Summary
Här beskriver vi ett arbetsflöde för att snabbt analysera och utforska samlingar av fluorescens mikroskopi bilder med PhenoRipper, en nyutvecklad bildanalysplattform.
Abstract
Trots snabba framsteg inom high-throughput mikroskopi, kvantitativa bildbaserade analyser utgör fortfarande stora utmaningar. Även en mängd specialiserade bild analysverktyg finns tillgängliga, de flesta traditionella bild-analys-baserade arbetsflöden har branta inlärningskurvor (för finjustering av analysparametrar) och leda till långa handläggningstider mellan bildbehandling och analys. Särskilt cell segmentering, processen att identifiera enskilda celler i en bild, är en stor flaskhals i detta avseende.
Här presenterar vi en alternativ, cell-segmentefritt arbetsflöde baserad på PhenoRipper, en öppen källkod plattform utformad för snabb analys och utforskning av mikroskopi bilder. Rörledningen som presenteras här är optimerad för immunofluorescens mikroskopi bilder av cellkulturer och kräver minimal användarinblandning. Inom en halvtimme, kan PhenoRipper analysera data från en typisk 96-bra experiment och genererar bildprofiler. Användare kansedan visuellt utforska sina uppgifter, utföra kvalitetskontroll på deras experiment, se svar på störningar och kontrollera reproducerbarhet replikat. Detta underlättar en snabb återkoppling cykel mellan analys och experiment, vilket är avgörande under analysoptimering. Detta protokoll är användbar inte bara som ett första passage-analys för kvalitetskontroll, utan även kan användas som en end-to-end-lösning, speciellt för screening. Arbetsflödet beskrivs här skalor till stora datauppsättningar, såsom de som genereras av hög genomströmning skärmar, och har visats för att gruppera experimentella betingelser genom fenotyp noggrant över ett brett område av biologiska system. Den PhenoBrowser gränssnittet ger en intuitiv ram för att utforska den fenotypiska utrymme och relatera bildegenskaper till biologiska anteckningar. Sammantaget kommer det protokoll som beskrivs här minska hindren för att anta kvantitativ analys av bildbaserade skärmar.
Introduction
Under det senaste årtiondet har snabba utvecklingen inom bildteknik gett många labb förmågan att utföra hög genomströmning mikroskopi. Utmaningen har nu flyttats från en av avbildning till en av analys. Hur kan vi beskriva, jämföra, och utforska torrent av komplexa men ändå subtila fenotyper som genereras av en typisk high-throughput imaging skärm?
Ett antal bild-analys och informatikplattformar har gett användarna avancerade verktygslådor 1-3 för att extrahera biologisk information från stora samlingar av bilder. Men många fortfarande stora hinder i att analysera data från high-throughput bildbaserade skärmar. Problem i samband med val av lämpliga beskrivningar av bilder och finjustering av algoritmiska parametrar (till systemet med ränta) resulterar ofta i långa ställtider, särskilt för användare utan bild-analys expertis. Särskilt cell segmentering, processen för identifiering av individuella celler i enn bild, är en stor flaskhals i detta avseende. Segmentering kan vara mycket känsliga för experimentella parametrar som celltyp, celltäthet och bio-markörer, och ofta krävs upprepad justering för en stor datamängd. Av dessa skäl är bildanalys ofta en oberoende, terminala steg som utförs av specialister snarare än en integrerad del av den experimentella arbetsflöde. Detta utesluter snabb återkoppling cykeln mellan analys och experiment, en viktig del av analysutveckling.
