Summary
Vi har utviklet en hjerne stykke-modell som kan brukes for å undersøke molekylære mekanismer som er involvert i eksitotoksisitet-mediert hjerneskade. Denne teknikken skaper levedyktig modne vev i hjernen og reduserer dyrenumre som kreves for eksperimentering, mens du holder den nevrale kretsene, cellulære interaksjoner, og postsynaptiske avdelinger delvis intakt.
Abstract
Undersøkelse av molekylære mekanismer som er involvert i nevropatologiske tilstander, som for eksempel iskemisk slag, kan det være vanskelig ved bruk av hele dyresystemer. Som sådan, primær eller 'nevronale-lignende' cellekultursystemer er vanligvis benyttes. Selv om disse systemene er forholdsvis lett å arbeide med, og er nyttige modellsystemer hvori forskjellige funksjonelle resultater (for eksempel celledød) kan lett kvantifiseres, de undersøkte resultatene og veier i dyrkede umodne nevroner (slik som eksitotoksisitet-mediert celledød pathways) er ikke nødvendigvis de samme som de som ble observert i moden hjerne, eller i intakt vev. Derfor er det behov for å utvikle modeller hvori cellulære mekanismer i moden neural vev undersøkt. Vi har utviklet en in vitro-teknikk som kan brukes til å undersøke en rekke molekyl baner i intakt nervevev. Den teknikk som her er beskrevet anvender rotte kortikalt vev, men denne teknikken kan tilpasses for å bruke vevfra en rekke arter (for eksempel mus, kanin, marsvin, og kylling) eller hjerneregioner (f.eks, hippocampus, striatum, etc.). I tillegg kan en rekke stimuli / behandlinger brukes (for eksempel, eksitotoksisk, administrering av inhibitorer, etc.). Som konklusjon kan hjernen skive modellen som er beskrevet her kan brukes til å undersøke ulike molekylære mekanismer som er involvert i eksitotoksisitet-mediert hjerneskade.
Introduction
Den vanligste formen for hjerneslag er hjerneinfarkt, som oppstår når en cerebral blodåre tettes. Vevet ischemi som er et resultat av opphør av blodstrøm fører til utstrakt depolarisering av membraner, frigjøring av eksitatoriske nevrotransmittere, og varig økning av intracellulært kalsium, noe som fører til aktivering av celledød trasé 1.. Denne prosessen er blitt betegnet "eksitotoksisitet", og er en felles bane som er involvert i neuronal død som produseres av en rekke patologiske tilstander, herunder stryke 2.. Hemming av signalveier involvert i excitotoxicity og andre nevronale celledød kaskader er en tiltalende måte å begrense neuronskade etter hjerneslag.
Identifisere de nøyaktige molekylære mekanismene som er involvert i excitotoxicity og iskemisk hjerneslag kan være vanskelig når du bruker hele dyre systemer. Som sådan, primær embryonale og 'neuronal-aktig "(f.eks neuroblastoma og adenokarsinom udødelig linjer) cellekultursystemer brukes ofte. De viktigste fordelene med disse modellene er at de er lette å manipulere, relativt kostnadseffektivt, og celledød lett kan måles og kvantifiseres. Imidlertid kan signalveier endres av dyrkningsforhold brukt 3,4, og umodne nerveceller og udødelig linjer kan uttrykke ulike reseptorer og signalmolekyler i forhold til modne hjernen 5-8. Videre er bare dyrkede neuroner tillate undersøkelse av en celletype (eller to, hvis en coculture systemet brukes), mens intakt hjernevev er heterogen, inneholdende en rekke celletyper, som samvirker med hverandre. Organotypic skive kultursystemer (tynne eksplantater av hjernevev) blir også benyttet, og disse modeller tillater studiet av heterogene populasjoner av celler som de finnes in vivo. Imidlertid kan bare en begrenset mengde av vev fås fra hvert dyr ved bruk av denne teknikken, kan skiverikke dyrkes så lenge som udødeligcellelinjer, og mellomlang til lang sikt kultur kan føre til endringer i signalveier og reseptorer i skiver. Mens moden hjerne kan brukes til å generere organotypic skiver, stykker fra umodne hjernen er mer mottagelig for kulturen, og er mer vanlig brukt. Det er derfor behov for å utvikle modeller som etterligner eller representerer intakt moden hjerne, som er enkle å bruke, der nevrale signalveier kan bli undersøkt.
