Summary
在这里，我们描述了快速分析和探索使用PhenoRipper，最近开发的图像分析平台的荧光显微镜图像的集合的工作流。
Abstract
尽管在高通量显微镜的快速发展，定量图像为基础的检测依然构成显著的挑战。虽然各种专门的图像分析工具可用，最传统的图像分析为基础的工作流程，有陡峭的学习曲线（用于分析参数进行微调），并导致成像和分析之间的长期周转时间。特别是，小区分割，识别单个细胞的图像的过程中，是在这方面的一个主要瓶颈。
在这里，我们提出了一个替代，细胞分割自由的基础上PhenoRipper，一个开源软件平台设计的快速分析和显微镜图像的勘探工作流程。这里介绍的管道进行了优化细胞培养免疫荧光显微镜图像，需要最少的用户干预。不到半小时，PhenoRipper可以从一个典型的96孔实验分析数据并生成图像轮廓。用户可以然后直观地探索他们的数据，他们的实验进行质量控制，确保应对扰动和重复检查的可重复性。这有利于分析和实验，这是至关重要的过程中检测优化之间的快速反馈循环。这个协议是有用的不只是作为一个第一遍分析的质量控制，而且还可以被用作一个终端到终端的解决方案，特别是用于筛选。此处所描述的工作流扩展到大的数据集，如由高通量筛选产生，并且已显示出组实验条件下通过表型准确在宽范围的生物系统。该PhenoBrowser界面提供了直观的框架，探讨表型的空间和与图片属性生物注解。总而言之，这里所描述的协议将降低门槛采用的基于图像的屏幕定量分析。
Introduction
在过去的十年中，在成像技术的快速发展已经给许多实验室进行高通量显微镜的能力。我们面临的挑战已经转移从成像的一个分析之一。我们如何表征，比较，并探讨通过一个典型的高通量成像屏幕产生的复杂而微妙的表型的洪流？
许多图像分析和信息平台，给用户先进的工具箱1-3从图像的大集合中提取的生物信息。然而，许多显著障碍仍然在分析来自高通量基于图像的画面数据。涉及选择的图像和算法参数微调的适当表征（对感兴趣的系统）的困难常常导致长的设置时间，尤其是对于用户不进行图像分析的专门知识。特别是，小区分割，识别单个细胞的过程中N个图像，就是这方面的一个主要瓶颈。分割可以是对实验参数如细胞类型，细胞密度和生物标志物高度敏感的，并经常需要对大数据集的重复调节。由于这些原因，图像分析常常是由专家进行的，而不是实验性的工作流程的一个组成部分是独立的，终端的步骤。这排除了分析和实验，检验发展的一个关键部分之间的快速反馈循环。
在这里，我们描述了被优化用于高通量荧光显微镜和避免了许多与上述困难的替代的工作流。为此，我们利用PhenoRipper 4，迅速 地探索和显微图像分析的开源软件平台。显著，PhenoRipper避免许多由不尝试识别单个细胞参与细胞分割的挑战。相反，PhenoRipper把图像分为像素亚细胞大小的块和图像特征在它们所包含的块为单位。具体来说，PhenoRipper型材的标记共定位为基础的功能方面的块，并自动识别4在训练图像中最有代表性的块类型。 PhenoRipper然后分配给每个块最相似的块代表性的类型，最后表征根据它们所包含的块的类型的图像。
较传统的单细胞为基础的方法，该方法需要很少的微调和专业知识。这样，用户只需要设置两个参数：块大小和阈值强度（丢弃的图像的非细胞部分），这两者都设置有图形的反馈。重要的是，这里所描述的工作流程已被证明4可以轻松地扩展到更大的数据集，其中的速度和最小的微调提供了大量的时间和可靠性的收益。在实践中，我们发现，这个程序蟑螂降低了对安装和运行了4级的多个订单所需的时间。
PhenoRipper的主要输出是图像相似的视觉表示，从而使用户能够识别的，导致细胞显示相似的表型的实验条件组。 PhenoRipper发现典型的分组具有可比的“生物可解释性”的那些由比较费时，基于细胞的方法4产生。在实践中，这意味着它们通常，在执行一个典型的96 - 孔荧光显微术实验的半小时内，不另行图像分析经验实验者可以得到关于他或她的实验的性能可靠的读出。然后实验者可以开始探索不同的实验条件之间的关系，以及与这些关系到图像的表型。
在这里，我们证明这一点的工作流程，通过分析影响药物在不同的机械类对HeLa细胞染色的DNA和细胞骨架标记。与同一类药物处理的细胞的图像进行组合在一起，质量差的图像（染色文物，失焦的细胞等等）表现为异常值，使它们易于识别和潜在的丢弃。