Här beskriver vi ett alternativt arbetsflöde som är optimerad för hög genomströmning fluorescensmikroskopi och undviker många av de ovannämnda svårigheterna. Därför använder vi oss av PhenoRipper 4, en öppen källkod plattform för snabb undersökning och analys av mikroskopi bilder. Betecknande PhenoRipper undviker många av de utmaningar som med cellsegmentering genom att inte försöka identifiera enskilda celler. Istället PhenoRipper delar in bilden i bildpunktblock av subcellulär storlek och karaktäriserar bilder i termer av de block som de innehåller. Specifikt PhenoRipper profiler block i form av markör-colocalization-baserade funktioner och automatiskt identifierar fyra de mest representativa blocktyper i träningsbilder. PhenoRipper delar sedan till varje block det mest liknande representativa blocket typ, och slutligen präglar bilder baserat på de typer av block som de innehåller.
Jämfört med mer traditionella single-cellbaserade metoder, kräver denna metod minimal finjustering och expertis. Som sådan, användarna behöver bara ställa in två parametrar: blockstorlek och en tröskelintensitet (att göra sig icke-cellulär delar av en bild), som båda är inställda med grafisk återkoppling. Huvudsakligen har det arbetsflöde som beskrivs här visats 4 att skala lätt till mycket större datamängder, där hastigheten och minimal finjustering ger stor tid och vinster tillförlitlighet. I praktiken finner vi att denna appmört minskar den tid som krävs både för installation och drift av flera tiopotenser 4.
Den primära utmatningen av PhenoRipper är en visuell representation av bildlikhet, vilket möjliggör för användaren att identifiera grupper av försöksbetingelser som orsakar celler att uppvisa liknande fenotyper. Grupperingarna PhenoRipper finner typiskt har jämförbar "biologisk tolkningsbarhet" till de som genereras av mer tidskrävande, cellbaserade metoder 4. I praktiken innebär detta att ofta, inom en halvtimme att utföra en typisk 96-väl fluorescensmikroskopi experiment, en försöksledaren utan tidigare erfarenhet bild-analys kan få en tillförlitlig avläsning om resultatet för sitt experiment. Försöksledaren kan sedan börja utforska sambanden mellan olika experimentella förhållanden och relatera dessa relationer till bild fenotyper.
Vi visar detta arbetsflöde här genom att analysera effekternaav läkemedel i olika mekanistiska klasser på HeLa-celler som färgats för DNA och cytoskelettala markörer. Bilder av celler som behandlats med samma klass av läkemedel grupperades tillsammans, och dålig bildkvalitet (färgnings artefakter, ofokuserad celler och så vidare) dök upp som extremvärden, vilket gör dem lätta att identifiera och eventuellt kasta.
Även om detta arbetsflöde är användbart för ett stort antal bildbaserade analyser, det finns helt klart många situationer där en annan strategi skulle kunna vara mer informativ. Till exempel är utsignalen från PhenoRipper primärt en relativ jämförelse av fluorescensmönster tvärs experimentella betingelser. Om en absolut karakterisering av en specifik enskild cell drag krävdes i stället (t ex antalet fläckar i en cell), skulle en enda cell-baserade analyser krävas. Men även i denna typ av situation är PhenoRipper sannolikt att upptäcka förändringar i dessa encelliga fenotyper och därför vara ett användbart verktyg för analys optimization.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbereda Prover och bildbehandling
- Cellodling
- Split kulturer rutinmässigt och hålls kvar vid 20-70% sammanflödet. En dag före experimentet, växa HeLa-celler i DMEM (Dulbeccos modifierade Eagle-medium, se Tabell of Materials) och kompletterat med 10% FBS (fetalt bovint serum), 1x penicillin / streptomycin.
- På dagen för experimentet, dela celler växer i kultur (ca 50% sammanflytande).
- Tvätta cellerna med PBS (fosfatbuffrad saltlösning), utsättas för approximativt 2 ml av trypsin / EDTA (etylendiamintetraättiksyra) under några sekunder. Sug upp överskott av trypsin / EDTA och hålla celler badade i en tunn film av trypsin / EDTA i huven vid RT under ~ 3 min.
- Mekaniskt skaka kolvar två gånger och ta bort celler med serum kompletteras medier. Räkna celler och späd till 5000 celler/50 pl av media och omedelbart plattan 50 l / brunn på en 384-väl glasbottenplattan med hjälp av en automatiserad vätskehanteringsrobot (endast 30 väls av plattan används här).