Heri er en in vitro-teknikk som involverer intakt nervevev som kan brukes til å belyse molekylære mekanismer som er involvert i celledød etter en eksitotoksiske eller ischemisk skade er beskrevet. Denne teknikken reduserer antall av dyr som kreves for å utføre et eksperiment, er reproduserbare, og genererer levedyktig vev som oppfører seg på en lignende måte til metabolsk større organotypic skiver. I tillegg, den nevrale kretser, cellulære interaksjoner, og postsynaptiske compartment fortsatt delvis intakt. Den fysiologiske buffer som brukes gjør at cellemembranene til 'reseal', og gjør cellene til å gjenopprette sin opprinnelige membran motstand ni. Denne hjernen skive modellen er i stand til å etterligne trofast responser observert etter eksitotoksisitet formidlet hjerneskader 10, og kan brukes til å undersøke de molekylære mekanismer som er involvert i slag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer er utført med godkjenning fra University of Newcastle Animal Care and Ethics Committee, samt i samsvar med de relevante retningslinjer og regelverk, herunder NSW forsøksdyrloven, NSW forsøksdyr forordning, og den australske anbefalingen for Stell og bruk av dyr for vitenskapelige formål.
En. Disseksjon av hjernevev
- Sacrifice tolv uker gamle hannrotter ved halshogging. Rotter kan enten bli ofret av fantastisk og halshogging, eller kan først bedøvet med isofluran (5% induksjon, 1,5-2% vedlikehold) i 70% N 2 og 30% O 2, og deretter halshugget.
- Fjern hjernen fra skallen så raskt som mulig (helst, dette bør utføres i mindre enn 2 min).
- Fjern cortex ved frihånd disseksjon. Disseksjonen bør utføres i minst mulig tid, med så lite skade på hjernen som mulig, slik som for å vedlikeholntain integriteten av sektorene.
- For å fjerne eventuelle gjenværende hud, pels, blod, etc., nedsenkes i hjernen i en liten mengde (3-5 ml) til 37 ° C Krebs-buffer (118 mM natriumklorid, 4,7 mM kaliumklorid, 1,3 mM kalsium-klorid, 1,2 mM kaliumdihydrogenfosfat, 1,2 mM magnesiumsulfat, 25 mM natriumhydrogen-karbonat, 11,7 mM glukose, 0,03 mM dinatrium-etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), ekvilibrert med 95% oksygen / 5% karbondioksid (carbogen), pH 7,4).
2. Utarbeidelse av Microslices
- Sett hjernen på scenen av en McIlwain chopper som to skiver av filterpapir har blitt plassert og fuktet med varmt Krebs buffer. Hold hjernen og filterpapir fuktet med varmt Krebs-buffer, men ikke så våt at det er fri væske på overflaten av papiret som kan føre til hjernen for å gli rundt.
- Skjær hjernen til 250 mikrometer koronale seksjoner. Som næringsstoffer, oksygen, og avfall thved normalt utveksles med blodtilførselen er byttet ut med et fluid som omgir vevet i isolerte neural vev, bør størrelsen av skivene ikke være mer enn 400 pm i tykkelse for å gi tilstrekkelig oksygen og næringsstoffer utveksling skal skje.
- Snu McIlwain scenen 90 °.
- Skjær hjerner til 250 mikrometer sagittal skiver. Heri er disse hjerneseksjoner (250 mikrometer x 250 mikrometer skiver av variabel lengde, avhengig av tykkelsen på vev) er omtalt som microslices.
- Plasser microslices inn i en rundbunnet rør med 10 til 15 ml 37 ° C Krebs-buffer (mengden av Krebs-buffer som anvendes vil avhenge av mengden av vev).
Tre. Ekvilibrering av Microslices
- Forsiktig agitere til individuelle microslices er suspendert, og deretter tillate dem å bosette seg under gravitasjon.
- Fjern forsiktig supernatant, som vil være regn på grunn av suspenderte cellerester, og tilsett 10 ml frisk 37 ° CKrebs buffer til røret.
- Gjenta denne vaskeprosedyre fire ganger, noe som vil resultere i fjerning av det meste av rusk.
- Etter dette likevekt de microslices ved 37 ° C med forsiktig risting / inversjon, og endre Krebs buffer hvert 15 min i 1 time totalt.
- På denne tiden, tilsett 2 ml frisk 37 ° C Krebs buffer, og overføre 15-20 microslices (150 mL av microslice suspensjon) til flat bunn polystyren 5 ml rør ved hjelp av en ekstra bred boring pipettespissen med glattet kanter (som kan være skapt av skjæring ~ 2 mm fra enden av en P1000 spissen). Spre microslices jevnt over bunnen av røret i et enkelt lag, slik at hvert microslice er ikke lenger enn noen få millimeter fra den oksygenatmosfære.
