Summary
여기에서 우리는 빠르게 PhenoRipper, 최근에 개발 된 이미지 분석 플랫폼을 사용하여 형광 현미경 이미지의 컬렉션을 분석하고 탐구를위한 워크 플로를 설명합니다.
Abstract
높은 처리량 현미경의 급속한 발전에도 불구하고, 정량적 인 이미지 기반 분석은 여전히 중요한 도전을 제기. 전문 영상 분석 툴의 다양한 사용할 수 있지만, 대부분의 전통적인 이미지 분석 기반의 워크 플로우 (분석 매개 변수를 미세 조정에 대한) 가파른 학습 곡선을 가지고 이미징 및 분석 간의 긴 처리 시간에 발생합니다. 특히, 셀 분할은 이미지의 개별 셀을 식별하는 프로세스는,이 점에서 주요 병목 현상이다.
여기에서 우리는 PhenoRipper, 신속한 분석 및 현미경 이미지의 탐험을 위해 디자인 된 오픈 소스 소프트웨어 플랫폼을 기반으로 대체, 세포 분할이없는 워크 플로우를 제시한다. 여기에 제시된 파이프 라인은 세포 배양의 면역 형광 현미경 이미지를 최적화하고 최소한의 사용자 개입이 필요합니다. 반 시간 내 PhenoRipper은 일반적인 96 - 웰 실험 데이터를 분석하고 이미지의 프로파일을 생성 할 수 있습니다. 사용자 수다음 시각적으로 데이터를 탐색 자신의 실험에 품질 관리를 실시하고, 섭동에 대한 응답을 보장하고 반복 실험의 재현성을 확인합니다. 이 분석 및 분석 최적화시 매우 중요합니다 실험 사이의 신속한 피드백주기를 용이하게한다. 이 프로토콜은 단지 품질 관리를위한 제 1 패스 분석으로서 유용하지만 엔드 투 엔드 솔루션으로 사용될 수 있고, 특히 스크리닝. 여기에서 설명한 워크 플로우는 높은 처리량 스크린에 의해 생성 된 것과 같은 큰 데이터 세트로 스케일링하고, 정확하게 생물학적 시스템의 넓은 범위 표현형에 의해 그룹 실험 조건에 도시되었다. PhenoBrowser 인터페이스는 표현형 공간을 탐구하고 생물 주석에 이미지 속성을 관련하는 직관적 인 프레임 워크를 제공합니다. 종합적으로, 여기에 설명 된 프로토콜을 기반으로 화상 스크린의 정량 분석을 채택하는 장벽을 낮출 것이다.
Introduction
지난 10 년 동안 이미징 기술의 급속한 진보는 많은 실험실에게 높은 처리량 현미경을 수행 할 수있는 능력을 부여 하였다. 문제는 지금 분석 중 하나에 이미지 중 하나를 이동했다. 우리는 어떻게 비교, 특성, 그리고 일반적인 높은 처리량 영상 화면에 생성 된 복잡한 아직 미묘한 표현형의 급류를 탐험 할 수 있습니까?
이미지 분석 및 정보학 플랫폼의 숫자는 이미지의 큰 컬렉션에서 생체 정보를 추출하기위한 사용자 정교한 도구 상자 1-3을 받고 있습니다. 그러나 많은 중요한 장애물은 높은 처리량 이미지 기반 화면에서 데이터를 분석 남아있다. (그 시스템) 이미지와 알고리즘 파라미터의 미세 조정의 적절한 특성화를 선택과 관련된 어려움은 종종 특히 이미지 분석 전문 지식이없는 사용자를 위해 긴 설치 시간에 발생합니다. 특히, 셀 분할, 개별 셀을 식별하는 프로세스해당 화상은,이 점에서 주요 병목 현상이다. 분할은 세포 유형, 세포 밀도와 바이오 마커와 같은 실험적인 매개 변수에 매우 민감하고, 자주 큰 데이터 세트에 대한 반복 조정을 필요로 할 수 있습니다. 이러한 이유로, 이미지 분석은 종종 오히려 실험 플로의 통합 부분보다 전문가에 의해 수행 독립적 단말 단계이다. 이 분석 및 실험, 분석 개발의 중요한 부분의 신속한 피드백주기를 배제한다.