而此工作流是为大量的基于图像的检测有用的，明显有许多情况下，不同的方法可能是更有益。例如，从PhenoRipper输出为主要的荧光模式跨越的实验条件下的相对比较。如果要求特定的单细胞特征的绝对表征，而不是（在细胞中的斑点的例如数），将需要一个单细胞为基础的分析。然而，即使在这种类型的情况，PhenoRipper是可能检测到的变化在这些单细胞的表型，因此可用于测定OPTI一个有用的工具mization。
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Protocol
1。准备样品和成像
- 细胞培养
- 分裂的文化常规，并在20-70％汇合维护。一天的实验之前，生长的HeLa细胞在DMEM（Dulbecco改良的Eagle培养基，见表材料）和补充有10％FBS（胎牛血清）和1x青霉素/链霉素。
- 在实验的当天，细胞分裂生长在文化（约50％汇合）。
- 用PBS（磷酸盐缓冲盐水）洗涤细胞，暴露在几秒钟约2毫升胰蛋白酶/ EDTA（乙二胺四乙酸）的。吸出多余的胰蛋白酶/ EDTA和保持细胞沐浴在胰蛋白酶/ EDTA的在罩在RT〜3分钟的薄膜。
- 机械摇瓶两次，分离细胞与血清的培养基中。计数细胞，并稀释至5,000 cells/50微升的媒体，并立即板50μL/孔到384孔的玻璃底板使用自动化液体处理机器人（只有30以及该板的S是用在这里）。
- 培养板在室温下30分钟，以尽量减少在井5的边缘效应。后室温孵育地方板在37℃/ 5％CO 2培养箱中过夜。
- 每种药物将被测定一式两份。加入25微升药物对上盘已经包含媒体相应的孔中。
- 固定板在24小时后药物治疗的PBS 4％多聚甲醛溶液。
- 染色法
具体的初级抗体，荧光标记的第二抗体和其他荧光染料这里所使用的列于表材料。- 通透固定的细胞用在TBS中的0.2％的Triton X-100溶液（Tris缓冲盐水）持续3分钟，洗净，用TBST（Tris缓冲盐水+吐温20）3倍。加5％BSA（牛血清白蛋白）溶液在TBST中阻断。
- 培养板在室温下2小时，然后用TBST 3倍。
- 使初级抗体dilut在TBST 5％BSA的离子（见表材料），并加入10微升/孔。培养板在室温下搅拌2小时，然后用TBST洗3次。
- 使在TBST二级抗体dilutionin 5％的BSA（见表材料），并加入10微升/孔。
- 在黑暗中于室温搅拌2小时孵育板，然后用TBST洗涤两次。
- 准备稀释的赫斯特和鬼笔环肽（见表材料）的PBS，加入10微升/孔。
- 将培养板在黑暗中在室温30分钟。
- 经过2 TBST洗，盖板箔及金属储存于4°CO / N。
- 成像
使用20X物镜与1x1的相机分档使用落射荧光显微镜采集图像。获得16图像各孔中，一共有480图像（×3信道）。
2。分析图像
下载和phenoripper.org安装PhenoRipper，并启动PhenoRipper开始伊马分析GES。 PhenoRipper目前支持TIFF，PNG和JPEG和利用MATLAB支持的所有其他格式（显微镜软件通常支持导出成TIFF）。
2.1加载数据
- 没有标准命名/组织惯例存在显微镜图像，它可以使加载图像和相关联的元数据（ 即实验注解，如治疗型，井数等）的工作流程中最具挑战性的部分。选择所呈现的一种方法（下面描述）。
- PhenoLoader：选择此选项可半自动自动加载数据时，文件名 和/或目录结构包含足够的信息以图像组，然后随意（ 如 B16 HeLa_Drug5-DAPI.png可能表明该图像是从井B16，细胞治疗用其ID为5，并且图像捕捉核DAPI染色的药物 - 与此命名惯例，从A1孔或药物5将所有的图像可以很容易地进行分组）。该向导将引导一步将元数据与图像组相关联，并定义标记如下用户的步骤：
- 点击“文件结构”访问到PhenoLoader窗口。
- 点击“定义根目录”，选择包含图像数据集的目录。然后筛选未使用的文件（未使用的文件）进行分析（可选项，可以留空）。
- 点击“定义标记”，以指定在实验中所用的生物标记物，并将其与图像相关联。具体来说，点击一个图像文件，然后选择文件名的一部分唯一标识的生物标志物。最后，输入每个生物标志物的名称。