4. Eksitotoksiske Stimulering
- Inkuber microslices ved 37 ° C, og kontinuerlig passerer carbogen over overflaten av de 150 ul microslice suspensjon, ved hjelp av en gassledning som er stillinged like over overflaten av microslice suspensjon (for å unngå mekanisk forstyrrelse).
- Unn microslices med enten 150 mL 5 mM glutamat + 100 mikrometer glysin i Krebs buffer (eksitotoksiske stimulans: endelig konsentrasjon 2,5 mM glutamat + 50 mikrometer glysin) eller 150 mL Krebs buffer alene (kontrollere nonstimulated). En rekke stimuli kan anvendes på dette trinn (inkludert, men ikke begrenset til, AMPA NMDA + glycin, KCl depolarisering, og oksygen / glukosemangel).
- Fjern inkubasjonstiden løsning på ulike tidspunkter etter stimulering (0, 30, 60, 90, 120, og 300 sek), og erstatte den med 300 mL av iskald homogenisering buffer (30 mM Tris, pH 7,4, glykol 1 mM etylen tetraeddiksyre, 4 mM EDTA, 100 mM ammonium-molybdat, 5 mM natrium-pyrofosfat, 25 mM natriumfluorid, 1 mM natrium-orthovanadate, 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride, komplett protease-inhibitor cocktail).
- Homogen microslices på is, ved hjelp av et glass-Teflon Douce Homogenizer(20 slag, 700 rpm).
- Oppbevar homogenater ved -80 ° C, og forskjellige signalmolekyler, død molekyler, etc. kan måles ved western blot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microslices som genereres ved hjelp av denne fremgangsmåten, er levedyktig, og en rekke arter (for eksempel rotter, mus og kylling) kan brukes til å produsere microslices. Tre uavhengige målinger av levedyktighet er benyttet: respirasjonsfrekvens (figur 1), adenin-nukleotid forhold (figur 2), og vevet kaliuminnhold (figur 3). Ved hjelp av disse tiltak er det blitt demonstrert at microslices forblir levedyktige i minst 2 timer post-generasjonen.
Brain microslices kan brukes til å undersøke ulike signalmolekyler, etter en rekke stimuli (for eksempel KCl depolarisering [Figur 4] AMPA NMDA, glutamat stimulering 10), og kan også brukes til å sammenligne responsene til cellesignalmolekyler mellom flere områder av hjernen (Figur 4). I tillegg kan effekten av ulike inhibitorer / medikamentbehandlinger for disse molekylene også bli undersøkt (for eksempel kinase hemmere 10, glutamat reseptor agonister 11, quisqualic syre 12).
Figur 1. Respirasjonsmålinger av microslices fra kylling forhjerne De respirasjonsmålinger av hjernevev ble beregnet som følger:. Mengden av oksygen forbrukt (forskjellen mellom de oksygenelektrodemålinger ved begynnelsen og slutten av forsøket) multiplisert med antall mol oksygen i oppløsning, inndelt av inkubasjonstiden (timer), og mengden av protein (mg). Typiske respirasjonsmålinger av isolert pattedyr cerebral cortex er mellom 55-80 mikromol O 2 / g fersk vekt / t under vanlige betingelser ni. n = 9.
p_upload/51291/51291fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51291/51291fig2.jpg "/>
.. Figur 2. Forekomst av adenin nukleotider i microslices fra kylling forhjerne Representant HPLC spor måle ATP: ADP forholdstall, utført som tidligere beskrevet 13. Høy ATP og lave ADP nivåer er vanligvis finner i levende celler, mens redusert nivå av ATP og økte nivåer av ADP er karakteristisk for apoptotiske og nekrotiske celler 14. Typisk ATP: ADP-forhold av microslices variert 3:01 til 06:01, og ble opprettholdt ved dette nivået i mer enn 2 timer.