여기에서 우리는 높은 처리량의 형광 현미경에 최적화 상기 어려움의 많은 것을 방지하는 다른 워크 플로우에 대해 설명합니다. 이를 위해, 우리는 PhenoRipper 4, 빠른 탐사 및 현미경 이미지 분석을위한 오픈 소스 소프트웨어 플랫폼을 사용합니다. 중요한 것은, PhenoRipper 단일 세포를 식별하려고 시도하지 않음으로써 세포 분할과 관련된 여러 가지 문제를 피할 수 있습니다. 대신, PhenoRipper 픽셀로 이미지를 분할세포 내 크기의 블록들이 포함 된 블록의 측면에서 이미지를 특징. 특히, PhenoRipper 마커 - colocalization을 기반 기능의 측면에서 블록을 프로파일 자동 교육 이미지의 가장 대표적인 유형을 차단 4 식별합니다. PhenoRipper 다음 각 블록과 가장 유사한 대표 블록 타입에 할당하고, 마지막에 포함 된 블록의 종류에 따라 이미지를 특징.
전통적인 단일 셀 기반의 접근 방식에 비해,이 방법은 최소한의 미세 조정과 전문 지식을 필요로합니다. 블록 크기와 그래픽 피드백을 설정 둘 임계 강도 (이미지의 비 세포 부분을 폐기) : 이와 같이, 사용자는 두 개의 매개 변수를 설정해야합니다. 중요한 것은, 여기에 설명 된 워크 플로는 속도와 최소한의 미세 조정이 큰 시간과 신뢰성 향상을 제공 훨씬 더 큰 데이터 세트를 쉽게 확장 4를 보였다. 실제로, 우리는 발견이이 응용 프로그램바퀴벌레는 모두 크기가 4의 배수 주문하여 설치 및 실행에 필요한 시간을 줄일 수 있습니다.
PhenoRipper의 기본 출력은 세포가 유사한 표현형을 표시하는 원인이 실험 조건의 그룹을 식별하기 위해 사용자를 가능하게하는 이미지의 유사성을 시각적으로 표시 한 것입니다. 일반적으로 발견 PhenoRipper 그룹화는 더 많은 시간이 소요되는, 세포 기반 방법 (4)에 의해 생성 된 것과 비교 "생물학적 해석 가능성"이. 실제로, 이것은 종종, 전형적인 96 - 웰 형광 현미경 실험을 행하는 반 시간 내에, 종래 이미지 분석 경험이없는 실험자가 자신의 실험의 성능에 대한 신뢰성있는 판독을 얻을 수 있다는 것을 의미한다. 실험은 다른 실험 조건 사이의 관계를 탐구하고 이미지 표현형에 이러한 관계의 관계를 시작할 수 있습니다.
우리는 효과를 분석하여 여기에이 워크 플로를 보여DNA와 세포 골격 마커 스테인드 HeLa 세포에 별개의 기계적인 클래스의 약물. 약물의 같은 클래스로 처리 된 세포의 이미지가 함께 그룹화하고, (그래서에 초점을 세포 밖으로 염색 유물)별로 품질의 이미지를 식별하고 잠재적으로 폐기하기가 용이하고, 아웃 라이어로 등장했다.
이 워크 플로는 이미지 기반 분석의 큰 숫자에 대한 유용하지만, 다른 방법이 잠재적으로 더 많은 정보를 될 수 분명히 많은 경우가 있습니다. 예를 들어, PhenoRipper로부터의 출력은 주로 실험 조건에 걸쳐 형광 패턴의 상대적인 비교이다. 특정 단일 세포 형질의 절대적 특성화가 (셀의 얼룩 무늬의 예 번호) 대신에 필요한 경우, 단일 세포 기반 분석이 요구된다. 그럼에도 불구하고, 심지어 이러한 유형의 상황에서, PhenoRipper이 단일 셀 표현형의 변화를 감지 할 가능성이 있으므로 분석 OPTI를위한 유용한 도구가 될 수mization.
