PhenoRipper هي أكثر من كافية. على وجه الخصوص، ركز الباحثون على التجارب الإنتاجية العالية سوف تستفيد كثيرا من القدرة بسرعة وبسهولة لاستكشاف بيانات الصورة. في الختام، فإن سير العمل المقدمة هنا تسمح للعلماء مقاعد البدلاء لاستكشاف بسهولة الصور مضان المجهري في وقت قريب بعد اقتناء وتسهيل سريعة الدوران بين التحليلات والتصوير. ونحن نعتقد أن هذا العمل خفض عائقا أمام أداء تحليل الصور الكمي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر آدم كوستر وجميع الأعضاء الآخرين في Altschuler ووو مختبرات لردود الفعل والمناقشات المفيدة. هذا البحث كان مدعوما من المعهد الوطني للصحة منح R01 GM085442 وCA133253 (SJA)، R01 GM081549 (LFW)، CPRIT RP10900 (LFW)، ومؤسسة وولش I-1619 (SJA) وI-1644 (LFW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965 | High Glucose, L-Glutamine |
| Marker Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | DNA stain, dilution 1:2,000 of 5 mg/ml stock |
| Marker phalloidin-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A12379 | Conjugated phallotoxin, dilution 1:200 |
| Primary Antibody α-tubulin | Sigma | T9026 | Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200 |
| Secondary Antivody anti-Mouse TRITC | Jackson | 115-025-166 | Conjugated secondary Ab, 0.5 mg in 1 ml PBS + 1 ml glycerol |
| Aldosterone | concentration used: 0.2 μM | ||
| Apicidin | concentration used: 20 μM | ||
| Colchicine | concentration used: 0.16 μM | ||
| Cortisol | concentration used: 0.2 μM | ||
| Dexamethasone | concentration used: 0.2 μM | ||
| Docetaxel | concentration used: 0.2 μM | ||
| M344 | concentration used: 20 μM | ||
| MS-275 | concentration used: 5 μM | ||
| Nocodazole | concentration used: 0.3 μM | ||
| Prednisolone | concentration used: 0.2 μM | ||
| RU486 | concentration used: 0.2 μM | ||
| Scriptaid | concentration used: 70 μM | ||
| Taxol | concentration used: 0.3 μM | ||
| Trichostatin A | concentration used: 0.2 μM | ||
| Vinorelbine | concentration used: 0.3 μM |
References
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (2006).
- Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis. PLoS Comput. Biol. 6, (2010).
- Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images. Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
- Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).
- Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. Quantitative analysis of digital microscope images. Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).
- Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. Image calibration in fluorescence microscopy. J Microsc. 216, 15-24 (2004).
- Shamir, L., et al. Wndchrm - an open source utility for biological image analysis. Source Code Biol. Med. 3, 13 (2008).
- Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. Statistical and visual differentiation of subcellular imaging. BMC Bioinform. 10, 94 (2009).
- Huang, K., Murphy, R. F. Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells. IEEE Int. Symp. Biomed. Imag. Macro Nano, 2004 Apr 15-18, 2, 1139-1142 (2004).
