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Medicine

Profiling von Östrogen-regulierte MicroRNAs in Brustkrebszellen

doi: 10.3791/51285 Published: February 21, 2014

Summary

Molekulare Signal sowohl durch Östrogen und microRNAs sind entscheidend bei Brustkrebs Entwicklung und Wachstum. Östrogen aktiviert die Östrogen-Rezeptoren, die Transkriptionsfaktoren sind. Viele Transkriptionsfaktoren die Expression von microRNAs regulieren und Östrogen-regulierten microRNAs kann mit verschiedenen Groß Techniken profiliert werden.

Abstract

Östrogen spielt eine wichtige Rolle in der Entwicklung der Brustdrüse und Brustkrebs Progression. Es vermittelt seine Funktion durch die Bindung an und Aktivierung der Östrogenrezeptoren (ERs), &agr; und &bgr;. ERa häufig bei Brustkrebs hochreguliert und treibt die Proliferation von Brustkrebszellen. Die ERS funktionieren, wie Transkriptionsfaktoren und die Genexpression regulieren. Während ERa die Regulierung der Protein-kodierenden Gene gut etabliert ist, ist die Regulierung der nicht-kodierenden microRNA (miRNA) weniger erforscht. miRNAs spielen eine wichtige Rolle in der Post-Transkriptionsregulation von Genen, die Hemmung der Translation oder Beeinträchtigung der mRNA. miRNAs können als Onkogene oder Tumor-Unterdrücker funktionieren und werden auch vielversprechende Biomarker. Unter den miRNA-Assays zur Verfügung, haben Microarray-und quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) wurde ausgiebig genutzt, um nachzuweisen und zu quantifizieren miRNA Ebenen. Um miRNAs durch Östrogen-Signalisierung bei Brustkrebs, th geregelt identifiziereneir Ausdruck in ERa-positiven Brustkrebs-Zelllinien wurden im Vergleich vor und nach Östrogen-Aktivierung unter Verwendung sowohl der mikrofluidischen μParaflo-Microarrays und Dual-markierten Sonden-Arrays geringer Dichte. Die Ergebnisse wurden mit spezifischen qPCR-Assays validiert, die Anwendung sowohl Cyanine Farbstoff-und Dual-markierten Sonden-basierten Chemie. Weiterhin wurde ein Zeitpunkt, Assay verwendet werden, um Vorschriften über die Zeit zu ermitteln. Vorteile der miRNA-Assay-Ansatz in dieser Studie verwendet wird, ist, dass es ermöglicht ein schnelles Screening von reifen miRNA Regelungen in zahlreichen Proben, auch mit begrenzten Probenmengen. Das Layout, einschließlich der spezifischen Bedingungen für die Zellkultur-und Östrogen-Behandlung, biologische und technische Replikate und Groß Screening gefolgt von eingehenden Bestätigungen über separate Techniken sorgt für eine robuste Detektion von miRNA-Vorschriften, und eliminiert Fehlalarme und andere Artefakte. Allerdings mutiert oder unbekannte microRNAs oder Vorschriften am Primär-und Vorläufer Transkript level, werden nicht erkannt. Das hier vorgestellte Verfahren stellt eine gründliche Untersuchung der Östrogen-vermittelte miRNA Regulierung.

Introduction

Östrogen ist ein Hormon, das in der Brustdrüse Entwicklung wichtig ist. Östrogen spielt auch eine wichtige Rolle in der Entwicklung, Wartung, Risiken und Behandlung von Brustkrebs ein. Östrogen übt seine Funktion durch die Bindung an ERs, die Transkriptionsfaktoren und regulieren spezifischer Zielgene. Der zwei Rezeptorvarianten ist ERa wichtig für Östrogen-abhängigen Proliferation von Brustkrebszellen. Die meisten Brustkrebserkrankungen sind ERa-positiven und hängt von Östrogen für Wachstum. Dies hat Östrogen Signal gemacht und ERa ein Ziel für die Behandlung in der Hormonrezeptor-positivem Brustkrebs. Das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen von ERa ist wichtig, um die Behandlungsergebnisse zu verbessern, zu überwinden Widerstand gegen die Behandlung, und verstehen, wie Brustkrebs sich entwickelt.

miRNAs spielen eine entscheidende Rolle in der Zellfunktionen aufgrund ihrer großen Einfluss in posttranskriptionale Genregulation. miRNAs sind 19-24 Nukleotide kurze, einsträngige, Nicht-kodierende RNAs, die zuerst von RNA-Polymerase II in primäre miRNA-Transkripte (pri-miRNA) transkribiert werden. Sie sind im Kern mit Drosha in kurze Haarnadel-Vorläufer-miRNAs (pre-miRNA) verarbeitet und dann durch Dicer verarbeitet und in Einzelstränge getrennt, um zu reifen miRNAs im Zytoplasma bilden. Die Einzelstrang-reifen miRNAs sind Argonaut-Proteine ​​übertragen, um RISC-Komplex zu bilden. Dann können die miRNAs an die 3'-nicht-translatierten Bereichen (3'-UTR) eines Ziel-mRNA zu hybridisieren, die zu post-transkriptionellen Regulation durch Blockieren Übersetzung oder einer Verschlechterung der Ziel-mRNA 2.

Aufgrund der wichtigen Rolle, die sowohl Östrogen und miRNAs spielen bei der Tumorprogression, die Identifizierung miRNAs mit normalen oder gestörten Östrogen-Signalisierung zugeordnet ist, um unser Verständnis der Entwicklung und zur Verbesserung der Behandlung von Brustkrebs wichtig. Zwar gibt es eine gutes Verständnis, wie &agr; reguliert Protein-kodierende Gene, die Ausweitungund nicht-kodierenden RNA-Details Vorschriften bleibt, gründlich untersucht werden. Erste Studien mit dem Ziel, ERa Regulierung der miRNA in Brustkrebs-Zelllinien aufzuklären haben widersprüchliche Ergebnisse erbracht, auch wenn die gleiche Zelllinie wurde analysiert 3-6. Dies kann eine Folge der unterschiedlichen Behandlungen, biologische Variationen, die Verwendung von verschiedenen Techniken, und die Tatsache, dass die geringe Größe der miRNAs machen sie schwierig zu analysieren. Hier ist ein Protokoll, das für Variationen und Verfahren Artefakte steuert beschrieben.

Um festzustellen, welche miRNAs werden durch Östrogen reguliert wird, ist Profilierung eines gut definierten Brustkrebsmodell von ERa Aktivität ein erster Schritt. Mehrere Zelllinien aus menschlichen &agr;-positiven Brustkrebstumoren, die abhängig von Östrogen ähnlich der Mehrzahl der klinischen Mammakarzinome erzeugt. Die molekularen Eigenschaften von zwei dieser Zellinien T47D-und MCF7, einschließlich der Expression von ER &agr; und seinem stromabwärtigen Ziel,das Hormon Progesteron-Rezeptor (PR), eine fehlende Expression von Membran-Rezeptor HER2, zusammen mit der Expression von Östrogen-responsive-und Lumen epitheliale Differenzierung Gene, machen sie als Modell für die luminalen Subtyp von Brusttumoren 7-10 geeignet. 17β-Östradiol (E2) ist die vorherrschende Form von Östrogen, und die Konzentrationen und Zeitpunkte für optimale Transkriptionsaktivierung von ER &agr; wurden in mehreren Studien charakterisiert. In diesem Protokoll 10 nM E2-Behandlung für 24 Stunden als Modelle für ERa Aktivität in Brustkrebszellen ein und verwendet T47D und MCF7. Darüber hinaus kann zeitabhängig miRNA gesetzlichen Bestimmungen in einem Zeitintervall von z. B. 1-72 Stunden analysiert werden.