- Inkubera plattan vid rumstemperatur i 30 minuter för att minimera kanteffekter i brunnar 5. Efter RT inkubering, placera plattorna i en 37 ° C / 5% CO2-inkubator över natten.
- Varje läkemedel kommer att analyseras i duplikat. Tillsätt 25 | il av läkemedlet till motsvarande brunnar på plattan redan innehållande media.
- Fix platta med 4% paraformaldehydlösning i PBS vid 24 timmar efter läkemedelsbehandling.
- Färgning
De specifika primära antikroppar, fluorescensmärkta sekundära antikroppar och andra fluorescenta fläckar som användes här är listade i tabell of Materials.- Permeabilisering fixerade celler med 0,2% Triton X-100-lösning i TBS (Tris-buffrad koksaltlösning) under 3 min, och tvätta med TBST (Tris-buffrad saltlösning + Tween 20) 3x. Lägg 5% BSA (bovint serumalbumin)-lösning i TBST för blockering.
- Inkubera plattan vid rumstemperatur under 2 h och sedan tvätta med TBST 3x.
- Gör primär antikropp dilutjoner i 5% BSA i TBST (se tabell för material) och tillsätt 10 l / brunn. Inkubera plattan vid rumstemperatur i 2 timmar, och sedan tvätta 3 x med TBST.
- Gör sekundär antikropp dilutionin 5% BSA i TBST (se tabell för material) och tillsätt 10 l / brunn.
- Inkubera plattan i mörker vid RT i 2 h och sedan tvätta två gånger med TBST.
- Förbered spädningar för Hoechst och phalloidin (se tabell för material) i PBS och tillsätt 10 l / brunn.
- Inkubera plattan i mörker under 30 min vid rumstemperatur.
- Efter 2 TBST tvättar, täckplåtar i folie och förvara vid 4 ° CO / N.
- Imaging
Förvärva bilder med hjälp av ett epifluorescensmikroskop med hjälp av en 20X objektiv med 1x1 kamera binning. Förvärva sexton bilder för varje brunn, för totalt 480 bilder (x3 kanaler).
2. Analysera bilder
Ladda ner och installera PhenoRipper från phenoripper.org, och starta PhenoRipper att påbörja analysen av imaGes. PhenoRipper stödjer för närvarande TIFF, PNG och JPEG och alla andra format som stöds av MATLAB (mikroskop programvara stöder vanligtvis export i TIFF).
2,1 Laddar Data
- Ingen standard namngivning / organisation överenskommelser saknas för mikroskopi bilder, vilket kan göra lastning bilder och associera metadata (dvs. experiment anteckning såsom behandling typ, bra nummer och så vidare) den mest utmanande delen av arbetsflödet. Välj en av de presenterade metoderna (beskrivs nedan).
- PhenoLoader: Välj detta alternativ för att halvautomatiskt läsa in data när filnamnet och / eller katalogstruktur innehåller tillräcklig information för att gruppbilder som önskas (t.ex. B16 HeLa_Drug5-DAPI.png kan tyda på att bilden är från väl B16 behandlas celler med drogen vars ID är 5, och bilden fångar kärn DAPI fläcken - med denna namnkonventionen, kan alla bilder väl A1 eller behandlas med drogen 5 lätt grupperas). Guidenguidar användaren steg för steg för att associera metadata med bildgrupper och definiera markörerna så här:
- Klicka på "File Structure" för att få tillgång till PhenoLoader fönstret.
- Klicka på "Definiera Root Directory" för att välja den katalog som innehåller bild dataset. Sedan filtrera filerna som inte används (oanvända filer) för analysen (tillval, kan lämnas tomma).
