Summary
Her beskriver vi en arbeidsflyt for raskt å analysere og utforske samlinger av fluorescens mikroskopi bilder ved hjelp PhenoRipper, en nylig utviklet bildeanalyse-plattform.
Abstract
Til tross for raske fremskritt innen high-throughput mikroskopi, kvantitative bildebaserte analyser fortsatt utgjøre betydelige utfordringer. Mens en rekke spesialiserte verktøy for bildeanalyse er tilgjengelige, de fleste tradisjonelle bildeanalyse-baserte arbeidsflyter har bratte læringskurver (for finjustering av analyseparametere) og resultere i lang behandlingstid mellom avbildning og analyse. Spesielt celle segmentering, prosessen med å identifisere enkeltceller i et bilde, er en stor flaskehals i denne forbindelse.
Her presenterer vi en alternativ, celle-segmentering-fri arbeidsflyt basert på PhenoRipper, en åpen kildekode-plattform designet for rask analyse og utforsking av mikroskopi bilder. Rørledningen som presenteres her er optimalisert for immunfluorescens mikroskopi bilder av cellekulturer og krever minimal brukermedvirkning. Innen en halv time, kan PhenoRipper analysere data fra en typisk 96-godt eksperiment og generere bildeprofilene. Brukere kanderetter visuelt utforske sine data, utføre kvalitetskontroll på sitt eksperiment, sikre svar på forstyrrelser og sjekke reproduserbarhet replikater. Dette muliggjør en rask tilbakemelding syklus mellom analyse og forsøket, som er avgjørende under assay optimalisering. Denne protokollen er nyttig ikke bare som en første-passasje-analyse for kvalitetskontroll, men også kan anvendes som en ende-til-ende-løsning, spesielt for screening. Denne arbeidsflyten beskrevet her skaleres til store datasett slik som de som genereres av high-throughput-skjermer, og har vist seg å gruppere eksperimentelle betingelser ved fenotype nøyaktig over et bredt spekter av biologiske systemer. Den PhenoBrowser grensesnitt gir en intuitiv rammeverk for å utforske den fenotypiske plass og forholde bildeegenskaper til biologiske merknader. Til sammen vil protokollen beskrevet her senke barrierene for å ta i bruk kvantitativ analyse av bildebasert skjermer.
Introduction
I løpet av det siste tiåret, har raske fremskritt innen bildeteknologi gitt mange laboratorier evnen til å utføre høy gjennomstrømming mikroskopi. Utfordringen er nå flyttet fra en av avbildning til en av analyse. Hvordan kan vi karakterisere, sammenligne, og utforske torrent av komplekse ennå subtile fenotyper generert av en typisk high-throughput bildeskjermen?
En rekke av bildeanalyse og informatikk plattformer har gitt brukere sofistikerte verktøykasser 1-3 for utpakking biologisk informasjon fra store samlinger av bilder. Men mange betydelige hindringer gjenstår i å analysere data fra high-throughput bildebaserte skjermer. Vanskeligheter involvert i valg av passende karakteristikk av de bildene og finjustering av algoritmiske parametre (til systemet av interesse) ofte resultere i lange innstillingstider, særlig for brukere uten bilde-analysekompetanse. Spesielt celle segmentering, prosessen med å identifisere de enkelte celler i enn bilde, er en stor flaskehalsen i denne forbindelse. Segmentering kan være svært følsomme for eksperimentelle parametere som celletypen, celletetthet og biomarkører og krever ofte gjentatt justering for et stort datasett. Av disse grunner, er bildeanalyse ofte en uavhengig, terminal trinn utføres av fagfolk i stedet for en integrert del av den eksperimentelle arbeidsflyten. Dette utelukker en hurtig tilbakemelding syklus mellom analyse og eksperiment, en viktig del av analysen utvikling.