Zweitens hat die Analyse miRNA separaten Herausforderungen, zum Teil aufgrund ihrer kurzen Größen. miRNAs sind nicht gut in der Gesamt-RNA Vorbereitung erhalten, wenn regelmäßig Guanidinium thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol RNA-Ausscheidungen durchgeführt werden, oder wenn standard Spalte Reinigungen verwendet. Vorsichtsmaßnahmen müssen getroffen werden, zu halten oder zu bereichern für die kleinere Fraktion der RNAs. Indem das Volumen an Isopropanol, das Absenken der Temperatur vor der Zentrifugation (-80 ° C), und das Weglassen des Wasch in 70% Ethanol, kann das Halte von miRNAs während der Fällung gesteigert werden. Oder Sie können bestimmte Spalten und Puffer für eine qualitativ hochwertige und robuste Herstellung von miRNA-haltigen Gesamt-RNA verwendet werden. Auch für die Analyse selbst, ihre Short-Größen zu erstellen Herausforderungen. Für genomweite Screening-miRNA, gibt es drei gemeinsame miRNA Profiling-Techniken zur Auswahl: Microarrays, qPCR und Next-Generation-Sequenzierung. Jede Technik kann durchgeführt werden unter Verwendung von mehreren unterschiedlichen Plattformen und verschiedene Probenpräparationen benötigt werden, mit jeweils unterschiedlichen Risiken der Einführung Artefakte. In miRNA-Microarray ist ein Schieber entdeckt oder synthetisiert mit Tausenden von Oligonukleotiden. Diese Oligonucleotide als Sonden verwendet werden, und jede der Sondens ist entworfen, um auf eine bestimmte miRNA-Sequenz hybridisieren. Die Probenpräparation für Mikroarrays, wie in dieser Studie durchgeführt, anreichert ersten miRNAs und führt Cy5 und Cy3 Kennzeichnung auf die miRNAs dann. Mikroarray gibt die Möglichkeit, die relativen Expressionsniveaus von einer großen Anzahl von Genen gleichzeitig zu beobachten, schnell und geeignet für das Screening einer großen Anzahl von Proben, sondern nur auf dem Microarray-Analyse der Sequenzen vorhanden und wird zB nicht Änderungen erfassen unbekannte oder mutierte miRNAs. Microarray-Analyse, wie in diesem Protokoll durchgeführt erfordert auch relativ große Mengen, etwa 5 ug Gesamt-RNA pro Probe für die Analyse. Low-Density-qPCR miRNA Profilierung erfordert weniger Material (700 ng / Probe und zu replizieren), und erlaubt die Detektion und Quantifizierung von miRNAs. Transkriptionsniveaus bestimmt werden, und die Menge kann eine absolute Menge oder relative Menge sein. qPCR-Analyse erfordert zunächst Umwandlung von miRNA in cDNA, hier durch die Verwendung eines gelooptenPrimer für jede spezifische miRNA Gewährleistung der Analyse von nur reife miRNA. Dies erzeugt eine Vorlage, die mehr verstärkt wird, unter Verwendung einer miRNA-spezifischen Vorwärtsprimer und einen universellen Rückwärtsprimer komplementär zu der verknüpften Abfolge werden und kann die Aufnahme eines Doppel-markierten Sonde für Spezifität beherbergen. qPCR in einer Low-Density-Format, bei dem Hunderte von miRNAs können parallel mit einem oder mehreren 384-Well-Platten mit verschiedenen Primer-Paare in jeder gut 11 erfasst werden verwendet werden. Next-Generation-Sequenzierung, auf der anderen Seite, ist die einzige von diesen Techniken, die für die Entdeckung von neuen, mutierten oder bearbeitet miRNAs ermöglicht, da alle RNAs in einer Probe 11 sequenziert werden. Diese Technik erfordert jedoch mehrere Schritte, um kleine RNAs bereichern und erzeugen einen kleinen RNA-Bibliothek unter Verwendung mehrerer Stufen von Linker-Ligationen und Reinigungen mit anschließender verbessert Risiken der Modulation ihrer relativen Expressionsniveaus zwischen den Proben. Es erfordert auch erhebliche bioinformatics-Analyse. Angesichts der verschiedenen Techniken für die miRNA-Profiling richtet sich die am besten geeignete Technik für die Anwendungen. Microarrays sind am besten geeignet, wenn Material ist relativ reichlich vorhanden und das Interesse ist es, unterschiedliche Expression von bereits bekannten miRNAs zu definieren. Low-Density-qPCR-Arrays sind am besten geeignet, wenn eine begrenzte Menge der Probe vorhanden ist und eine hohe Empfindlichkeit niedrig exprimierten miRNAs erforderlich. Die Sequenzierung ist am besten geeignet, wenn die Analyse von unbekannten miRNAs, mutiert oder verschiedene Isoformen eines miRNA erforderlich.

In der Studie von Östrogen-regulierten miRNAs bei Brustkrebs sind zwei Modellzelllinien verwendet, T47D-und MCF7, wo große Mengen an RNA zur Verfügung stehen. Jede Zelllinie wurde in replizierten Zellkulturen mit verschiedenen Durchgängen, die jeweils in den technischen Wiederholungen der Behandlung analysiert. Dies ermöglicht eine robuste Detektion von reproduzierbar, &agr;-regulierten miRNAs. Relative miRNA-Expressionsniveaus wurden sowohl mit miRNA-Microarray und verglichenDual-markierten Sonden - Arrays niedriger Dichte (DLP-LDA) und validiert die Ergebnisse mit spezifischen qPCR mit sowohl Cyanin-Farbstoff-und DLP-Chemie. miRNA-Vorschriften wurden dann weiter in Zeitreihen analysiert, um ihre genaue Regelung über die Zeit, die Ihnen helfen, zu unterscheiden zufällig oder circadianen Schwankungen von Östrogen-induzierte Vorschriften, und zeigen primären Auswirkungen von Nebenwirkungen zu definieren. Bioinformatische Vergleiche mit Chromatin-Bindungsstudien von ERa kann Hilfe bei der Differenzierung von primären gegenüber Sekundäreffekte fördern. Der Test ergab eine zuverlässige Beurteilung der miRNA-Vorschriften, wenn nachgewiesen werden kann, dass nach 24 Stunden Behandlung E2 Protein-kodierenden Transkripte wurden leicht reifen miRNAs reguliert, aber waren nicht betroffen 1. Es ist jedoch möglich, dass miRNAs zu späteren Zeitpunkten reguliert, wie in der Zeitreihenanalyse von ausgewählten miRNAs 1 gezeigt. Die Details müssen noch weiter erforscht werden und das hier vorgestellte Protokoll bietet eine Robust Möglichkeit, hormonellen Regulation der reifen miRNAs in Brustkrebs-Zelllinien untersucht werden.