- 点击“定义元数据”信息与每个图像相关联。具体来说，点击一个图像文件，然后选择文件名 的识别图像信息（ 如 “B16”的井名）的一部分。一个窗口，要求输入群组名称（ 例如 “我们LL“）会弹出，输入一个名称。从文件名 中提取的组的成员将显示在组表（ 如好名的完整列表）。要添加不存在的文件名 的其他信息，请单击” （可选）下一步“按钮，点击”添加元数据组“，输入其他组的名称（ 如 ”药“）和预定义组的每个值（ 如 ”井“），其数值输入（ 如 ”紫杉醇“）有是没有限制的，可以添加额外的基团的数目。
- 最后，点击“创建Metadatafile”生成元数据文件，并继续分析。如果一个元数据文件之前已经产生，可避免使用选项“元数据文件”（在3以下说明）直接加载文件以上步骤。
- 基于正则表达式的模板：正则表达式匹配模式的标准方法在文本。选择此选项时，文件名和/或目录结构包含足够的信息以图像组和命名约定相匹配的预先存在的模板之一。基于正则表达式的自定义模板也可以手动定义和重用。仅建议用户熟悉正则表达式这个高级选项。
- 元数据文件：选择此选项为最终定制。定义和加载一个逗号分隔值包含与每个图像相关的文件名和元数据（CSV）文件。文件格式的一个例子是可在网站（phenoripper.org）的下载部分。只需通过接口加载该文件，以显示其包含的信息。
- PhenoLoader：选择此选项可半自动自动加载数据时，文件名 和/或目录结构包含足够的信息以图像组，然后随意（ 如 B16 HeLa_Drug5-DAPI.png可能表明该图像是从井B16，细胞治疗用其ID为5，并且图像捕捉核DAPI染色的药物 - 与此命名惯例，从A1孔或药物5将所有的图像可以很容易地进行分组）。该向导将引导一步将元数据与图像组相关联，并定义标记如下用户的步骤：
- 选择元数据字段定义了重复实验，以避免重复抽样。对于包含重复（ 例如，在一个良好的所有图像应该是相似的），将它们组合在一起（ 例如，通过井）可以展示次数的数据集奥雅纳性能。在大多数情况下是合理的选择默认选项“随机（不知道）”，它会随机选择一个子集。
2.2设置分析参数
点击“设置参数”定义来处理数据集所需的参数。定义的参数是在左侧面板上。右侧面板显示的数据集的合并范例。点击左/右箭头来不同的图像之间进行切换。
- 阈浓度：选择一个适当的阈值来大致确定图像的细胞部分（而不是背景，非细胞区域）。阈值是由PhenoRipper预先计算，但可以调整使用滚动条可在图像的顶部，以提高蜂窝区域高亮。如果选择的门槛并不在所有影像工作，降低门槛，以包括非细胞区域，而不是下降的细胞区域。
- S座IZE：选择一个合适的块大小（以像素为单位），以网格图像。指定大小的块将被叠加在图像上。调整块尺寸，以获得平均20-30块/单元。叠加网格在图像上点击，在“块大小”字段前面的复选框。
- 可选参数：如果自动缩放的图像不显示具有期望的相对强度的标记（ 例如，一种颜色是饱和的），或者如果标记需要被从分析中删除，则使用“调节通道强度”选项。来识别标记的一个子集蜂窝区域使用选项“使用门槛通道”。默认选择的其他参数通常就足够了，但如果需要的话，使用“高级分析选项”进行调整。
- 按“PhenoRip”在主应用程序面板上的运行分析。 PhenoRipper会自动识别图像中的经常性的块类型。表型的配置文件将用于生成根据它的不同的块类型的分数每幅图像。
3。研究结果
- 探索使用PhenoBrowser（ 图1）的图像的表型分布之间的关系。该PhenoBrowser接口由四个面板：在面板左上角的是不同的图像/条件之间的相对相似的图形表示（散点图），在选定的条件下正确显示样本图像和最后一个面板（条形图的两个面板）比较它们的表型分布。
- “丢弃空帧”使用“数据处理”菜单。
- 除去质量差的图像：首先，要研究单个图像关闭分组从“数据处理”菜单。接下来，通过点击散点图的离群点和丢弃低质量的图像（ 如对焦，染色神器）。
- 探索数据：决定哪些元数据字段定义比较的基本单元（ 例如 ，比较药物，与元数据字段的值相同的“药物”的图像需要被组合在一起）。收起这个元数据字段的值相同的所有图像与“分组依据”单个数据点。例如，通过药物分组将每种药物内平均的图像，得到每药1点。在散点图附近（或远）点反映引起类似的（或不同）的细胞表型的条件。颜色或标注点（数据显示菜单）的基础上可用的元数据，以帮助解释性。 3D图是可旋转通过点击“旋转”复选框，并单击左键并拖动鼠标时。