Her beskriver vi en alternativ arbeidsflyt som er optimalisert for høy gjennomstrømning fluorescensmikroskopi og unngår mange av de forannevnte vanskeligheter. For å oppnå dette, benytter vi PhenoRipper 4, en åpen kildekode-plattform for rask utforskning og analyse av mikroskopi bilder. Betydelig, unngår PhenoRipper mange av de utfordringene som er involvert med celle segmentering ved ikke å forsøke å identifisere enkeltceller. I stedet deler PhenoRipper bilder til pixelblokker av subcellulære størrelse og karakteriserer bildene i form av blokkene de inneholder. Spesielt profiler PhenoRipper blokker i form av markør-colocalization baserte funksjoner og automatisk identifiserer fire de mest representative blokktypene i treningsbilder. PhenoRipper deretter tildeler hver blokk den mest lignende representant blokktype, og til slutt karakteriserer bilder basert på hvilke typer av blokkene de inneholder.
Sammenlignet med mer tradisjonelle encellede baserte tilnærminger, denne tilnærmingen krever minimalt med finjustering og kompetanse. Som sådan brukerne trenger bare å innstille to parametre: blokkstørrelse og en terskelintensitet (for å forkaste-cellulære deler av et bilde), som begge er angitt med grafisk tilbakemelding. Viktigere, har arbeidsflyten beskrevet her blitt vist 4 å skalere lett til mye større datasett, der hastighet og minimal finjustering gir stor tid og pålitelighet gevinster. I praksis finner vi at denne appenmort reduserer den tiden som kreves både for oppsett og drift av flere størrelsesordener fire.
Den primære produksjonen av PhenoRipper er en visuell representasjon av bildet likheten, som gjør det mulig å identifisere grupper av forsøksbetingelser som forårsaker celler til å vise tilsvarende fenotyper. De grupperinger PhenoRipper finner vanligvis har sammenlignbare "biologisk interpretability" til de som skapes av mer tidkrevende, celle-baserte metoder fire. I praksis betyr dette at ofte, innen en halv time til å utføre en typisk 96-vel fluorescens mikros eksperiment, en eksperimentator uten bildeanalyse-erfaring kan få en pålitelig avlesning om utførelsen av hans eller hennes eksperiment. Eksperimentator kan deretter begynne å utforske relasjonene mellom ulike eksperimentelle forhold og om disse sammenhengene til bilde fenotyper.
Vi demonstrerer denne arbeidsflyten her ved å analysere virkningeneav narkotika i forskjellige mekanistiske klasser på HeLa celler farget for DNA og cytoskeletal markører. Bilder av celler behandlet med den samme klassen av narkotika ble gruppert sammen, og dårlig kvalitet på bilder (flekker gjenstander, ute av fokus celler og så videre) dukket opp som uteliggere, noe som gjør dem enkle å identifisere og potensielt kast.
Mens denne arbeidsflyten er nyttig for et stort antall bildebaserte analyser, er det helt klart mange situasjoner hvor en annen tilnærming kan potensielt være mer informativ. For eksempel, er utgangen fra PhenoRipper primært en relativ sammenligning av fluorescens-mønstre på tvers av eksperimentelle betingelser. Dersom en absolutt karakterisering av en bestemt enkelt celle egenskap var nødvendig i stedet (for eksempel antallet flekker i en celle), vil en enkelt-celle-baserte analyser være nødvendig. Likevel, selv i denne typen situasjon, er PhenoRipper sannsynlig å oppdage endringer i disse encellede fenotyper og derfor være et nyttig verktøy for analyse optimization.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Forbereder Prøver og Imaging
- Cellekultur
- Splitte kulturer rutinemessig og vedlikeholde på 20-70% samløpet. En dag før eksperimentet, vokse HeLa celler i DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium, se tabell for material) og supplert med 10% FBS (Fetal Bovine Serum) og 1x penicillin / streptomycin.
- På dagen av eksperimentet, dele celler som vokser i kultur (ca 50% sammenflytende).
- Vask cellene med PBS (fosfatbufret saltvann), utsettes for ca 2 ml trypsin / EDTA (etylendiamintetraeddiksyre) til et par sekunder. Aspirer skytende trypsin / EDTA og holde celler badet i en tynn film av trypsin / EDTA i hetten ved RT i ~ 3 minutter.