Protocol

1. Herstellung von Zellkulturmedien

  1. Für Zelllinie T47D Kulturmedien:
    1. Mischungs 500 ml Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 500 ml F12 [DMEM/F12 (1:1)] in einem Autoklaven 1 L-Flasche.
    2. 50 ml fötales Rinderserum (das macht 5% FBS) und dann 10 ml Penicillin-Streptomycin (dies macht 1% PEST). Mix Inhalt vollständig.
    3. Lagern bei 4 ° C
  2. Für MCF7 Zelllinie Kulturmedien:
    1. Mischungs 500 ml DMEM mit 25 ml FBS (5% FBS) und dann 5 ml Penicillin Streptomycin (1% PEST).
    2. Lagern bei 4 ° C
    3. Für reduzierte Serum-Kulturmedien:
      1. Für T47D: Mischen Sie 500 ml Phenolrot-freiem DMEM mit 500 ml F12 (1:1) in einer autoklavierten 1 L Flasche, und 50 ml des Dextran-beschichteter Aktivkohle behandelt (DCC) für FBS 5% DCC-FBS. Stellen Sie eine separate Flasche mit 5 ml DCC-FBS 0,5% DCC-FBS. Dann 10 ml PEST (1% PEST) zu jeder Flasche. Mix Inhalt vollständig und Lagerunge bei 4 ° C
      2. Für MCF7: Mischen Sie 500 ml Phenolrot-freiem DMEM mit 5 ml 100x L-Glutamin (200 mM Endkonzentration). 25 ml DCC-FBS (5% DCC-FBS). Stellen Sie eine separate Flasche mit 2,5 ml DCC-FBS (0,5% DCC-FBS). Dann werden 5 ml PEST (1% PEST) zu jeder Flasche. Mix Inhalt vollständig und lagern bei 4 ° C
    4. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS):
      1. Füllen Sie eine 1 L autoklavierten Glasflasche mit hochreinem Wasser oder destilliertes Wasser.
      2. In einem PBS-Tablette und gelegentlich schütteln, bis Tablette aufgelöst hat.
      3. Autoklav PBS-Lösung und bei Raumtemperatur lagern.
    5. Herstellung von Liganden-Aktien:
      1. Bereiten Sie eine 100 mM Stammlösung von E2 durch Lösen von 2,72 mg 17β-Estradiol in 100 ul Ethanol oder DMSO in einer sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, und der Inhalt vorsichtig mischen. Spin kurz und machen serielle Verdünnungen (1:10) bis 10 mm, 1 mm und 0,1 mM Stamm concentr ergebenATIONEN Verwendung des Lösungsmittels. Speichern Sie alle E2-Stammlösungen bei -20 ° C
      2. Bereiten Sie eine 100 mM Stammlösung von ICI durch Lösen von 6,07 mg ICI 182,780 in 100 ul EtOH oder DMSO in einer sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, und der Inhalt vorsichtig mischen. Spin kurz und machen serielle Verdünnungen (1:10) bis 10 mm, 1 mm, 0,1 mM Stammkonzentrationen Verwendung des Lösungsmittels ergeben. Speichern Sie alle ICI Stammlösungen bei -20 ° C
      3. Das Fahrzeug ist das Lösungsmittel (Ethanol oder DMSO). Zeigen 0,5-1 ml 100% Ethanol oder DMSO in einer sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, und bei -20 ° C

2. Zellkultur und Behandlung

Führen Sie jede Behandlung in Doppel-oder Dreifachplatten für technische Replikate. Wiederholen Zellkulturverfahren und die Behandlung mit einem anderen Durchgang der gleichen Zelllinie, die als biologische Replikation dieser Zelllinie dienen würde. Wiederholen Sie den Vorgang mit einer anderen Zelllinie replfindliche Ergebnisse in mehr als einer Zelllinie. Alle Zellkulturverfahren sollten unter sterilen Bedingungen in einem Abzug mit laminarer Strömung durchgeführt werden.

  1. Zellkulturstart
    1. Wärmen Sie die Medien auf 37 ° C in einer sterilen warmen Wasserbad.
    2. Tauen Sie eine gefrorene Fläschchen T47D oder MCF7-Zellen.
    3. Reinigen Sie die Außenseite der Flasche und Medienflasche mit 70% Ethanol, und legen Sie dann sowohl Ampulle und Flasche in sterile Laminarströmungshaube.
    4. Beschriften Sie eine sterile T-75-Kolben entsprechend (in der Haube).
    5. In 12 bis 15 ml des entsprechenden Medien in den Kolben mit einer sterilen serologischen Pipette (sicherstellen, dass Oberfläche vollständig mit Medien abgedeckt).
    6. Übertragen Sie die Zellen aus dem Fläschchen in den Kolben, und vorsichtig mischen.
    7. Danach wird der Kolben in ein 37 º C-Inkubator mit 5% CO 2 zugeführt.
  2. Herstellung von Zellen für die Behandlung
    1. Nehmen Zellen aus dem Inkubator und unter einem Mikroskop beobachtet, um sicherzustellen, dass die Zellen mindestens 80% Confluent. Dies ist, um sicherzustellen, dass genügend Zellen für Experimente. Übertragen Kolben auf sterile Haube.
    2. Entfernen Medien von Kolben mit einer sterilen Pasteur-Pipette mit einem Vakuum verbunden. Behutsam anhaftenden Zellen zweimal mit PBS.
    3. 1 ml warmes Trypsin-EDTA in den Kolben gegeben, und Inkubation der Flaschen in den Inkubator für 2 min. Dies ist, um die Zellen lösen sich von der Flasche.
    4. In etwa 3-4 ml warmen entsprechenden Medien in den Kolben und verreiben die abgelösten Zellen unter Verwendung einer 5 ml serologische Pipette. Man reibt durch die Aufnahme der Zellen in der serologischen Pipette und Lösen der Zellen mit der Spitze der Pipette gegen den Boden des Kolbens, um den Druck zu erhöhen platziert. Dies ist, um die Zellen in einzelne Zellen auseinander zu brechen.
    5. Zählen Sie die Zellen, z. B. mit Hilfe eines Zellzählers, nach dem Protokoll des Herstellers.
    6. Kennzeichnen 100 mm-Platten (wie erforderlich) und mit etwa 10 ml Medium zu den Platten. Platte etwa 2,0 x 10 6 Zellen / Platte. Verteilen Zellen durch gentle wirbeln die Platten.
    7. Inkubieren Zellen für 24-48 Stunden, bis ca. 80% konfluent.
    8. Bei 80% Konfluenz, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, und fügen Sie die entsprechenden 5% DCC-FBS Medien. Dann inkubieren Zellen für 24 Stunden.
    9. Nach 24 Stunden, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, und fügen Sie die entsprechenden 0,5% DCC-FBS Medien. Dann inkubieren Zellen für weitere 48 Stunden.
  3. Zellbehandlung
    1. Nach 48 Stunden, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Achten Sie darauf, wie viel von der PBS wie möglich zu entfernen.
    2. In einem 15 ml konischen Röhrchen werden 10 ml der geeigneten 0,5% DCC-FBS-Medien. Dann fügen Sie 1 ul der 0,1 mM Ligand Lager (E2 oder ICI) für eine endgültige Konzentration von 10 nM. Auch wird mit 1 ul Fahrzeug 10 ml Medium in einem separaten Rohr für das Kontrollexperiment.
    3. Mischen Sie Inhalte in Rohr sanft und in den Zellen in der Platte. Dies sollte ein Ligand pro Platte sein.
    4. Inkubieren Zellen für den gewählten Zeitpunkt (0-72 h).
<p class = "jove_title"> 3. RNA-Extraktion und Qualitätskontrolle