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Protocol
1. 준비 샘플 및 이미징
- 세포 배양
- 일상적으로 문화를 분할하고 20~70%의 합류에 유지한다. 이전 실험에 어느 날, (둘 베코의 수정 이글 중간 재료의 표 참조) DMEM에서 HeLa 세포의 성장과 10 % FBS (태아 혈청) 및 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보충.
- 실험의 날에, 분할 세포 배양 (약 50 %의 합류)에서 성장.
- 몇 초 동안 트립신 / EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산)의 약 2 ㎖에 노출, PBS (인산염 완충 생리 식염수)으로 세포를 씻으십시오. 초과 트립신 / EDTA를 대기음 ~ 3 분 동안 실온에서 후드 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 박막에 목욕 세포를 유지.
- 기계적으로 두 번 플라스크를 흔들어 혈청 보충 미디어 세포를 분리. 세포를 세어 미디어의 5,000 cells/50 μL로 희석 즉시 아니라 자동화 된 액체 처리 로봇 (30를 사용하여 384도 유리 바닥 판에 50 μL / 웰 플레이트플레이트들)은 여기에 사용됩니다.
- 웰 소재 가장자리 효과를 최소화하기 위해 30 분 동안 RT에서 플레이트를 배양한다. 하룻밤 37 ° C / 5 % CO 2 배양기에서 RT 배양, 장소 플레이트 후.
- 각각의 약물은 중복으로 측정됩니다. 판은 이미 미디어를 포함에 해당 우물에 약 25 μl를 추가합니다.
- 24 시간 후 약물 치료에서 PBS에 4 % 파라 포름 알데히드 용액을 플레이트를 고정합니다.
- 염색
여기에 사용 된 특정 기본 항체, 형광 표지 된 이차 항체와 다른 형광 얼룩은 재료의 표에 나열되어 있습니다.- 투과 3 분 TBS에서 0.2 % 트리톤 X-100 용액 (트리스 완충 식염수)로 세포를 고정하고, TBST (트리스 완충 식염수 + 트윈 20) 3 배, 세척. 블로킹 TBST에서 5 % BSA (소 혈청 알부민) 솔루션을 추가합니다.
- 2 시간 동안 실온에서 접시를 품어 후 TBST 배, 세척.
- 차 항체 dilut을TBST에서 5 % BSA에 이온 (재료의 표 참조)도 10 μL /를 추가합니다. 2 시간 동안 실온에서 접시를 품어 후 TBST로 3 회 세척한다.
- TBST에 차 항체 dilutionin 5 % BSA (재료의 표 참조)을 확인하고도 10 / μL를 추가합니다.
- 2 시간 동안 실온에서 어둠 속에서 판을 품어 후 TBST로 두 번 씻는다.
- PBS에서 (재료의 표 참조) 훽스트 및 phalloidin도에 대한 희석을 준비하고 잘 10 μL /를 추가합니다.
- RT에서 30 분 동안 어둠 속에서 접시를 품어.
- 후 2 TBST 세척, 4 ° CO / N.에서 박 및 저장소의 커버 플레이트
- 영상
카메라의 1x1 비닝로 20X 대물 렌즈를 이용하여 표면 형광 현미경을 사용하여 이미지를 획득. 480 이미지 (배 채널)의 총, 각 웰에 여섯 이미지를 획득.
2. 이미지 분석
다운로드 phenoripper.org에서 PhenoRipper를 설치하고 IMA의 분석을 시작 PhenoRipper를 시작GES. PhenoRipper은 TIFF를 지원, PNG 및 JPEG와 MATLAB에서 지원하는 모든 다른 형식 (현미경 소프트웨어는 일반적으로 TIFF로 수출을 지원합니다).