- Klicka på "Definiera markörer" för att ange vilka biomarkörer som används i försöket och associera dem med bilderna. Specifikt, klicka på en bildfil välj sedan en del av filnamnet som unikt identifierar de biomarkörer. Slutligen, ange ett namn för varje biomarkör.
- Klicka på "Definiera Metadata" att associera information med varje bild. Specifikt, klicka på en bildfil, och sedan välja en del av filnamnet som identifierar bildinformation (t.ex. "B16" för bra namn). Ett fönster som frågar efter ett gruppnamn (t.ex. "Vill ") dyker upp, ange ett namn. Medlemmar i gruppen utvinns ur filnamnet visas på grupptabellen (t.ex. fullständig förteckning över såväl namn). För att lägga till ytterligare information som inte finns i filnamnet, klicka på" (tillval) Nästa ". Klicka på" Lägg Metadata Group ", anger ytterligare gruppnamnet (t.ex." Drug ") och för varje värde på den fördefinierade gruppen (t.ex." Ja "), skriv in dess värde (t.ex." Taxol ") . Det finns ingen gräns för hur många ytterligare grupper som kan läggas till.
- Slutligen klickar du på "Skapa Metadatafile" för att generera metadata-filen och fortsätta analysen. Om en metadatafil har tidigare genererat, kan stegen ovan undvikas genom att direkt läsa in filen med alternativet "Metadata Fil" (beskrivs i 3 nedan).
- Vanligt uttryck baserade mallar: Reguljära uttryck är en standardiserad metod för att matcha mönsteri text. Välj det här alternativet när filnamnet och / eller katalogstruktur innehåller tillräckligt med information för gruppbilder och namnkonventionen matchar någon av de redan existerande mallar. Egna mallar baserade på reguljära uttryck kan även manuellt definierade och återanvändas. Denna avancerade alternativ rekommenderas endast för användare som är bekanta med reguljära uttryck.
- Metadata Fil: Välj det här alternativet för ultimat anpassningsbarhet. Definiera och ladda en kommaseparerade värden (CSV) fil som innehåller filnamn och metadata i samband med varje bild. Ett exempel på filformat finns på nedladdningen delen av webbplatsen (phenoripper.org). Helt enkelt ladda filen genom gränssnittet för att visa information den innehåller.
- PhenoLoader: Välj detta alternativ för att halvautomatiskt läsa in data när filnamnet och / eller katalogstruktur innehåller tillräcklig information för att gruppbilder som önskas (t.ex. B16 HeLa_Drug5-DAPI.png kan tyda på att bilden är från väl B16 behandlas celler med drogen vars ID är 5, och bilden fångar kärn DAPI fläcken - med denna namnkonventionen, kan alla bilder väl A1 eller behandlas med drogen 5 lätt grupperas). Guidenguidar användaren steg för steg för att associera metadata med bildgrupper och definiera markörerna så här:
- Markera den metadatafält som definierar replikat i försöket att undvika överflödig provtagning. För datamängder som innehåller replikat (t.ex. alla bilder i en brunn bör vara densamma), gruppera dem (t.ex. genom väl) kan visnove prestanda. I de flesta fall är det rimligt att välja standardalternativet "Random (vet inte)" som väljer en slumpmässig delmängd.
2.2 Inställning av analysparametrar
Klicka på "Set parametrar" för att definiera de parametrar som krävs för att bearbeta datamängden. De parametrar som definierar är på den vänstra panelen. Den högra panelen visar en sammanslagna prov av dataset. Klicka på vänster / höger för att växla mellan olika bilder.
- Tröskel Intensitet: Välj ett lämpligt tröskelvärde för att grovt identifiera de cellulära delarna (snarare än bakgrunden, icke-cellulär regioner) av bilder. En tröskel förberäknas av PhenoRipper, men kan justeras för att förbättra markering av cellulära regioner med hjälp av rullningslisten finns på toppen av bilden. Om en vald tröskel fungerar inte i alla bilder, sänka tröskeln till att omfatta icke-cellulär regioner snarare än släppa cellulära regioner.