  1. RNA-Extraktion
    1. Nach der Behandlung wird für die gewünschte Zeitdauer beendet, wäscht die Zellen zweimal mit PBS, dann fügen etwa 1-2 ml Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Lösung zu den Zellen in der Platte. ACHTUNG: Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Lösung ist durch den Kontakt mit der Haut oder den Augen giftig, durch Einatmen oder Verschlucken. Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung, Schutzhandschuhe und Schutzbrille / Gesichtsschutz tragen, und verwenden Abzug.
    2. Sicherzustellen, dass das Volumen der Zellen nicht mehr als 10% des Volumens des Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Lösung, und daß die Platte mit der Lösung bedeckt und lassen für 1 min stehen lassen. Dann kratzen Zellen mit einem Gummischaber und Transfer in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Zellen können in dieser Lösung bei -80 ° C über Wochen gelagert werden.
    3. Extrahieren und zu reinigen Gesamt-RNA aus jeder Behandlung mit dem Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Methode, gefolgt von Spin-Säule Reinigung und DNaseI-DNA-Abbaumethode für tierische Zellen.
    4. Nach der Extraktion werden die Zellen in 60 ul RNase-freiem Wasser eluiert. Aliquot 1-2 ul RNA für die Quantifizierung und Analyse Shop RNA bei -80 ° C
    5. Messen Sie die RNA-Konzentrationen mit 1 ul von RNA und aspectrophotometer. Stellen Sie sicher, dass es eine leere genommen, bevor eine Messung durchgeführt. Auch komplett wischen Sie das Spektralphotometer Reichweite Zeit eine Messung durchgeführt. Die Konzentrationen werden in der Regel in ng / ul gezeigt. Ergebnisse speichern, die RNA-Konzentrationen.
  2. RNA-Qualitätskontrolle
    1. Nehmen Sie etwa 100 ng RNA von jeder Probe und in einem Mikrozentrifugenröhrchen.
    2. Messen Sie die Integrität der RNA mit einem Bioanalyzers. In der Regel 12 Proben können auf einmal in einem Bioanalyzers ausgeführt werden. Führen Sie dauert in der Regel etwa 25 min.
    3. Ergebnisse mit der RNA-Leiter zu vergleichen, um sicherzustellen, dass die RNA ist für Experiment. Speichern und Drucken Ergebnisse.

4. Bestätigung der Treatment: qPCR von Protein-kodierenden Gene

  1. cDNA-Synthese
    1. Nehmen Sie 500 ng oder 1 ug der Gesamt-RNA (jeder Probe) und in einer 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Bringen Sie die Lautstärke der einzelnen Röhre bis zu 10 ul mit RNAse-freies Wasser.
    2. Add 2 ul 50 uM Zufalls-Hexamer-Primer und Wärmerohren auf 70 ° C für 10 min.
    3. Übertragungsrohren, um Eis für 5min.
    4. Für jede Probe wird mit 4 &mgr; l 5 × Erststrang-Puffer, 1 ul 0,1 M DTT, 1 ul 10 mM dNTPs, 0,5 &mgr; l Superscript III und 1,5 &mgr; l RNase-freiem Wasser.
    5. Die Röhrchen in einem 25 ° C Heizblock oder Wasserbad für 10 min.
    6. Übertragungsrohre zu einem 46 ° C Wärmeblock für 1 Stunde. Dann Übertragungsrohre zu einem 70 ° C-Heizblock für 15 min, um die Reaktion zu stoppen.
    7. Verdünnen Sie die cDNA zu einem 5 ng / ul Lager (berechnet unter Verwendung von Gesamt-RNA-Eingang) mit RNase-freies Wasser für Verdünnungen und bei -20 ° C
  2. qPCR
    1. Erhalten Primer für die Gene von Interesse und Referenzgenen. Primer können leicht mit dem Primer-Design-Tool auf NCBI BLAST-Programm Primer-12 ausgelegt werden. Dies erzeugt in der Regel eine Vorwärts-und Rückwärts-Primer für jedes Gen von Interesse. Primer sollten 18-22 bp lang sein, eine Schmelztemperatur von 52-58 ° C, einen GC-Gehalt von 40-60% und ein Amplikon Länge von 100-180 bp.
    2. Für jede qPCR Reaktion gut, ng cDNA hinzufügen 10 (2 ul ab Lager Konzentration von Schritt 4.1.7), 1 pmol von jedem der Vorwärts-und Rückwärts-Primer des Gens von Interesse (aus Schritt 4.2.1) und 5 ul 2x Cyaninfarbstoff PCR Master Mix. Die Reaktion für jede Vertiefung sollte eine 10 ul endgültige Reaktionsvolumen.
    3. Stellen Sie sicher, dass es drei Vertiefungen für jede Probe für jedes Gen (für technische Replikate). Ein 96-Well-Reaktionsplatte verwendet werden.
    4. Auf der qRT-PCR-System-Software, weisen Sie den Reporter-und Ziel Geben Reaktionsvolumen, wählen Sie die VergleichsSchwellenzyklus (ΔΔCt)-Methode, und definieren Probenvertiefungen.
    5. Achten Sie darauf, Schmelzkurvenanalyse für alle Cyaninfarbstoff Läufe durchführen, um die Verstärkung einer bestimmten Fragment bestätigen. Führen Platten mit den Standardeinstellungen für den Lauf.
    6. Sparen Ergebnisse nach Lauf und Export von Daten (vor allem die CT-Werte in MS Excel).
  3. qPCR Datenanalyse unter Verwendung der Formel ΔΔCT
    Die Veränderung der relativen mRNA-Expression kann berechnet werden, wie fache Veränderung gegenüber auf Excel für jede Probe mit den folgenden Schritten steuern:
    1. Alle exportierten Ergebnisse der qPCR oben sollte die Ct-Werte enthalten. Berechnen Sie die ACt Wert nach folgender Formel:
      • ACt = CT (Zielgen) - CT (Referenz-Gen)
      Dies sollte für jede Probe durchgeführt werden. Das Ziel ist das Gen von Interesse oder miRNA.
    2. Als nächstes berechnen die Gesamtstandardabweichung (SD) für jede Probe. Zuerst berechnendie SD für den Referenz-Gen und berechnen dann die SD für den Ziel-Gen (dies kann auf excel mit der STD DEV-Funktion auf der CT-Werte durchgeführt werden). Dann berechnen die Gesamt SD für jede Probe mit dieser Formel:
      • Insgesamt SD = (SD2 (Ziel) + SD2 (Referenz)) 1/2
    3. Errechnen ΔΔCT jeder Probe innerhalb eines Gens (Target) von:
      • ΔΔCT = ΔΔCT (behandelt / Probe) - ΔΔCT (Kontrolle / Kalibrator Probe)
      Der Kalibrator Probe ist die unbehandelte Probe.
    4. Schließlich berechnet die Werte jeder Probe unter Verwendung der Formel fold change (FC):
      • FC = 2-ΔΔCT
      Die fold change-Wert jeder Probe wird die relative Expression des Gens / miRNA, die dem Referenz-Gen und der Kontrollprobe normalisiert wurde.
    5. Student-t-Test für die statistische Analyse mit Hilfe von zwei-tailed Verteilung und zwei Stichproben ungleicher Varianz verwendet werdenParameter: (P <0,001 (***) P <0,01 (**), und P <0,05 (*)). Dies kann erreicht werden auf Excel. Bestätigen Sie, dass die Behandlung führte in der Regulation der bekannten Ziele, bevor mit miRNA-Profiling fortfahren.