2.1 데이터 로딩
- 표준 이름 / 조직 컨벤션 로딩 이미지와 연관 메타 데이터를 만들 수있는 현미경 이미지, 존재하지 않습니다 (예 : 치료의 유형으로, 즉 실험적인 주석을 잘 수 등) 워크 플로의 가장 어려운 부분입니다. (아래에 설명) 제시된 방법 중 하나를 선택합니다.
- PhenoLoader : 원하는대로 파일 이름 및 / 또는 디렉토리 구조 (예 : B16 HeLa_Drug5-DAPI.png 이미지가 잘 B16에서 않기 때문입니다 그룹의 이미지에 충분한 정보가 포함되어있는 경우 데이터를로드 반 자동이 옵션을 선택하면, 세포 처리됩니다 이 이름 지정 규칙을 사용하여, 잘 A1 또는 약 5 처리의 모든 이미지를 쉽게 분류 할 수있다) - ID가 5이고, 이미지가 핵 DAPI의 얼룩을 캡처 마약. 마법사는 것이미지 그룹과 메타 데이터를 연결하고 다음과 같이 마커를 정의하는 단계로 사용자 단계를 안내 :
- PhenoLoader 창에 액세스 할 수 있습니다 "파일 구조"를 클릭하십시오.
- 이미지 데이터 집합을 포함하는 디렉토리를 선택하려면 "정의 루트 디렉토리"를 클릭하십시오. 그런 다음 분석 (옵션, 빈 남아있을 수 있습니다)에 사용하지 않는 파일 (사용하지 않는 파일)를 필터링 할 수 있습니다.
- 실험에 사용 된 바이오 마커를 지정하고 이미지와 연결하는 "정의 마커"를 클릭하십시오. 구체적으로 다음 고유 생체를 식별하는 파일 이름의 부분을 선택하여 이미지 파일을 클릭합니다. 마지막으로, 각각의 바이오 마커의 이름을 입력합니다.
- 각각의 이미지와 정보를 연결하는 "정의 메타 데이터"를 클릭하십시오. 특히, 이미지 파일을 클릭 한 다음 이미지 정보 (물론 이름 예 : "B16")를 식별하는 파일 이름의 일부를 선택합니다. 창은 그룹 이름 (예 : "요청 우리LL ")의 이름을 입력 나타납니다. 파일 이름에서 추출 된 그룹의 구성원) 예를 들어, 잘 이름의 전체 목록 (그룹 테이블에 표시됩니다. 파일 이름에없는 추가 정보를 추가하려면 클릭" (옵션) 다음 "추가 그룹 이름 (예를 들어, 입력"메타 그룹 추가 "버튼을 클릭합니다.를 클릭"약을 ")와 미리 정의 된 그룹의 각 값에 대해 (예를 들어,"음 ")의 값을 입력합니다 (예 :"탁솔 ") . 추가 할 수있는 추가 그룹의 수는 제한이 없다.
- 마지막으로, 메타 데이터 파일을 생성하고 분석을 계속하기 위해 "만들기 Metadatafile"을 클릭합니다. 메타 데이터 파일은 이전에 생성 된 경우, 상기 단계들은 직접 옵션 (아래에 설명 된 세) "메타 파일"을 이용하여 파일을로드함으로써 회피 될 수있다.
- 정규 표현식을 기반으로 템플릿 : 정규 표현식은 패턴과 일치하는 표준 방법입니다텍스트. 파일명 및 / 또는 디렉토리 구조는 그룹 화상에 충분한 정보를 포함하고 네이밍 컨벤션 기존 템플릿 중 하나와 일치 할 때이 옵션을 선택한다. 정규 표현식을 기반으로 사용자 정의 템플릿을 수동으로 정의하고 재사용 할 수있다. 이 고급 옵션은 정규 표현식을 잘 알고있는 사용자 만 사용해야합니다.