Figur 3. Tissue K + innhold av hjerne microslices fra umoden kylling forhjerne. Fastsettelsen av vev kalium er en osseful mål på levedyktighet, som mange av de kjemiske og fysiologiske aktiviteter av et vev er avhengig av membranpotensialet, noe som krever en normal intracellulær kaliuminnhold 9.. Når microslices ble vasket i K +-fri buffer umiddelbart etter kutting, ble vevet K + uttømt til et nivå som var like over bakgrunnen (tid 0). Imidlertid ved påfølgende inkubering med Krebs-buffer, den microslices hurtig akkumulert K + fra det omgivende medium, og i løpet av 5 min de hadde nådd en stabil tilstand nivå lik den for ubehandlede microslices (dvs. microslices vasket og inkubert i normal buffer). Tilsetningen av ouabain (0,2 mM) og EGTA (2 mM) etter 20 min inkubering førte tissue K +-innhold til å avta til 0 i løpet av 8 min. Dette viser at de microslices normalt aktivt pumpe K +, og at vevet K + nivåer er ikke på grunn av K + fanget i dødt vev eller mellomrommene. n = 4.
Figur 4. Tid løpet av GluN2B og GluA1 fosforylering etter depolarisering med KCl Microslices ble generert fra striatum og sensoriske cortex hos hannrotter (n = 8), depolarized ved hjelp av høy K + Krebs Buffer, homogenisert, og undersøkt for (A) GluN2B. fosforylering (på Ser1303) og (B) GluA1 fosforylering (på Ser845) av western blotting på ulike tidspunkter etter stimulering (0-300 sek). Fosforylering nivåene er normalisert til total GluN2B og GluA1 uttrykk (dvs. fosforylering / total uttrykk). * Angir statistisk signifikant sammenheng mellom hjerneregioner (p <0,05). Depolarisering med KCl resulterte i fosforylering av GluN2B og GluA1 reseptorer på S1303 ogS845, henholdsvis. Satsen for GluN2B fosforylering på S1303 variert mellom cortex og striatum, mens frekvensen av GluA1 fosforylering på S845 var den samme i cortex og striatum. I senere eksperimenter, har vi vist at dette skyldes forskjells regulering av multifunksjonelle kinase, kalsium / calmodulin-stimulert protein kinase II (CaMKII), som phosphorylates GluN2B på S1303, men ikke GluA1 på S845 10. Klikk her for å se større bilde .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heri er en in vitro-teknikk for generering av microslices som kan brukes for å undersøke de molekylære mekanismer som er involvert i eksitotoksisitet og iskemi-mediert celledød i intakt moden hjernevevet beskrevet. Denne teknikken gir levedyktig vev (figur 1-3), som er metabolsk lik større organotypic skiver 15. Videre denne microslice modellen samsvarer godt med responsen observert etter excitotoxicity mediert hjerneskader i vivo 10. En 90 andre in vitro-stimulus av hjerne microslices med AMPA NMDA eller glutamat induserer de samme responser i forskjellige molekyler (f.eks CaMKII, GluN2B og GluA1) som en 90 sekunders periode med okklusjon in vivo 10. Dette gir ytterligere bekreftelse på at den microslice modellen beskrevet heri er en gyldig metode som kan anvendes for å undersøke de molekylære mekanismer som er involvert i ischemi og eksitotoksiskefukt-mediert celledød.
Som med en hvilken som helst eksperimentell teknikk, kan denne fremgangsmåten kan varieres, og disse variasjonene kan eller ikke kan påvirke utfallet eksperimentelt. Basert på erfaring, protokollen beskrevet her representerer de optimale forhold for å generere den høyeste vev yield og microslice levedyktighet. Denne protokollen kan tilpasses for bruk i forskjellige arter (microslices fra rotter, mus og kylling har tidligere blitt generert), og fra en hvilken som helst hjerneregion (figurene 1-3 fremstiller microslices avledet fra hel forhjerne, Fig. 4 viser microslices avledet fra cortex og striatum). I tillegg kan microslice tykkelse endres 150-350 mikrometer, uten noe vesentlig tap i levedyktighet av skiver. Den optimale skivetykkelse er 250 mikrometer, da dette gir det høyeste utbytte av vev, og mer reproduserbar sampling enn for større stykker. Den statistisk sampling av hjernevev som produseres avde alikvoter av microslices må være representative for vev fra hvilke skivene ble fremstilt. For å gjøre dette, må vi bruke de minste størrelse stykker per porsjon for å sikre et representativt utvalg av vevet. De optimale betingelser for denne ble funnet å være 250 mikrometer tykkelse, og 1 mg av vev-protein, noe som tilsvarer 15 til 20 ~ skiver / aliquot. Den temperatur ved hvilken microslices bør hakket og vasket ble undersøkt ved å sammenligne respirasjonsmålinger av microslices generert med og uten avkjøling til 4 ° C. Selv om effektene av acidose og anoksi kan reduseres når vev er plassert ved 4 ° C, kan microtubule remontering endres hvis vevet er kjølt og deretter rewarmed 16.. Denne omorganiseringen av cytoskjelettet kan påvirke den funksjonelle aktiviteten av celler i en viss periode etter oppvarming. Noncooled microslices har en høyere levedyktighet og lufthastighet i forhold til avkjølte skiver. Videre tre vasker (trinn 3,1-3,3) er tilstrekketilstrekkelig til å fjerne det meste av rusk. Den likevekt (trinn 3.4) med periodiske endringer i buffer tillater microslices å "gjenopprette" fra kutting, og forbedrer reproduserbarhet i forskjellige funksjonelle analyser (for eksempel kalsium-akkumulering).