5. miRNA-Profiling-Analyse

  1. miRNA-Microarray
    1. Take 5 ug isolierte RNA aus Zellen entweder mit Fahrzeug-oder Liganden, und in ein Mikrozentrifugenröhrchen behandelt. Stellen Sie die Lautstärke im Rohr auf 20 ul. Jeder Vergleich sollte in Duplikaten oder dreifach durchgeführt werden.
    2. Führen Sie die miRNA-Microarray mit Hilfe der RNA-Proben vor. miRNA-Microarray-Expressionsprofile sollten mit menschlichen miRNA-Microarray-Dual-Farbmuster-Array μParaflo Mikrofluidik-Biochip-Technologie (Sanger miRBase Release 14.0) 13 bestimmt werden.
    3. Die Ergebnisse sollten differentiell exprimierten miRNAs zu zeigen. Betrachten erhebliche miRNA Ausdrücke, wenn p <0.05.p-Wert <0.10 kann auch für die weitere Zusammenarbeit in Betracht gezogen werdennfirmatory Analyse mit qPCR. Speichern Sie diese miRNA Liste für weitere Validierung mit qPCR.
  2. miRNA-Profiling: DLP-LDA
    1. Jede Probe sollte in Duplikaten oder dreifach analysiert werden. Nehmen Sie 700 ng Gesamt-RNA aus Zellen entweder mit Fahrzeug-oder Liganden behandelt, und legen in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Stellen Sie die Lautstärke in Rohr 3 ul.
    2. Führen Sie die cDNA-Synthese mit Hilfe der Dual-markierten Sonden miRNA Testverfahren und die 10x RT Primer. Gesamtvolumen für jede Reaktion sollten 7,5 ul sein.
    3. Zeigen Reaktionsrohr in der PCR-Thermocycler-System, und empfohlen, Parameter wie im Dual-markierten Sonden miRNA-Assay-Verfahren angegeben. Starten Sie den Lauf. Dies wird cDNA zu erzeugen. Beachten Sie, dass die cDNA bei -20 ° C für mindestens 1 Woche gelagert werden.
    4. Während RT-Reaktion läuft, nehmen Sie die DLP-LDA Platten und lassen bei Raumtemperatur stehen lassen. Jedes Array Platte enthält 384 Brunnen, die einzigartige miRNA Primer und Steuer Primer enthalten.
    5. Take 6 ul der cDNA (ab 5.2.3) und in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. In 450 ul der Dual-markierten Sonden 2x Universal-PCR Master Mix und fügen Sie 444 ul RNase-freies Wasser.
    6. Kehren Rohr zu sechs Mal, um Inhalte und Zentrifuge kurz mischen.
    7. Wenn der DLP-LDA Platte Raumtemperatur, Last 100 ul in jede der acht erreicht hat "Fill-Port 'der Platte. Dann Zentrifuge die Matrixplatte.
    8. Öffnen Sie die qRT-PCR-System und prüfen Sie, dass der Block ist, dass für die 384-Well-Platte. Richten Sie laufen mit der SDS Software. Wählen relative Quantifizierung (Ct), wählen Sie die Nummer und auch Array-Typ, und geben Sie in die Vertiefungen Probenbeschreibung zu definieren.
    9. Führen Array mit den Standardtemperaturwechselbedingungen. Wenn Lauf beendet, Ergebnisse speichern und den Export in MS Excel und speichern Sie für die weitere Analyse mit Hilfe der Formel ΔΔCT (Schritt 4.3).

6. Bestätigung der miRNA-Verordnungen mit SeparateqPCR-Analyse

  1. Cyaninfarbstoffes qPCR-Analyse
    1. Design-Primer für die gewünschte miRNA-Analyse. Sequenz der reifen miRNA, die die Vorwärts-Primer entspricht, kann von mirbase.org 14 erhalten werden. Wandeln Sie alle 'U' auf 'T'.
    2. Bereiten cDNA: Nehmen Sie 1 ug Gesamt-RNA und in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Folgen Sie den Anweisungen für die Poly-A-Tailing und First-cDNA-Synthese von miRNA aus einer ersten miRNA-Strang-cDNA-Synthese und qRT-PCR-Protokoll. Verdünnen Sie die resultierende cDNA (1:10) und bei -20 ° C
    3. Erhalten Sie einen 96-Loch-Reaktionsplatte.
    4. Für jedes miRNA-qPCR Reaktion gut, fügen Sie 16 ng polyA cDNA (aus Schritt 6.1.2), 2 pmol von jedem der spezifischen Vorwärts-Primer (aus Schritt 6.1.1) und die universelle Primer (aus dem Kit von Schritt 6.1.2 ) und 5 ul 2x qPCR Master Mix. Schlussreaktionsvolumen beträgt 10 ul /.
    5. Stellen Sie sicher, dass es drei Vertiefungen für jede Probe für jedes miRNA (für technische Replikate). Auch, Stellen Sie sicher, dass ein Referenz-Gen (in der Regel U6 snRNA) ist enthalten.
    6. Auf der qRT-PCR-System-Software, weisen Sie den Reporter-und Ziel Geben Reaktionsvolumen, wählen Sie die Vergleichsschwellenzyklus (ΔΔCT)-Methode, und definieren Probenvertiefungen.
    7. Führen Platten mit den Standardeinstellungen für den Lauf. Achten Sie darauf, Schmelzkurvenanalyse für alle Cyaninfarbstoff Läufe durchzuführen. Jede Schmelzkurve sollte nur eine spezifische Spitzen zeigen, um die Verstärkung einer bestimmten Fragment bestätigen. Wenn mehr als ein Spitzenwert oder kein deutlicher Peak beobachtet wird, sind die Primer nicht spezifisch und können die Daten nicht verwendet werden.
    8. Sparen Ergebnisse nach Lauf und Export von Daten (vor allem die CT-Werte in MS Excel).
  2. Dual-markierten Sonden qPCR-Analyse
    1. Nehmen Sie sich 10 ng Gesamt-RNA der einzelnen, jeweils in einem 5-ul-Volumen und in 0,2 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    2. Folgen Sie den Anweisungen aus dem Protokoll über die Durchführung der reversen Transkription (RT) mit dem Dual-markierten Sonden MicroRNA-Reverse-Transkriptase-Kit 15. Jede Gesamtreaktionsvolumen sollte 15 ul sein. Beachten Sie, dass der Dual-markierten Sonden RT Reaktionen, gibt es spezifische Primer für jedes Molekül zu untersuchen.
    3. Platz Reaktionsrohr in der PCR-Thermocycler-System, und Parameter gemäß dem Protokoll in Schritt 6.2.2 oben angegeben. Starten Sie den Lauf. Es sollte etwa 70 bis 80 Minuten dauern.
    4. Nach der RT-Reaktion, die Probe zu verdünnen cDNA in einem Verhältnis von 1:5, und speichern alle cDNA im Dunkeln bei -20 ° C.
    5. Erhalten Sie einen 96-Loch-Reaktionsplatte.
    6. Für jedes miRNA-qPCR Reaktion auch den folgenden: 10 ul Dual-markierten Sonden 2x Universal-PCR Master Mix (gleiche Reagenz als Schritt 5.2.5), 7,67 ul RNase-freies Wasser, 1 ul 20 × Echtzeit-Assay-Primer (spezifisch für jedes miRNA) und 1,33 &mgr; l der cDNA aus Schritt 6.2.4 oben. Dies sollte ein 20 ul endgültige Reaktionsvolumen sein. Mischen Sie Inhalte sanft und kurz zentrifugieren.
    7. Stellen Sie sicher, dass there sind drei Vertiefungen für jede Probe für jedes miRNA (für technische Replikate). Stellen Sie außerdem sicher, dass ein Referenz-Gen (in der Regel U6 snRNA) ist enthalten.
    8. Auf der qRT-PCR-System-Software, weisen Sie den Reporter (FAM) und Quencher (NFQ-MGB) für jedes miRNA (Ziel) von Interesse, geben Sie Reaktionsvolumen, wählen Sie die Vergleichsschwellenzyklus (ΔΔCt)-Methode, und definieren Probenvertiefungen.
    9. Folgen Sie den Anweisungen zum Einrichten der Parameter für die qPCR von der Dual-markierten Sonden microRNA Assay-Protokoll laufen. Starten Sie dann den Lauf. Sparen Ergebnisse nach Lauf und Export von Daten (vor allem die CT-Werte in MS Excel).