- 메타 데이터 파일 : 궁극의 커스터마이즈에 대해이 옵션을 선택합니다. 정의하고 쉼표로 구분 된 값을 각각의 이미지에 연결된 파일 이름 및 메타 데이터를 포함하는 (CSV) 파일을로드합니다. 파일 형식의 예는 웹 사이트 (phenoripper.org)의 다운로드 부분에 유효하다. 단순히 포함 된 정보를 표시 할 인터페이스를 통해 파일을로드합니다.
- PhenoLoader : 원하는대로 파일 이름 및 / 또는 디렉토리 구조 (예 : B16 HeLa_Drug5-DAPI.png 이미지가 잘 B16에서 않기 때문입니다 그룹의 이미지에 충분한 정보가 포함되어있는 경우 데이터를로드 반 자동이 옵션을 선택하면, 세포 처리됩니다 이 이름 지정 규칙을 사용하여, 잘 A1 또는 약 5 처리의 모든 이미지를 쉽게 분류 할 수있다) - ID가 5이고, 이미지가 핵 DAPI의 얼룩을 캡처 마약. 마법사는 것이미지 그룹과 메타 데이터를 연결하고 다음과 같이 마커를 정의하는 단계로 사용자 단계를 안내 :
- 중복을 피하기 위해 샘플링 실험 복제물을 정의 메타 데이터 필드를 선택한다. 노출 수 있습니다 (물론에 의해 예)를 그룹화, 반복 실험을 (잘 예를 들어, 모든 이미지가 비슷해야한다) 포함하는 데이터 세트에 대한비켜 성능을 제공합니다. 대부분의 경우에 임의의 부분 집합을 선택하는 기본 옵션 "무작위 (모른다)"을 선택하는 것이 합리적이다.
2.2 분석 매개 변수 설정
데이터 집합을 처리하는 데 필요한 매개 변수를 정의하는 "매개 변수 설정"을 클릭합니다. 정의하는 파라미터는 좌측 패널이다. 오른쪽 패널에 데이터 세트의 병합 된 샘플을 표시합니다. 서로 다른 이미지를 전환 할 왼쪽 / 오른쪽 화살표를 클릭하십시오.
- 임계 강도 : 약 화상 셀룰러 부 (아닌 배경, 비 세포 영역)를 식별하기 위해 적절한 임계 값을 선택. 임계치 PhenoRipper 의해 미리 계산되지만, 화상의 상단에 제공되는 스크롤 바를 이용하여 셀룰러 영역의 강조를 향상시키기 위해 조정될 수있다. 선택된 임계 값은 모든 이미지에서 작동하지 않는 경우, 비 세포 영역이 아닌 휴대 영역을 삭제를 포함하도록 임계 값을 낮 춥니 다.
- 블록 S이지는 : 그리드에 이미지를 픽셀 단위로 적절한 블록 크기를 선택합니다. 지정된 크기의 블록은 이미지에 중첩됩니다. 20 ~ 30 블록 / 셀의 평균을 얻기 위해 블록의 크기를 조절합니다. "블록 크기"필드 앞의 체크 박스에 이미지 버튼을 클릭함으로써 그리드를 중첩합니다.
- 선택적 매개 변수 : 자동 조정 이미지를 원하는 상대 강도와 마커를 (예를 들어, 하나의 색상이 포화 상태)를 표시 또는 마커 분석에서 제외 할 필요가있는 경우, "채널의 강도를 조절"옵션을 사용하지 않는 경우. 마커의 하위 집합에 휴대 영역을 식별하려면 옵션 "임계 값에 사용되는 채널"을 사용합니다. 다른 매개 변수의 기본 선택은 일반적으로 충분하지만, 필요한 경우, "고급 분석 옵션"을 사용하여 조정합니다.
- 주 응용 프로그램 패널의 "PhenoRip"를 눌러 분석을 실행합니다. PhenoRipper 자동으로 이미지에 재발 블록 유형을 식별합니다. 표현형 프로파일이 생성됩니다그것에 상이한 블록 유형의 분획에 기초하여 각각의 이미지.