- Mekanisk riste kolber to ganger og koble celler med serum supplert media. Telle celler og fortynne til 5000 cells/50 mL av media og umiddelbart plate 50 mL / brønn på en 384-godt glass bunnplaten ved hjelp av en automatisert væske håndtering robot (bare 30 godts av platen er anvendt her).
- Inkuber platene ved romtemperatur i 30 min for å redusere kanteffekter i brønner 5. Etter RT inkubasjon, sted plater i en 37 ° C / 5% CO 2 inkubator over natten.
- Hvert medikament vil bli analysert i duplikat. Tilsett 25 pl av medikament til de tilsvarende brønner på platen som allerede inneholdende media.
- Fix plate med 4% paraformaldehyde løsning i PBS ved 24 timers etter medikamentell behandling.
- Farging
De spesifikke primære antistoffer, fluorescently-merket sekundære antistoffer og andre fluorescerende flekker som ble brukt her er listet opp i tabell for materialteknologi.- Permeabilize fast cellene med 0,2% Triton X-100 oppløsning i TBS (Tris-bufret saltløsning) i 3 min, og vask med TBST (Tris-bufret saltløsning + Tween 20) 3x. Tilsett 5% BSA (bovint serumalbumin) løsning i TBST for blokkering.
- Inkuber platene ved romtemperatur i 2 timer og vaskes deretter med TBST 3x.
- Gjør primære antistoff fortynnetioner i 5% BSA i TBST (se tabell for material) og tilsett 10 mL / brønn. Inkuber platene ved romtemperatur i 2 timer, og deretter vaskes 3x med TBST.
- Gjør sekundært antistoff dilutionin 5% BSA i TBST (se tabell for material) og tilsett 10 mL / brønn.
- Inkuber platen i mørke ved RT i 2 timer og deretter vaskes to ganger med TBST.
- Forbered fortynninger for Hoechst og phalloidin (se tabell of Materials) i PBS og tilsett 10 mL / brønn.
- Inkuber platen i mørke i 30 min ved RT.
- Etter to TBST vasker, dekkplater i folie og oppbevar ved 4 ° CO / N.
- Imaging
Hente bilder ved hjelp av en epifluorescence mikroskop bruker en 20X objektiv med 1x1 kamera binning. Acquire seksten bilder for hver brønn, for totalt 480 bilder (x3 kanaler).
2. Analysere Images
Last ned og installer PhenoRipper fra phenoripper.org, og lansere PhenoRipper å begynne analysen av imatot.. PhenoRipper støtter for tiden TIFF, PNG, og JPEG og alle andre formater som støttes av MATLAB (mikroskop programvare vanligvis støtter eksport til TIFF).
2.1 lasting av data
- Ingen standard navngiving / organisasjon konvensjonen finnes for mikroskopi bilder, som kan gjøre lasting av bilder og knytte metadata (dvs. eksperimentell merknader som behandlingstype, brønn nummer og så videre) den mest utfordrende delen av arbeidsflyten. Velge en av de presenterte metoder (beskrevet nedenfor).
- PhenoLoader: Velg dette alternativet til semi-automatisk laste data når filnavnet og / eller katalogstruktur inneholde nok informasjon til gruppebilder som ønsket (f.eks B16 HeLa_Drug5-DAPI.png kan tyde på at bildet er fra vel B16, er celler behandlet med stoffet som har IDen 5, og bildet fanger atom DAPI flekken - med denne navnekonvensjonen, kunne alle bildene fra brønn A1 eller behandlet med Drug 5 lett bli gruppert). Veiviseren vilveilede brukeren steg for steg for å assosiere metadata med bildegrupper og definere merkene slik:
- Klikk på "File Structure" for å få tilgang til PhenoLoader vinduet.
- Klikk på "Define Root Directory" for å velge mappen som inneholder bildet datasett. Deretter filtrere filene som ikke brukes (ubrukte filer) for analyse (valgfritt, kan stå tomme).
- Klikk på "Definer Markers" for å spesifisere biomarkører som brukes i forsøket, og knytte dem sammen med bildene. Nærmere bestemt, klikk på en bildefil velg deretter en del av filnavnet som entydig identifiserer biomarkører. Til slutt, skriv inn et navn for hver biomarkør.