Representative Results

Ein Überblick über den Ansatz ist in Abbildung 1 dargestellt und ein Vergleich der verschiedenen Probenpräparationen und Nukleinsäure Modifikationen für jede Technik erforderlich ist in Fig. 2 visualisiert.

Der Zustand und die Umgebung der Zellen vor der Behandlung mit einem Hormon ist bei der Bestimmung der tatsächlichen Effekte des Hormons 16 wichtig. Einige mittel-und Serum enthalten Wachstumsfaktoren, die die Ergebnisse beeinflussen können, so dass Zellen Serum ausgehungert, um sicherzustellen, dass alle Hormonwirkungen auf ein Minimum reduziert worden. Daher wird, wenn die Behandlung mit E2, gibt es mehr Sicherheit, dass die beobachteten Effekte E2 verbunden. Ein wichtiger Faktor ist die Konfluenz der Zellen, die Zell-Zell-Kontakt und Verhaltensweisen wie Zell-Zell-Signalisierung und Proliferation beeinflusst. Zellen wurden zu 80% konfluent (3A) und gut befestigt, um das Wachstum zu ermöglichen und den Verlust von Zellen bei der anschließenden Wasch-und Medien-CH vermeidenange.

Die Bedingungen während der RNA-Extraktion und Speicherung sind wichtig für die Qualität der RNA und die anschließende Analyse. Es ist auch bekannt, dass die Anzahl der Zellen, das Extraktionsverfahren und der GC-Gehalt der miRNA können die Ausbeute und Qualität der beiden mRNAs und miRNAs 17 beeinflussen. Daher ist es notwendig, die RNA-Extraktion während RNase-freien Bedingungen durchzuführen und die Qualität der RNA, bevor Sie fortfahren mit Experimenten zu überprüfen. Nach der Extraktion der RNA-Quantifizierung bietet Informationen über die Konzentration der Gesamt-RNA (die sowohl mRNAs und miRNAs), die Beobachtung der Ausbeute ermöglicht. Es bietet auch eine grafische Darstellung der Ergebnisse, wie in Fig. 3B zu sehen, und dies ermöglicht die Beobachtung der Reinheit der Probe (in der Regel durch einen Peak, obere Abbildung dargestellt). Schlechte Ausbeute von RNA würde keine spezifische Absorption bei 260 nm (3B, Bodenplatte) zu produzieren. Um festzustellen, ob die RNA ist von hoher Qualität, RNAIntegrität wurde gemessen. Ein RNA Integrity Number (RIN) zwischen 9-10 stellt sicher, dass die RNA nicht abgebaut und ist von optimaler Qualität. Auch sollte die grafische Darstellung der RNA beobachtet werden, und die 18S-und 28S-rRNA ist, wie in 4 (Mitte) gezeigten Peaks haben. Vergleich mit der Leiter (Abbildung 4, oberes Feld) identifiziert, die Größe der Gipfel. Ein RNA abgebaut würden weniger klar Gipfel und eine reduzierte relative Menge des 18S-28S rRNA und (Abbildung 4, Bodenplatte) haben. Der Anteil der kleinen RNAs kann weiter mit dem Agilent Small RNA Kit gewährleistet werden. Es wird empfohlen, Östrogenreaktion nach der Behandlung zu überprüfen, unter den angegebenen Versuchsbedingungen, bevor Sie mit miRNA-Screening. Ein qPCR können auf einem bekannten ER Zielgens wie PS2 oder SPINK4 18 durchgeführt werden, unter Verwendung von cDNA-Vorlage. Solche Gene werden in der Regel innerhalb von 1-24 Stunden nach E2-Behandlung hochreguliert. Sobald die Qualität der RNA und der Östrogen-Reaktionsbeurteilt wurde, weiteres Experiment durchgeführt werden.

Mikroarray ist noch eine weit verbreitete Technik für große Screening miRNA-Expression in Zellen. Zum Beispiel die miRNA-Microarray einmal verwendet wurden, enthielten 894 reifen miRNAs und 50 Kontrollen einzigartige Sonden in Vierlinge ein. Hybridisierungen wurden in Duplikaten mit Dye-Swap-Verfahren durchgeführt. Die Microarray-Ergebnisse miRNA sind in der Regel grafisch durch Wärme Karten vertreten. 5A zeigt eine Heatmap, was Daten aus einem miRNA-Microarray-Vergleich zwischen dem Fahrzeug und E2 behandelten Proben. Die rote zeigt, dass die miRNA wird in der E2-behandelten Probe (höhere Expression) hochreguliert, während die grüne angegeben Herunterregulation der miRNA (untere Ausdruck). Die miRNA Auswahl der Regel abhängig von ihrer Bedeutung im Ausdruck, und in der Regel ein p-Wert kleiner als 0,05 wird als signifikant angesehen. Die miRNAs, die gekennzeichnet sind differentiell exprimiert werden sollte weiter validiert werden, with qPCR, um sie von falschen Positiven zu unterscheiden.

Der DLP-LDA-Array, auf der anderen Seite nutzt eine qPCR-basierte Methode für regulierte miRNAs in einer 384-Well-Format zu screenen. Üblicherweise werden zwei 384-Well-Platten (Karten) vorgesehen sind, Pools A und B. Pool A enthält in der Regel besser charakterisiert und mehr hoch exprimiert miRNAs als der Pool B. Die relativen Pegel jedes miRNA durch qPCR, wo man pro miRNA analysiert bestimmt gut (Abbildung 5B). Eine höhere Ct-Wert gibt an, weniger miRNA-Expression. Ähnlich wie die miRNA-Microarray, ergibt sich aus der DLP-LDA erreicht müssen weiter validiert werden, um die Genauigkeit zu gewährleisten.

Validierungen können mittels qPCR werden. Hier sind zwei qPCR Nachweismethoden beschrieben, um Verfahren Bias zu verhindern und für eine gründliche Untersuchung und Bestätigung der miRNA-Vorschriften erlauben. Cyanin-Farbstoff-Nachweischemie arbeitet anders als DLP dass der DLP-LDA Profilierung basiert, und ist geeignet für bestätigenation Zwecke. Es können weniger spezifisch sein, wie es erkennt alle amplifizierten doppelsträngigen DNA, aber die Homogenität der Probe kann durch Durchführen einer Schmelzkurvenanalyse. 6A (links) zeigt, beurteilt die Schmelzkurvenanalyse einer miRNA, und klar definierten einheitlichen Peak zu sehen. Mehrere Spitzen würde beobachtet werden, wenn die Grundierung ist unspezifisch oder erhebliche Mengen an Primer-Dimer gebildet wird (6A, rechts). DLP miRNA-Assays auf der anderen Seite, ist spezifischer als nur die Amplifikation der Ziel-miRNA detektiert wird. Verstärkungsstücke jedes Ziel-miRNA kann beobachtet werden, wie in 6B veranschaulicht. Die Option für das Auftreten mehrerer Amplifikationsprodukte unter Verwendung der Schmelzkurvenanalyse steuern ist jedoch nicht mit dieser Chemie und Cyaninfarbstoff qPCR ist weniger teuer Verfügung. Cyaninfarbstoffes-und DLP-qPCR-Assays kann manchmal erzeugt leicht unterschiedlichen Ergebnissen. Für beide qPCR-Assays Vergleich zu einem Referenz Gen erforderlich ist, um die relative Expression von Genen zwischen zwei Proben zu bestimmen. Die Referenz-Gen, das auch als Housekeeping-Gen bezeichnet wird, sollte ein Gen, dessen Expression nicht verändert wird und die wird auf ähnlichem Niveau wie das Gen von Interesse ausgedrückt werden. Ein Beispiel eines geeigneten Referenzgens in diesen Brustkrebszelllinien ist ARHGDIA ein Rho GDP-Dissoziation-Inhibitor, GDP / GTP-Austauschreaktionen der Rho-Proteine ​​dient. Wie in 6C (oben) beobachtet wird, wird das Niveau der mRNA ARHGDIA nicht zwischen dem Fahrzeug und dem Liganden behandelten Proben verändert. Die 18S rRNA können auch verwendet werden, wenn auch ihre hohe Expression erfordert eine separate 1:500 Verdünnung der cDNA-Lager und ist daher weniger geeignet. Für miRNA-Analyse, gibt es noch eine Debatte über eine gut definierte Referenz-Gen. Bisher ist die U6 snRNA ein Referenz-Gen, die häufig für die miRNA-Analyse wird akzeptiert. U6 snRNA ist die ~ 110 Nukleotide lange, nicht-kodierende RNA, die kleine nukleare Kern in pre-mRNA spl funktionieren19 Sahnehäubchen. Wie in 6C (unten) beobachtet, sind U6 Expressionsniveaus in allen gezeigten Proben etwa gleich, so dass für die Berechnung der variablen Ebenen der miRNA. Eine grafische Darstellung eines miRNA qPCR Ergebnis eines Vergleichs zwischen dem Fahrzeug und E2-behandelten Zellen, die mit dem Bezugs U6 normalisiert worden sind, können in 6D beobachtet werden. Dies veranschaulicht eine miRNA, die erkannt wurden als nach 24 Stunden E2 Behandlung nicht regulierte, aber ER Chromatin-Bindungsstellen in der Nähe seiner genomischen Lage birgt, und Zeitreihenanalyse identifizierte signifikante Regulierung 72 Stunden nach der Behandlung.