3. 탐색 결과
- PhenoBrowser (그림 1)를 사용하여 이미지의 표현형 프로파일 사이의 관계를 탐구한다. PhenoBrowser 인터페이스는 4 개의 패널로 구성됩니다 : 왼쪽 상단 패널은 서로 다른 이미지 / 조건의 상대적인 유사성의 그래픽 표현 (산포도)이며, 선택된 조건의 오른쪽에 표시 샘플 이미지 및 최종 패널 (막대 차트에있는 두 개의 패널 )는 자신의 표현형 프로파일을 비교합니다.
- "데이터 처리"메뉴를 사용하여 "빈 프레임을 폐기".
- 가난한 품질의 이미지를 제거 첫째, 개별 이미지는 "데이터 처리"메뉴에서 그룹을 해제 공부. 다음으로, 산점도의 국외자 점을 클릭하고 (예를 들어, 초점, 염색 유물) 낮은 품질의 이미지를 버린다.
- 데이터를 탐색 : 필드 정의를 메타 데이터 결정하십시오비교의 기본 단위 (예를 들어 약물과 비교하기 위해, 메타 데이터 필드의 동일한 값 "약물"와 이미지는 함께 그룹화 될 필요가있다). "그룹으로"를 하나의 데이터 요소에이 메타 데이터 필드의 값이 동일한 모든 이미지를 축소. 예를 들어, 마약류 그룹은 약 당 하나의 포인트를 얻을 각 약물에서 이미지를 평균 할 것이다. 산포도 인근 (또는 먼) 포인트와 유사한 (또는 이종) 세포의 표현형을 유도 조건을 반영합니다. 해석 능력을 돕기 위해 가능한 메타 데이터를 기반으로 색상 또는 라벨 포인트 (데이터 표시 메뉴). 3D 플롯은 "회전"체크 박스에 왼쪽 버튼을 클릭하고 마우스를 드래그하여 클릭하여 회전 가능하다.
- 직접 비교하는 두 개의 서로 다른 점을 선택합니다. 이미지 패널은 각 포인트에 대한 샘플 이미지를 표시하고, 막대 차트 패널은 그 발생 빈도 두 점 사이의 대부분의 다른 블록 형식을 보여줍니다.
- C를 시작합니다블록 종류 및 실험 조건 사이의 관계의 더욱 글로벌 뷰를 제공하는 "Clustergram 메뉴」로부터 lustergram. 블록의 종류와 조건을 모두 그룹화하여,이 표현은 가장 좋은 조건의 그룹 (그림 5)를 구별 세포 표현형을 강조한다.
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Representative Results
여기에서 우리는 그들의 행동 메커니즘을 기반으로 그룹의 약물이 워크 플로의 능력을 시험했다. 헬라 세포는 384 - 웰 플레이트의 30 우물에 씨앗을 품고 및 DNA / 말라 / α-tubulin에 대한 염색 하였다. 사용 된 특정 기본 항체, 형광 표지 된 이차 항체 및 기타 형광 얼룩은 재료의 표에 나열되어 있습니다. 웰스는 세 기계론의 클래스 (히스톤 탈 아세틸 화 효소의 억제, 미세 소관 타겟팅 및 DNA 손상) 24 시간 동안 20 배 목표 배율 표면 형광 현미경을 사용하여 몇 군데에 속하는 15 약물로 치료했다. 열 여섯 이미지 480 이미지 (배 채널)의 총, 잘 각각 인수했다. 여기에 설명 된 데이터는 www.phenoripper.org에서 다운로드 할 수 있습니다.