- 选择两个不同的点，它们直接比较。图像的面板将显示样本图像的每个点，和条形图面板将显示块类型，其发生频率是两个点之间的最不同。
- 启动了Clustergram从“Clustergram菜单”提供的块类型和实验条件之间的关系更具全球性的观点。通过将两种块类型和条件，这代表强调了细胞表型最能区分条件组（ 图5）。
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Representative Results
在这里，我们测试了这个工作流的分组药物根据其作用机制的能力。将HeLa细胞接种在30孔384 - 孔板的和染色的DNA /肌动蛋白/α-微管蛋白。具体的初级抗体，荧光标记的第二抗体，并且所使用的其他荧光染料列于表材料。井均采用属于三个机制类（组蛋白去乙酰化酶抑制，微管定位和DNA损伤），24小时，并使用萤光显微镜20X物镜放大成像15药物。购入十六画面各孔，共480图像（×3信道）。这里所描述的数据可以从www.phenoripper.org下载。
如上所述，PhenoRipper来分析这些图像。前景阈值被设定为5％（最大可能的强度即 5％）和块大小为20像素（FIGUR E 2）。这组数据的分析，花了大约10分钟的标准台式计算机（64位，8芯机为3.2GHz，具有16 GB的RAM）。该PhenoBrowser界面（ 图3）被用来探索的结果。成像伪影，例如染色差，空帧很容易识别，因为他们站出来为清晰的异常点（ 图4）。图像之间的相对的表型相似性可视化在图3中，使用多维标度的左上面板。每个点代表了其作用的药物的机制着色的单个图像。此图显示，表型访问可以通过它们的作用机制被用来组药物。数据的clustergram（ 图5）涉及该分组的表型分布。
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图1。工作流使用PhenoRipper荧光显微镜的细胞系接种到板上，然后扰动被添加到每个孔中，将板温育。图像是使用一种自动化显微镜获得的，然后使用PhenoRipper迅速地进行分析。因此，目前的实验结果成像后不久，是已知的可以，如果需要的话，可以用来提炼设置为将来的迭代。 点击这里查看大图 。
图2。设置PhenoRipper参数：块大小和阈强度使用的是图形化界面，实时可视化feedbac设置 K表。 点击这里查看大图 。
图3。 PhenoBrowser接口为探索PhenoRipper结果：PhenoBrowser界面分为四个小组：左上面板是一个散点图显示不同的图像/的条件下，对选定的条件下，正确的显示样本图像的两个面板，和左下之间的相对相似性面板的表型分布进行比较。 点击这里查看大图 。
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图4。在散点图（高亮显示），显示染色神器（见视频）离群值的例子。 点击这里查看大图 。
图5。的PhenoRipper型材Clustergram表示：每一行代表一个单一的药物，而每一列块类型。灰度值反映的表型分布， 即对每种药品不同的块类型的比例。更轻的值表示块类型的较高比例。层次聚类很大程度上分隔不同的药物通过药物类（红/蓝/克右边EEN颜色）。 点击这里查看大图 。
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Discussion
这里所描述的工作流程允许快速和容易表征和显微镜图像的对比。我们首先演示了如何这个工作流程可以帮助实验优化，例如通过快速执行质量控制的显微镜图像。接下来，我们展示了其潜力分析的高通量筛选数据：我们可以根据它们的作用机制组药物。药物的分组是可比较的，使用更复杂的方法6中发现，即使PhenoRipper是快几个数量级。
虽然我们已经发现这种方法对零星的实验波动健壮，与任何基于图像的方法，读数会受到系统的非生物效应。例如，板与板的变异标记物的强度可能会掩盖感兴趣的生物学效应。这种文物的影响，可在适当的修正7，减少8，如对迟到板正常化和背景减法。通过PhenoRipper生成的访问还可以通过改变在细胞密度的影响。而这种行为通常是可取（反映存活或生长），其效果可以通过取消选择“高级参数”中的“使用背景信息”选项被减少。