- Klikk på "Define Metadata" for å knytte informasjon med hvert bilde. Nærmere bestemt, klikk på en bildefil, og deretter velge en del av filnavnet identifisere bildeinformasjon (for eksempel "B16" for godt navn). Et vindu ber om et gruppenavn (f.eks "Vill ") vil komme opp, skriv inn et navn. Medlemmer av gruppen hentet fra filnavnet bli vist på gruppetabellen (f.eks den fullstendige listen over brønn navn). For å legge til ytterligere informasjon ikke er til stede i filnavnet, klikk på" (valgfritt) Neste "-knappen. Klikk på" Legg til metadata Group ", skriver du inn ekstra gruppe navn (f.eks" Drug ") og for hver verdi av den forhåndsdefinert gruppe (for eksempel" Well "), angir sin verdi (for eksempel" Taxol ") . Det er ingen grense for hvor mange flere grupper som kan legges.
- Til slutt klikker du på "Opprett Metadatafile" for å generere metadata-filen og fortsette analysen. Hvis en metadata-fil har tidligere blitt generert, kan fremgangsmåten ovenfor unngås ved direkte laste ned filen ved hjelp av alternativet "Metadata File" (beskrevet i 3 nedenfor).
- Regular Expression Basert Maler: Regulære uttrykk er en standard tilnærming for matchende mønstrei tekst. Velg dette alternativet når filnavnet og / eller katalogstruktur inneholde nok informasjon til gruppebilder og navnekonvensjonen samsvarer med ett av de pre-eksisterende maler. Egendefinerte maler basert på regulære uttrykk kan også manuelt defineres og brukes på nytt. Denne avanserte alternativet anbefales kun for brukere kjent med regulære uttrykk.
- Metadata Fil: Velg dette alternativet for ultimate skreddersy. Definer og laste en kommaseparert verdier (CSV)-fil som inneholder filnavn og metadata knyttet til hvert bilde. Et eksempel på filformatet er tilgjengelig på nedlastings delen av nettsiden (phenoripper.org). Bare laste ned filen gjennom grensesnittet for å vise informasjonen den inneholder.
- PhenoLoader: Velg dette alternativet til semi-automatisk laste data når filnavnet og / eller katalogstruktur inneholde nok informasjon til gruppebilder som ønsket (f.eks B16 HeLa_Drug5-DAPI.png kan tyde på at bildet er fra vel B16, er celler behandlet med stoffet som har IDen 5, og bildet fanger atom DAPI flekken - med denne navnekonvensjonen, kunne alle bildene fra brønn A1 eller behandlet med Drug 5 lett bli gruppert). Veiviseren vilveilede brukeren steg for steg for å assosiere metadata med bildegrupper og definere merkene slik:
- Velg metadatafelt som definerer gjentak i forsøket for å unngå overflødig prøvetaking. For datasett som inneholder gjentak (f.eks alle bilder i en brønn bør være lik), gruppere dem sammen (for eksempel ved godt) kan Visnove ytelse. I de fleste tilfeller er det fornuftig å velge standardvalget "Random (vet ikke)" som velger en tilfeldig undergruppe.
2.2 Innstilling analyseparametere
Klikk på "Set Parametere" for å definere parametere som er nødvendige for å behandle datasettet. Parametrene å definere er på venstre panel. Panelet til høyre viser en sammenslått utvalg av datasettet. Klikk på venstre / høyre piltast for å bytte mellom forskjellige bilder.
- Terskel Intensitet: Velg et passende terskelverdien til omtrent identifisere de cellulære delene (heller enn bakgrunnen,-cellulære regioner) av bilder. En terskel er forhåndskalkulerte av PhenoRipper, men kan justeres for å bedre synliggjøring av mobilnettet regioner ved hjelp av rullefeltet tilgjengelig på toppen av bildet. Hvis en valgt terskel ikke fungerer på tvers av alle bildene, senke terskelen for å inkludere-cellulære regioner i stedet for å slippe mobil regioner.