전술 한 바와 같이, PhenoRipper은 이러한 이미지를 분석하는 데 사용 하였다. 전경 임계 값은 5 % (최대 가능한 강도, 즉 5 %) 및 20 픽셀 블록 크기 (Figur로했다 전자 2). 이 데이터 세트의 분석 (16 GB 렘으로, 3.2 GHz에서 64 비트, 8 코어 시스템) 표준 데스크탑 컴퓨터에서 약 10 분을했다. PhenoBrowser 인터페이스 (그림 3)의 결과를 탐구하는 데 사용되었다. 그들은 명확 아웃 라이어 (그림 4)에 띄었다 때문에 불량한 염색 및 빈 프레임으로 영상 아티팩트가 쉽게 식별 할 수 있었다. 이미지의 상대 표현형의 유사성은 다차원 스케일링을 사용하여 그림 3의 왼쪽 패널에서 시각입니다. 각 점은 행동의 약물의 메커니즘에 의해 착색 된 하나의 이미지를 나타냅니다. 이 플롯은 표현형 프로필이 그들의 행동 메커니즘에 의해 그룹의 약물로 사용될 수 있음을 보여줍니다. 데이터의 clustergram (그림 5) 표현형 프로필에이 그룹에 관한 것이다.
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그림 1. PhenoRipper를 사용하여 형광 현미경을위한 워크 플로. 세포주, 플레이트에 시딩 한 다음 섭동은 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 인큐베이션한다. 이미지는 자동화 된 현미경을 사용하여 획득하고 빠르게 PhenoRipper를 사용하여 분석 하였다. 따라서, 현재의 실험의 결과는 곧 촬영 후 알려져 있으며, 필요한 경우, 미래의 반복에 대한 설정을 세분화 할 수 있습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 설정 PhenoRipper 매개 변수 : 블록의 크기와 임계 강도는 실시간으로 시각적 인 feedbacand와 그래픽 인터페이스를 사용하여 설정 K. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. PhenoBrowser 인터페이스는 4 개의 패널로 구성되어 있습니다 : 왼쪽 상단 패널이 서로 다른 이미지 / 조건, 선택된 조건의 오른쪽에 표시 샘플 이미지에있는 두 개의 패널, 왼쪽 하단의 상대적인 유사성을 표시하는 산점도이다 PhenoRipper 결과를 탐험 PhenoBrowser 인터페이스 패널들은 표현형 프로파일을 비교합니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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그림 4. 염색 유물을 (동영상 참조) 표시 (강조) 산포도 아웃 라이어의 예. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 5. PhenoRipper 프로파일 Clustergram 표현 : 각 행은 하나의 약물 및 각 열 블록의 형식을 나타냅니다. 그레이 스케일 값은 각각의 약물에 대한 상이한 블록 유형의 분획 즉 표현형 정보를 반영한다. 밝은 값은 해당 블록 타입의 높은 비율을 나타냅니다. 계층 적 클러스터링은 크게 약물 클래스에서 다른 약 (레드 / 블루 / GR을 분리오른쪽에 EEN 색상). 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
여기에 설명 된 워크 플로는 빠르고 쉬운 특성과 현미경 이미지의 비교를 할 수 있습니다. 우리는 먼저이 워크 플로는 빠르게 현미경 이미지에 대한 품질 관리를 수행하여, 예를 들어 실험의 최적화를 할 수있는 방법을 보여 주었다. 다음으로, 우리는 높은 처리량 검사 데이터를 분석에 대한 가능성을 보여 주었다 : 우리는 그들의 행동 메커니즘을 기반으로 그룹의 약물에 수 있었다. 약물의 그룹은 PhenoRipper 빨리 규모의 명령에도 불구, 더 복잡한 방법 6을 사용하여 발견에 필적했다.
우리는 모든 이미지 기반의 접근 방식으로, 산발적 실험 변동에 대한 강력한이 방법을 발견했지만, 판독 체계적인 비 생물학적 효과에 의해 영향을받을 것입니다. 예를 들어, 마커 강도 플레이트에 플레이트 변화는 관심의 생물학적 효과를 마스크 할 수 있습니다. 이러한 아티팩트의 영향은 적절한 교정 07에 의해 감소 될 수 중에는, P 8판 정상화 및 배경 빼기 하순. PhenoRipper에 의해 생성 된 프로파일은 또한 세포 밀도의 변화에 의해 영향을받을 수 있습니다. 이 문제는 (반사 생존 또는 성장)는 일반적으로 바람직하지만, 그 효과는 "고급 매개 변수"에서 "사용 배경 정보"옵션을 해제 선택에 의해 감소 될 수있다.