Figur 1
Fig. 1 ist. Eine Übersicht über die für den Nachweis von hormonellen Regulation der miRNA in Brustkrebszellen eingesetzt Ansatz.

Figur 2
2. Vergleich der verschiedenen Probenpräparationen und Nukleinsäuremanipulationen für jedes miRNA-Nachweistechnik. (A) miRNA-Microarray-Technologie mit der μParaflo Verfahren umfasst Anreicherung, Poly-A-Tailing und Ligation Kennzeichnung. (B) DLP-Technologie Probenaufbereitung und Nachweisverfahren umfasst einen geloopten cDNA-Synthese-Primer, die nach der Denaturierung erstreckt und eine längere Fragment, das Reverse-Primer-und Sondensequenz. (C) Cyanin-Farbstoff-Technologie Probenvorbereitungund Nachweisverfahren enthält Poly-A-tailing und cDNA-Synthese mit einem Oligo-dT-Primer mit einer universellen 5'-Sequenz.

Fig. 3
3. Zellkultur und RNA-Extraktion. (A) Die kultivierten Zellen zu 80% Konfluenz vor der Behandlung mit Liganden benötigt nach der Extraktion zu veranschaulichen. (B) Grafische Darstellung der RNA-Konzentration und Reinheit. Jeder Peak steht für eine Probe und eine erfolgreiche Extraktion ergibt reinen RNA (oben). Ein schlecht extrahierte RNA zeigt keine klare Absorptionsmaximum bei 260 nm (unten).

Fig. 4
Abbildung 4. & #160; RNA-Qualitätskontrolle von RNA Ergebnisse Integritätsanalyse, die grafische Darstellung für die Leiter (oben), eine gute Qualität RNA (Mitte) und einer abgebauten RNA-Probe (unten)..

Figur 5
5. Eine Abbildung der miRNA-Profiling-Ergebnisse. (A) Ein Wärmekartendarstellung der miRNA-Microarray-Ergebnisse für differentiell exprimierte miRNAs. miR-A, B, C werden in der E2-behandelten Probe hochreguliert wie in rot angezeigt, während miR-D, E, F, G sind in der E2-behandelten Probe herunterreguliert wie in grün angezeigt. (B) Amplification Plots für jede miRNA aus den DLP-LDA Ergebnisse. miRNA erkannt werden verstärkt, wie durch Erhöhung der Rn-Wert angegeben.

Fig. 6 6. qPCR Analyse von miRNA-Vorschriften. (A) Schmelzkurvenanalyse für eine miRNA analysiert mit Cyanin-Farbstoff-Erkennung, zeigt Homogenität aller getesteten Proben (links) und Verstärkung der mehrere Fragmente (rechts). (B) Amplification Plots für jede Probe für eine miRNA. Dies kann entweder aus Cyanin-Farbstoff-oder DLP-Nachweismethoden sein. (C) Bargraph-Darstellung geeigneter Referenzgene für die mRNA-Analyse ARHGDIA (oben) und für die miRNA-Analyse snRNA U6 (unten) zeigt keine signifikante differentielle Expression zwischen den Proben. (D) miRNA-qPCR Ergebnisse Vergleich der relativen Expression von miR-135a über einen Zeitverlauf zu veranschaulichen. 6D aus Katchy et al. 1 mit Genehmigung von Elsevier neu aufgelegt. Die Werte sind in der Regel der Durchschnitt der separaten experFormen (biologische Duplikate) ± SD. Student-t-Test wird verwendet, um Bedeutung zu demonstrieren: * p <0,05.

Discussion

Bestimmen der Mechanismus für die hormonelle Regulation der miRNA in Brustkrebszellen können eine Plattform für das Verständnis dieser Krankheit bereitstellen und mögliche Behandlung für Brustkrebs ist. Kultivieren dieser Zellen, um die optimalen Bedingungen für die Hormonwirkung bereitzustellen ist sehr wichtig. Hier ist ein Protokoll, das sicherstellt, dass das Hormon von Interesse (Östrogen) ausgeschlossen wurde vor der Behandlung und, dass eine optimale Dosis von E2 wurde für eine geeignete Zeit, während der Behandlung verwendet wurde beschrieben. Und andere hormonelle Wachstumsfaktor Effekte auf ein Minimum durch die schrittweise Senkung der Serumwerte und unter Verwendung von DCC-FBS, die FBS, die von den meisten seiner Hormon, Zytokine und Wachstumsfaktoren abgestreift worden ist, gehalten wird. Phenolrot-freien Medien wurde weiter verwendet, um andere hormonelle Effekte zu minimieren, da Phenolrot wurde berichtet, dass östrogene Aktivität auswirken und bestimmte Funktionen in Zelllinien 20,21. Die Zeit der Exposition der Zellen gegenüber dem Hormon ist von großer Bedeutung,. Für Östrogen-assoziierte Regulation von Genen hat sich bereits gezeigt, dass 24-hrexposure produzieren signifikante Reaktion der direkten Zielgene in Brustkrebszellen 1,18. Da miRNAs werden durch RNA-Polymerase II transkribiert, wie mRNAs, ist es denkbar, dass dies ein geeigneter Zeitpunkt, um direkte Regulierung auch von miRNAs zu erkennen. Es ist noch nicht bestimmt werden, ob und wie diese miRNAs beeinflussen die Expression von diesen bekannten ER Ziele in Brustkrebszellen.