- Block Size: Velg et passende blokkstørrelse (i piksler) til rutenett bildet. Blokker av spesifisert størrelse vil bli lagt oppå bildet. Juster blokkstørrelse for å få et gjennomsnitt på 20 til 30 blokker / celle. For å vise rutenettet over bildet, klikk på boksen foran "Block Size"-feltet.
- Valgfrie parametere: Hvis auto-skalert bildene ikke vises markører med ønskede relative intensiteter (f.eks én farge er mettet) eller hvis markører trenger å bli utelatt fra analysen, bruke "Juster Channel Intensitet" alternativet. Å identifisere cellulære regioner på en undergruppe av markører bruker de "kanaler som brukes for Threshold" alternativet. Standard valg av andre parametre er vanligvis tilstrekkelig, men om nødvendig, justere dem ved hjelp av "Advanced Analysealternativer".
- Kjør analysen ved å trykke "PhenoRip" på den viktigste applikasjonen panel. PhenoRipper vil automatisk identifisere tilbakevendende blokktyper i bildene. Fenotypiske profiler vil bli generert forhvert bilde basert på andelene av de forskjellige typer blokk i den.
Tre. Exploring Resultater
- Undersøke relasjonene mellom de fenotypiske profiler av bildene ved hjelp av PhenoBrowser (Figur 1). Den PhenoBrowser Grensesnittet består av fire felt: øvre venstre panel er en grafisk fremstilling (punktplott) av den relative likheten mellom forskjellige images / tilstander, de to panelene på høyre skjerm eksempler på bilder av utvalgte forhold, og den avsluttende panel (stolpediagram ) sammenligner sine fenotypiske profiler.
- "Kast tomme rammer" ved hjelp av "Data Processing"-menyen.
- Fjern dårlig kvalitet på bilder: Først, for å studere enkeltbilder slå av gruppering fra "Data Processing"-menyen. Deretter klikker gjennom avvikende punktene i spredningsplott og kast bilder med lav kvalitet (f.eks ute av fokus, farging artefakt).
- Utforsk data: Bestem hvilke metadatafelt definereren grunnleggende enhet sammenligning (for eksempel for å sammenligne narkotika, bilder med samme verdi for metadatafeltet "narkotika" må grupperes sammen). Skjul alle bildene med den samme verdien av denne metadata feltet til en enkelt datapunkt med "Grupper etter". For eksempel vil gruppering av medikament gjennomsnittet bildene i hver medikament for å gi en punkt per medikamentet. Andre (eller fjerne) punkter i punktplottet reflektere forhold som framprovosere lignende (eller ulike) cellulære fenotyper. Farge eller etikett poeng (data skjerm menyen) basert på tilgjengelig metadata for å hjelpe interpretability. 3D-tomten er dreibar ved å klikke på "roterbar" boksen og ved å klikke på venstre knapp og dra musen over den.
- Velg to forskjellige punkter for å sammenligne dem direkte. Bildepaneler vil vise eksempler på bilder for hvert punkt, og stolpediagram panelet vil vise hvilke typer blokk hvis forekomst frekvenser er mest forskjellig mellom de to punktene.
- Start clustergram fra "Clustergram menyen" for å gi et mer globalt syn på forholdet mellom blokktyper og eksperimentelle forhold. Ved å gruppere begge typer og tilstander blokk, fremhever denne representasjonen de cellulære fenotyper som best skiller grupper av tilstander (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her har vi testet evnen til denne arbeidsflyten å gruppere legemidler basert på deres virkningsmekanisme. HeLa-celler ble utsådd i 30 brønner i en 384-brønners plate og farget for DNA / actin / α-tubulin. De spesifikke primære antistoffer, fluorescently-merket sekundære antistoffer, og andre fluorescerende flekker som ble brukt, er oppført i tabell for materialteknologi. Brønner ble behandlet med 15 medikamenter som tilhører tre mekanistiske klasser (histon deacetylase inhibering, microtubule målretting og DNA-ødeleggende) i 24 timer og avbildes ved hjelp av en epifluorescence mikroskop ved 20X objektiv forstørrelse. Seksten bildene ble kjøpt for hver brønn, for totalt 480 bilder (x3 kanaler). Dataene som er beskrevet her kan lastes ned fra www.phenoripper.org.