在选择适当的方法进行分析，用户需要考虑速度，易用性和分析详细程度之间的权衡。分割自由方法9-11如PhenoRipper通常是更快，更容易比单细胞为基础的方法，如CellProfiler 2使用。的分割自由方法的缺点是不能进行量化特定的单细胞特性。因此，用户需要决定根据他或她的需求选择相应的方法。当准确的比较的实验条件或分组是主要目标，我们已经发现的水平详细的PhenoRipper捕获是绰绰有余。特别是，研究人员专注于高通量实验将从快速，轻松地探索图像数据的能力大大受益。总之，这里介绍的工作流程可以让板凳科学家能够轻松地收购后不久，探索它们的荧光显微镜图像，并促进分析和成像之间的快速周转。我们相信，此工作流将降低门槛来进行图像定量分析。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢亚当·科斯特和Altschuler领导和吴实验室进行有益的反馈和讨论的所有其他成员。这项研究是由美国国家卫生研究所的支持下授予R01 GM085442和CA133253（SJA），R01 GM081549（LFW），CPRIT RP10900（LFW）和韦尔奇基金会的I-1619（SJA）和I-1644（LFW）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965 | High Glucose, L-Glutamine |
| Marker Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | DNA stain, dilution 1:2,000 of 5 mg/ml stock |
| Marker phalloidin-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A12379 | Conjugated phallotoxin, dilution 1:200 |
| Primary Antibody α-tubulin | Sigma | T9026 | Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200 |
| Secondary Antivody anti-Mouse TRITC | Jackson | 115-025-166 | Conjugated secondary Ab, 0.5 mg in 1 ml PBS + 1 ml glycerol |
| Aldosterone | concentration used: 0.2 μM | ||
| Apicidin | concentration used: 20 μM | ||
| Colchicine | concentration used: 0.16 μM | ||
| Cortisol | concentration used: 0.2 μM | ||
| Dexamethasone | concentration used: 0.2 μM | ||
| Docetaxel | concentration used: 0.2 μM | ||
| M344 | concentration used: 20 μM | ||
| MS-275 | concentration used: 5 μM | ||
| Nocodazole | concentration used: 0.3 μM | ||
| Prednisolone | concentration used: 0.2 μM | ||
| RU486 | concentration used: 0.2 μM | ||
| Scriptaid | concentration used: 70 μM | ||
| Taxol | concentration used: 0.3 μM | ||
| Trichostatin A | concentration used: 0.2 μM | ||
| Vinorelbine | concentration used: 0.3 μM |
References
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