miRNA-Expressionsprofiling kann aufgrund der relativ geringen Größe der miRNA, die Tatsache, dass die reife miRNA-Sequenz kann auch in der pri-miRNA und der pre-miRNA gefunden werden eine Herausforderung sein, und wegen der Heterogenität in ihrer GC-Gehalt 22. Mehrere Profilierungstechniken und Chemien verwendet worden, um diese Schwierigkeit zu überwinden. Unter diesen sind verschiedene Ansätze von Mikroarrays und qPCR-Analyse (Fig. 2). Obwohl Microarray ist weithin bekannt für gesamte Genom anal akzeptiertlyse, kann es falsch negative bieten und es gibt Unterschiede zwischen den verfügbaren Plattformen, angefangen von der Chemie auf die Drucktechnik 23. Auch die Normalisierungsprozess stellt eine Herausforderung bei der Analyse der relativ wenigen miRNA Gene, die im Vergleich zu den Zehntausenden von mRNA-Transkripten in Tausenden gezählt werden. qPCR, auf der anderen Seite, ist empfindlicher und besser angewendet, wenn weniger Gene zu berücksichtigen. Wenn sie jedoch in großen 384-Well-Platten durchgeführt, wobei nur eine technische replizieren pro Platte, müssen mehrere Platten für jede Probe, die das Analyse kostspielig macht analysiert werden. Auch in unseren Händen, viele andere falsch-negative Ergebnisse wurden unter Verwendung der DLP-LDA-Analyse im Vergleich zu dem Microarray erhalten. Da die reife miRNA-Sequenz in der pri-miRNA und der pre-miRNA-Sequenzen vorhanden ist, ist es von Interesse, zwischen diesen Transkripte mittels PCR-Techniken 24 unterscheiden. DLP-Sonden sind auch für Pre-miRNAs und specific Primer können auch entworfen werden, um verschiedene reifen oder Vorläufer-Varianten mit Cyaninfarbstoff qPCR-Technologie auszuschließen.

qPCR ist ein goldener Standard für die Validierung der differentiellen Expression von Profiling-Ergebnisse. Die Wirksamkeit der qPCR jedoch hängt von mehreren Parametern, einschließlich RNA-Extraktion, RNA-Integrität (Qualität), cDNA-Synthese, Primer-Design, Nachweisverfahren (Chemie) und dem Referenz-Gen für die Datennormierung 1,22,25. Die Optionen für die Primer-Design für die miRNA-Analyse ist sehr begrenzt, da der Kurz miRNA-Sequenzlänge nicht viel Raum zu geben für alternative Primer-Design, und nur eine Grundierung kann in dieser kurzen Sequenz gehegt werden. Daher besteht die Notwendigkeit für alternative Manipulationen, wie in Fig. 2 dargestellt. Technische Wiederholungen sind wichtig, um die Robustheit des Verstärkungsverfahren und das verwendete Verfahren zu validieren. Biologische Replikate für eine Darstellung der allgemeinen biologischen e Variation erforderlichn einschließlich variabler Reaktion auf die Behandlung Ligand und um zu zeigen, dass die Auswirkungen in einer Zelle zu sehen sind reproduzierbar. Basierend auf unserer Erfahrung können Schwankungen in miRNA-Expression zwischen Zellkulturen auftreten. Normalerweise werden diese Unterschiede sind weniger als das 1,3-fache, und der Durchschnitt der Werte und entsprechende SD identifiziert den natürlichen und technologischen Variation. Diese Variation kann von verschiedenen Faktoren ab, die Zelldichte und die Tatsache, dass Zellfunktionen können von Kanal zu Kanal ändern führen. Um statistisch signifikante Ausdrücke aus Liganden-Behandlung entstehenden identifizieren, ist eine allgemein anerkannte Bedeutung, wenn der p-Wert kleiner als 0,05 ist. Hier ein Student-t-Test auf den biologischen und technischen Replikate mit der two-tailed Verteilung und zwei Stichproben ungleicher Varianz-Parameter verwendet wurden. Andere T-Testparameter vorhanden sind, und die Wahl hängt von den experimentellen Aufbau 26.

Ein detailliertes Protokoll bei der Bewertung hormonelle Vorschriften der reifen miRNA in Brustkrebszellen bereitgestellt wurden. Wichtige Technologien und Chemie in der Profilerstellung und Validierung dieser miRNA Ausdrücke sind klar erläutert. Die für die Untersuchung der miRNA in Brustkrebszellen gewählte Technologie hängt letztlich davon ab, was genau untersucht.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Wir sind dankbar, dass Dr. Gao Xiaolian, Universität Houston, für die Beratung der LC Sciences miRNA-Microarray-Plattform, Dr. Karin Edvardsson, Karolinska Institut, Schweden, und Dr. Eylem Aydogdu, Universität Houston, für den Austausch von Know-how ihrer miRNA . Forschung in dieser Veröffentlichung berichtet, wurde von der National Cancer Institute der National Institutes of Health unter Preis Anzahl R01CA172437 unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health. Diese Arbeit wurde auch durch Zuschüsse aus dem Texas Emerging Technology Fund, unter Vertrag unterstützt. 300-9-1958.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 11885092
F12 Life Technologies 11765054
FBS Sigma-Aldrich F0926-500ML
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140122
Phenol red-free DMEM  Life Technologies 11054020
Ultrapure Water EMD Millipore Specific equipment
DCC-FBS Sigma-Aldrich F6765-500ML
100x L-glutamine Life Technologies 25030081
PBS tablet Medicago, Accurate Chemicals Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100)
17β-estradiol Sigma-Aldrich E2758
ICI 182,780  Sigma-Aldrich I4409
Ethanol Sigma-Aldrich E7023-600ML
T47D or MCF7 cells lines American Type Culture Collection (ATCC) T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22)
T-75 flask  VWR International LLC BD353136 (vented cap)
Trypsin-EDTA Life Technologies 25300062
Serological pipet VWR International LLC 53300. For 5mL (53300-421)
Countess Cell Counting chamber Life Technologies C10228
Countess Automated Cell Counter Life Technologies C10227
100 mm plates  VWR International LLC 25382-166
Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol) Life Technologies 15596026
Rubber cell scraper  VWR International LLC 82050-470
Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol) Qiagen 217004
Rnase-Free DNase I  kit (DNA degradation) Qiagen 79254
RNase-free water (Nuclease-free water) Thermoscientific SH30538.02
Nanodrop 1000 Spectrophotometer  Thermoscientific ND-1000
Agilent RNA 6000 Nano Assay kit Agilent 5067-1512
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent G2938C and for software (G2946)
All primers (except TaqMan primers) Integrated DNA Technologies Specific per order for each gene/miRNA
First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit)  Life Technologies 18080085
MicroAmp Fast 96-well reaction plate  Life Technologies 4346906
Fast Optical Adhesive Covers Life Technologies 4311971
2x SYBR green PCR master mix (Cyanine dye) Life Technologies 4385612
7500 Fast Real-Time PCR System and software Life Technologies 4351106
μParaflo Microfluidic Biochip Technology  LCSciences MRA-1001 and AS-2001(for result analysis)
DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set) Life Technologies 4400928
Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit  Life Technologies 4366596
GeneAmp PCR System 9700 thermocycler Life Technologies 4310899
Dual Labeled Probes (TaqMan) 2x Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG Life Technologies 4324018
7900HT Fast Real-Time PCR system Life Technologies 4329001
SDS and RQ manager softwares Life Technologies 4444202
NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit Life Technologies MIRC-50
10x DPL (TaqMan) RT primers Life Technologies Specific for each miRNA
20x DPL (TaqMan) real-time assay primer  Life Technologies Specific for each miRNA

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References

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Profiling von Östrogen-regulierte MicroRNAs in Brustkrebszellen
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Katchy, A., Williams, C. Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells. J. Vis. Exp. (84), e51285, doi:10.3791/51285 (2014).More

Katchy, A., Williams, C. Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells. J. Vis. Exp. (84), e51285, doi:10.3791/51285 (2014).

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