Som beskrevet ovenfor, ble PhenoRipper brukt for å analysere disse bildene. Den forgrunnen terskelen ble satt til 5% (dvs. 5% av den maksimalt mulige intensitet) og blokkstørrelsen til 20 piksler (Figur e 2). Analyse av dette datasettet tok ca 10 min på en standard stasjonær PC (en 64 bit, 8 core maskin på 3,2 GHz, med 16 GB RAM). Den PhenoBrowser grensesnittet (figur 3) ble brukt til å undersøke resultatene. Bildebehandling gjenstander som dårlig flekker og tomme rammer var lett å identifisere siden de skilte seg ut som klare uteliggere (figur 4). De relative fenotypiske likheter mellom bildene er visualisert i øvre venstre panel av figur 3 ved hjelp av flerdimensjonal skalering. Hvert punkt representerer et enkelt bilde farget ved sin stoffets virkningsmekanisme. Dette plottet viser at fenotypisk profiler kan brukes for å grupper medikamenter ved deres virkningsmekanisme. En clustergram av dataene (figur 5) vedrører denne gruppering til de fenotypiske profiler.
s/ftp_upload/51280/51280fig1.jpg "width =" 600px "/>
Figur 1. Arbeidsflyt for fluorescensmikroskopi ved bruk PhenoRipper. Cellelinjer blir utsådd i en plate, og perturbasjoner blir tilsatt til hver brønn og platen inkuberes. Bildene er kjøpt ved hjelp av en automatisert mikroskop og deretter raskt analysert ved hjelp PhenoRipper. Dermed blir resultatet av dagens eksperimentet kjent kort tid etter bildebehandling og kan, om nødvendig, brukes til å avgrense oppsettet for fremtidige gjentakelser. Klikk her for å se større bilde .
Figur 2. Innstilling PhenoRipper parametere: blokkstørrelse og terskel intensitet er satt ved hjelp av et grafisk grensesnitt med sanntid visuell feedbac k. Klikk her for å se større bilde .
Figur 3. PhenoBrowser Interface for å utforske PhenoRipper resultater: PhenoBrowser grensesnittet er delt inn i fire paneler: det øverste venstre panel er et spredningsdiagram som viser de relative likheter mellom forskjellige bilder / forhold, de to panelene på høyre skjerm eksempler på bilder av utvalgte forhold, og nederst til venstre panel sammen sine fenotypiske profiler. Klikk her for å se større bilde .
load/51280/51280fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51280/51280fig4.jpg "width =" 600px "/>
Figur 4. Eksempel på en avvikende i spredningsplott (uthevet) som viser en flekker gjenstand (se video). Klikk her for å se større bilde .
Figur 5. Clustergram representasjon av PhenoRipper profiler: Hver rad representerer et enkelt stoff, og hver kolonne en blokk type. De gråskalaverdier reflektere fenotypiske profiler, dvs. brøkdel av de ulike typer blokk for hvert stoff. En lettere verdi indikerer høyere brøkdel av den blokken type. Hierarkisk clustering i stor grad skiller de forskjellige narkotika etter narkotika klasse (rød / blå / green farger til høyre). Klikk her for å se større bilde .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Arbeidsflyten er beskrevet her gir rask og enkel karakterisering og sammenligning av mikroskopi bilder. Vi først demonstrert hvordan denne arbeidsflyten kan hjelpe eksperiment optimalisering, for eksempel ved raskt å utføre kvalitetskontroll på mikroskopi bilder. Deretter viste vi potensialet for å analysere high-throughput screening data: vi var i stand til å gruppere legemidler basert på deres virkningsmekanisme. Grupperingen av narkotika var sammenlignbar med det som ble funnet ved hjelp av mer komplekse metoder 6, selv om PhenoRipper var størrelsesordener raskere.