분석을위한 적절한 방법을 선택, 사용자는 속도, 사용의 용이성 및 분석 내용의 수준 사이의 균형을 고려해야합니다. 같은 PhenoRipper로 분할없는 방법 9-11은 일반적으로 빠르게하고 CellProfiler 2와 단일 세포 기반 방법보다 쉽게 사용할 수 있습니다. 분할이없는 방법의 단점은 특정 단일 셀의 특성을 정량화 할 수 없다는 것입니다. 따라서 사용자는 자신의 필요에 따라 적절한 방법을 결정해야합니다. 실험 조건의 정확한 비교 또는 그룹이 주요 목적입니다 때, 우리는 발견 그 수준PhenoRipper에 의해 캡처 세부 사항은 적절한 이상입니다. 특히, 연구자들은 신속하고 간편하게 영상 데이터를 탐색하는 기능으로부터 크게 혜택을 높은 처리량 실험에 집중했다. 결론적으로, 여기에 제시된 워크 플로우 벤치 과학자 쉽게 취득 후 곧 자신의 형광 현미경 이미지를 탐구하고 분석과 영상 사이에 빠른 턴어라운드를 용이하게 할 수 있습니다. 우리는이 워크 플로는 정량 이미지 분석을 수행하기에 장벽을 낮출 전망이다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는 아담 코스터와 도움의 의견과 토론 Altschuler와 우 실험실의 다른 모든 구성원 감사합니다. 이 연구는 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다 R01 GM085442 및 CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW), 그리고 웰치 재단 I-1619 (SJA)를 부여하고 I-1644 (LFW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965 | High Glucose, L-Glutamine |
| Marker Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | DNA stain, dilution 1:2,000 of 5 mg/ml stock |
| Marker phalloidin-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A12379 | Conjugated phallotoxin, dilution 1:200 |
| Primary Antibody α-tubulin | Sigma | T9026 | Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200 |
| Secondary Antivody anti-Mouse TRITC | Jackson | 115-025-166 | Conjugated secondary Ab, 0.5 mg in 1 ml PBS + 1 ml glycerol |
| Aldosterone | concentration used: 0.2 μM | ||
| Apicidin | concentration used: 20 μM | ||
| Colchicine | concentration used: 0.16 μM | ||
| Cortisol | concentration used: 0.2 μM | ||
| Dexamethasone | concentration used: 0.2 μM | ||
| Docetaxel | concentration used: 0.2 μM | ||
| M344 | concentration used: 20 μM | ||
| MS-275 | concentration used: 5 μM | ||
| Nocodazole | concentration used: 0.3 μM | ||
| Prednisolone | concentration used: 0.2 μM | ||
| RU486 | concentration used: 0.2 μM | ||
| Scriptaid | concentration used: 70 μM | ||
| Taxol | concentration used: 0.3 μM | ||
| Trichostatin A | concentration used: 0.2 μM | ||
| Vinorelbine | concentration used: 0.3 μM |
References
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (2006).
- Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis. PLoS Comput. Biol. 6, (2010).
- Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images. Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
- Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).
- Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. Quantitative analysis of digital microscope images. Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).
- Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. Image calibration in fluorescence microscopy. J Microsc. 216, 15-24 (2004).
- Shamir, L., et al. Wndchrm - an open source utility for biological image analysis. Source Code Biol. Med. 3, 13 (2008).
- Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. Statistical and visual differentiation of subcellular imaging. BMC Bioinform. 10, 94 (2009).
- Huang, K., Murphy, R. F. Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells. IEEE Int. Symp. Biomed. Imag. Macro Nano, 2004 Apr 15-18, 2, 1139-1142 (2004).