- Block Size: Välj en lämplig blockstorlek (i bildpunkter) för rutnät på bilden. Block av angiven storlek kommer upp på bilden. Justera blockstorlek för att få ett genomsnitt på 20-30 block / cell. För att överlagra gallret över bilden, klicka på kryssrutan framför "Block Size"-fältet.
- Valfria parametrar: Om auto-skalas bilderna inte visar markörer med önskade relativa intensiteterna (till exempel en färg är mättad) eller om markörer behöver tas bort från analysen, använder du "Justera kanal Intensity" alternativet. För att identifiera cellulära regioner på en delmängd av markörer använda "Kanaler som används för Threshold" alternativet. Standard val av andra parametrar är vanligen tillräcklig, men om det behövs, justera dem med hjälp av "Advanced Analysis Options".
- Kör analysen genom att trycka på "PhenoRip" på programmets huvudpanelen. PhenoRipper kommer automatiskt att identifiera återkommande blocktyper i bilderna. Fenotypiska profiler kommer att genereras förvarje bild baseras på de delar av de olika blocktyper i det.
3. Exploring Resultat
- Utforska sambanden mellan de fenotypiska profiler av bilder med PhenoBrowser (Figur 1). Den PhenoBrowser gränssnittet består av fyra paneler: den övre vänstra panelen är en grafisk representation (punktdiagram) av den relativa likheten mellan olika bilder / villkor, de två panelerna på rätt visningsbildexempel för valda villkor, och den sista panelen (stapeldiagram ) jämför sina fenotypiska profiler.
- "Kasta tomma ramar" med hjälp av menyn "Data Processing".
- Ta bort dåliga bilder: För det första, för att studera enskilda bilder stänga gruppering från menyn "Data Processing". Klicka därefter genom de utanförliggande punkter i punktdiagram och kasta bilder låg kvalitet (t.ex. ur fokus, färgning artefakt).
- Utforska uppgifter: Bestäm vilka metadatafält definieraren grundenhet för jämförelse (t.ex. för att jämföra droger, bilder med samma värde på metadatafältet "drog" måste samlas). Dölj alla bilder med samma värde i detta metadatafält i en enda datapunkt med "Gruppera". Till exempel kommer gruppering av läkemedel i genomsnitt bilderna inom varje läkemedel för att ge en poäng per läkemedel. I närheten (eller avlägsna) punkter i punktdiagram spegla förhållanden som framkallar liknande (eller olika) cellulära fenotyper. Färg eller etikett punkter (meny data display) baserad på tillgängliga metadata för att underlätta tolkningsbarhet. Den 3D-tomten är vridbar genom att klicka på "vridbar" kryssrutan och klicka på den vänstra knappen och dra musen över den.
- Välj två olika punkter för att jämföra dem direkt. De bildpaneler visar exempelbilder för varje punkt, och stapeldiagram panelen visar blocktyper vars förekomst frekvenser är mest olika mellan de två punkterna.
- Starta clustergram från "Clustergram menyn" för att ge en mer övergripande bild av sambandet mellan blocktyper och experimentella förhållanden. Genom att gruppera båda block och villkor, belyser denna representation de cellulära fenotyper som bäst särskiljer grupper av förhållanden (Figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här vi testade förmågan hos detta arbetsflöde för att gruppera läkemedel baserat på deras verkningsmekanism. HeLa-celler såddes i 30 brunnar i en 384-brunnsplatta och färgades för DNA / aktin / α-tubulin. De specifika primära antikroppar, fluorescensmärkta sekundära antikroppar och andra fluorescenta fläckar som användes är listade i tabell of Materials. Brunnar behandlades med 15 läkemedel som hör till tre mekanistiska klasser (histondeacetylas Hämmare, mikrotubuli inriktade och DNA-skada) under 24 h och avbildas med ett epifluorescensmikroskop vid 20X objektiv förstoring. Sexton bilder förvärvats för varje brunn, för totalt 480 bilder (x3 kanaler). De data som beskrivs här kan laddas ner från www.phenoripper.org.