Selv om vi har funnet at denne tilnærmingen robust mot sporadiske eksperimentelle svingninger, som med en hvilken som helst bilde basert tilnærming, vil avlesninger bli påvirket av systema nonbiological effekter. For eksempel kan plate-til-plate-variasjon i intensitet markør maskere de biologiske effekter av interesse. Virkningen av slike gjenstander kan bli redusert med nødvendige rettelsene 7, 8 slik som psent til plate normalisering og bakgrunn subtraksjon. Profilene som genereres av PhenoRipper kan også være påvirket av variasjoner i celletetthet. Selv om denne atferden er vanligvis ønskelig (reflekterer overlevelse eller vekst), kan effekten bli redusert med un-velge "Bruk Bakgrunnsinformasjon" i "Avanserte parametere".
I å velge riktig metode for analyse, brukerne må vurdere kompromisset mellom hastighet, brukervennlighet og grad av analytisk detalj. Segmentering frie metoder 9-11 som PhenoRipper er vanligvis raskere og enklere å bruke enn én celle-baserte metoder som CellProfiler to. Ulempen med segmentering frie metoder er den manglende evne til å kvantifisere spesifikke encellede egenskaper. Brukeren trenger altså å finne den riktige tilnærmingen basert på hans eller hennes behov. Når nøyaktig sammenligning eller gruppering av eksperimentelle forhold er hovedmålet, har vi funnet at nivået avdetalj fanget av PhenoRipper er mer enn tilstrekkelig. Spesielt fokuserte forskerne på high-throughput eksperimenter vil ha stor nytte av muligheten til å raskt og enkelt utforske bildedataene. I konklusjonen, vil arbeidsflyten presenteres her tillate benk forskere til å utforske sine fluorescens mikroskopi bilder snart etter oppkjøpet, og legge til rette for en rask turn-around mellom analyser og bildebehandling. Vi tror denne arbeidsflyten vil senke barrieren for å utføre kvantitativ bildeanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Adam Coster og alle andre medlemmer av Altschuler og Wu laboratorier for nyttig tilbakemelding og diskusjoner. Denne forskningen ble støttet av National Institute of Health gir R01 GM085442 og CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW), og Welch Foundation I-1619 (SJA) og I-1644 (LFW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965 | High Glucose, L-Glutamine |
| Marker Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | DNA stain, dilution 1:2,000 of 5 mg/ml stock |
| Marker phalloidin-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A12379 | Conjugated phallotoxin, dilution 1:200 |
| Primary Antibody α-tubulin | Sigma | T9026 | Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200 |
| Secondary Antivody anti-Mouse TRITC | Jackson | 115-025-166 | Conjugated secondary Ab, 0.5 mg in 1 ml PBS + 1 ml glycerol |
| Aldosterone | concentration used: 0.2 μM | ||
| Apicidin | concentration used: 20 μM | ||
| Colchicine | concentration used: 0.16 μM | ||
| Cortisol | concentration used: 0.2 μM | ||
| Dexamethasone | concentration used: 0.2 μM | ||
| Docetaxel | concentration used: 0.2 μM | ||
| M344 | concentration used: 20 μM | ||
| MS-275 | concentration used: 5 μM | ||
| Nocodazole | concentration used: 0.3 μM | ||
| Prednisolone | concentration used: 0.2 μM | ||
| RU486 | concentration used: 0.2 μM | ||
| Scriptaid | concentration used: 70 μM | ||
| Taxol | concentration used: 0.3 μM | ||
| Trichostatin A | concentration used: 0.2 μM | ||
| Vinorelbine | concentration used: 0.3 μM |
References
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (2006).
- Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis. PLoS Comput. Biol. 6, (2010).
- Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images. Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
- Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).
- Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. Quantitative analysis of digital microscope images. Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).
- Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. Image calibration in fluorescence microscopy. J Microsc. 216, 15-24 (2004).
- Shamir, L., et al. Wndchrm - an open source utility for biological image analysis. Source Code Biol. Med. 3, 13 (2008).
- Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. Statistical and visual differentiation of subcellular imaging. BMC Bioinform. 10, 94 (2009).
- Huang, K., Murphy, R. F. Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells. IEEE Int. Symp. Biomed. Imag. Macro Nano, 2004 Apr 15-18, 2, 1139-1142 (2004).