Såsom beskrivits ovan, PhenoRipper användas för att analysera dessa bilder. Förgrunds tröskeln sattes till 5% (dvs. 5% av det högsta möjliga intensitet) och blockstorleken till 20 pixlar (Figur e 2). Analys av denna datamängd tog cirka 10 minuter på en vanlig stationär dator (en 64 bitars, 8 core maskin på 3,2 GHz, med 16 GB RAM-minne). Den PhenoBrowser gränssnittet (Figur 3) användes för att undersöka resultaten. Imaging artefakter såsom dålig färgning och tomma ramar var lätta att identifiera eftersom de stod ut som klara extremvärden (Figur 4). De relativa fenotypiska likheter mellan bilderna visualiseras i den övre vänstra panelen i figur 3 med hjälp av multidimensionell skalning. Varje punkt representerar en enda bild färgas av dess drog verkningsmekanism. Denna kurva visar att fenotypiska profiler kan användas för grupper droger genom sin verkningsmekanism. En clustergram av data (Figur 5) avser denna gruppering till de fenotypiska profilerna.
s/ftp_upload/51280/51280fig1.jpg "width =" 600px "/>
Figur 1. Arbetsflöde för fluorescensmikroskopi med användning PhenoRipper. Cellinjer ympas in i en platta, då störningar tillsätts till varje brunn och plattan inkuberas. Bilderna förvärvas med hjälp av ett automatiserat mikroskop och sedan snabbt analyseras med hjälp PhenoRipper. Således är resultatet av den pågående experiment känt kort efter bildbehandling och kan, om det behövs, kunna användas för att förfina inställningarna för framtida upprepningar. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Ställa PhenoRipper parametrar: blockstorlek och tröskel intensitet ställs in med hjälp av ett grafiskt gränssnitt med realtid visuell feedbac k.. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. PhenoBrowser gränssnitt för att utforska PhenoRipper resultat: PhenoBrowser Gränssnittet är uppdelat i fyra paneler: den övre vänstra panelen är ett spridningsdiagram som visar de relativa likheterna mellan olika bilder / förhållanden, de två panelerna på rätt visningsbildexempel för valda villkor, och det nedre vänstra panel jämför sina fenotypiska profiler. Klicka här för att visa en större bild .
load/51280/51280fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51280/51280fig4.jpg "width =" 600px "/>
Figur 4. Exempel en avvikare in punktdiagrammet (markerad) visar en färgnings artifact (se video). Flygbiljett Få större bild .
Figur 5. Clustergram representation av PhenoRipper profiler: Varje rad representerar en enda drog, och varje kolumn ett block typ. De grå-skalevärdena återspeglar de fenotypiska profiler, dvs den fraktion av de olika blocktyper för varje läkemedel. En lättare värde anger högre andel som blockerar typ. Hierarkisk klustring separerar till stor del de olika läkemedel med läkemedelsklass (röd / blå / green färg till höger). Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Arbetsflödet som beskrivs här möjliggör snabb och enkel karakterisering och jämförelse av mikroskopi bilder. Vi visade först hur detta arbetsflöde kan hjälpa experimentera optimering, till exempel genom att snabbt utföra kvalitetskontroll på mikroskopi bilder. Därefter visade vi dess potential för analys av high-throughput screening data: vi skulle kunna gruppera läkemedel baserade på deras verkningsmekanism. Grupperingen av drogerna var jämförbar med den som hittades med användning av mer komplexa metoder 6, trots PhenoRipper var tiopotenser snabbare.
Även om vi har funnit denna metod robusta mot sporadiska experimentella variationer, som med alla bildbaserad metod, kommer avläsning att påverkas av systematiska icke-biologiska effekter. Exempelvis kan platta-till-platta variation i markörintensitet maskera de biologiska effekterna av intresse. Effekterna av dessa artefakter kan minskas genom lämpliga korrigeringar 7, 8, såsom psent att plattan normalisering och bakgrundssubtraktion. Profilerna som genereras av PhenoRipper kan också påverkas av variationer i celltäthet. Även om detta beteende är oftast önskvärt (reflekterande överlevnad eller tillväxt), kan dess effekt minskas med un-markera "Använd Bakgrundsinformation" i "Avancerade parametrar".
Vid val av lämplig metod för analys, användarna måste ta hänsyn till avvägningen mellan snabbhet, användarvänlighet och nivå av analytisk detalj. Segmentefria metoder 9-11 såsom PhenoRipper är vanligtvis snabbare och enklare att använda än en enda cell-baserade metoder såsom CellProfiler 2. Nackdelen med segmenteringsfria metoder är oförmågan att kvantifiera specifika encelliga egenskaper. Användaren måste alltså besluta om lämplig metod som bygger på hans eller hennes behov. När korrekt jämförelse eller gruppering av experimentella förhållanden är det främsta målet, har vi funnit att nivån pådetalj fångas av PhenoRipper är mer än tillräcklig. Särskilt forskare fokuserat på hög genomströmning experiment kommer att dra stor nytta av möjligheten att snabbt och enkelt utforska bilddata. Sammanfattningsvis kommer arbetsflödet presenteras här tillåter bänk forskare att enkelt utforska sina fluorescens mikroskopi bilder snart efter förvärvet och underlätta en snabb vändning mellan analyser och bildbehandling. Vi tror att detta arbetsflöde kommer att sänka hinder för att utföra kvantitativ bildanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Adam Coster och alla andra medlemmar i Altschuler och Wu labb för bra återkoppling och diskussioner. Denna forskning stöds av National Institute of Health bidrag R01 GM085442 och CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW), och Welch Foundation I-1619 (SJA) och I-1644 (LFW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965 | High Glucose, L-Glutamine |
| Marker Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | DNA stain, dilution 1:2,000 of 5 mg/ml stock |
| Marker phalloidin-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A12379 | Conjugated phallotoxin, dilution 1:200 |
| Primary Antibody α-tubulin | Sigma | T9026 | Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200 |
| Secondary Antivody anti-Mouse TRITC | Jackson | 115-025-166 | Conjugated secondary Ab, 0.5 mg in 1 ml PBS + 1 ml glycerol |
| Aldosterone | concentration used: 0.2 μM | ||
| Apicidin | concentration used: 20 μM | ||
| Colchicine | concentration used: 0.16 μM | ||
| Cortisol | concentration used: 0.2 μM | ||
| Dexamethasone | concentration used: 0.2 μM | ||
| Docetaxel | concentration used: 0.2 μM | ||
| M344 | concentration used: 20 μM | ||
| MS-275 | concentration used: 5 μM | ||
| Nocodazole | concentration used: 0.3 μM | ||
| Prednisolone | concentration used: 0.2 μM | ||
| RU486 | concentration used: 0.2 μM | ||
| Scriptaid | concentration used: 70 μM | ||
| Taxol | concentration used: 0.3 μM | ||
| Trichostatin A | concentration used: 0.2 μM | ||
| Vinorelbine | concentration used: 0.3 μM |
References
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (2006).
- Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis. PLoS Comput. Biol. 6, (2010).
- Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images. Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
- Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).
- Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. Quantitative analysis of digital microscope images. Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).
- Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. Image calibration in fluorescence microscopy. J Microsc. 216, 15-24 (2004).
- Shamir, L., et al. Wndchrm - an open source utility for biological image analysis. Source Code Biol. Med. 3, 13 (2008).
- Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. Statistical and visual differentiation of subcellular imaging. BMC Bioinform. 10, 94 (2009).
- Huang, K., Murphy, R. F. Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells. IEEE Int. Symp. Biomed. Imag. Macro Nano, 2004 Apr 15-18, 2, 1139-1142 (2004).