Fremgangsmåten er egnet for å undersøke effekten etter en rekke stimuli, og etter behandling med narkotika / inhibitorer. Ethvert stoff / inhibitor som er permeabel membran har potensiale til å bli undersøkt via denne teknikken, og en hvilken som helst molekyl som kan bli detektert via Western blot (eller lignende) kan undersøkes.
I sammendraget, manipulering av signalanlegg kaskader involvert i excitotoxicity og iskemi-mediert celledød tilby en attraktiv tilnærming for utvikling av legemidler som begrenser neuronal celledød etter hjerneslag. Den beskrevne microslice metoden er en lett anvendelig modell som gjør at etterforskningen av disse signal kaskader i intakt moden hjernevev. Denne teknikken kan brukes til å hjelpe med å identifisere nye behandlinger som begrenser neuronal celledød etter hjerneslag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen interessekonflikt om noe av arbeidet gjennomført innenfor dette manuskriptet.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler fra National Health and Medical Research Council of Australia, Hunter Medical Research Institute og University of Newcastle.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guillotine | Used to decapitate animal | ||
| Surgical equipment | Forceps, scissors, tweezers, etc., for brain removal and dissection | ||
| McIlwain chopper | McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella. | Used to generate 100-400 µm brain sections. | |
| Round bottom plastic tubes | Greiner | ||
| Water bath | For keeping tissue at 37 °C | ||
| Humidifier/aerating apparatus | Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment | ||
| Flat bottomed polystyrene tubes | Nunc | ||
| Dounce Homogenizer |
References
- Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. Mechanisms, challenges and opportunities in stroke. Nat. Rev. Neurosci. 4, 399-415 (2003).
- Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death. Apoptosis. 15, 1382-1402 (2010).
- Vogt Weisenhorn, D. M., Roback, L. J., Kwon, J. H., Wainer, B. H. Coupling of cAMP/PKA and MAPK signaling in neuronal cells is dependent on developmental stage. Exp. Neurol. 169 (1), 44-55 (2001).
- Kharlamov, E., Cagnoli, C. M., Atabay, C., Ikonomovic, S., Grayson, D. R., Manev, H. Opposite effect of protein synthesis inhibitors on potassium deficiency-induced apoptotic cell death in immature and mature neuronal cultures. J. Neurochem. 65 (3), 1395-1398 (1995).
- Kristensen, B. W., Noraberg, J. Comparison of excitotoxic profiles of ATPA, AMPA, KA and NMDA in organotypic hippocampal slice cultures. Brain Res. 917 (1), 21-44 (2001).
- Lecrux, C., et al. Spontaneously hypertensive rats are highly vulnerable to AMPA-induced brain lesions. Stroke. 38, 3007-3015 (2007).
- Sattler, R., Charlton, M. P., Hafner, M., Tymianski, M. Distinct influx pathways, not calcium load, determine neuronal vulnerability to calcium neurotoxicity. J. Neurochem. 71, 2349-2364 (1998).
- Morrison, B. 3rd, Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. In vitro central nervous system models of mechanically induced trauma: a review. J. Neurotrauma. 15, 911-928 (1998).
- McIlwain, H.
- Skelding, K. A., Spratt, N. J., Fluechter, L., Dickson, P. W., Rostas, J. A. alpha CaMKII is differentially regulated in brain regions that exhibit differing sensitivities to ischemia and excitotoxicity. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (12), 2181-2192 (2012).
- Kavanagh, J. M., Dodd, P. R., Rostas, J. A. 3H]MK-801 binding in immature and mature chicken forebrain. Neurosci. Lett. 134 (1), 83-87 (1991).
- Kavanagh, J. M., Bunn, S. J., Boyd, T. L., Rostas, J. A. Developmental changes in glutamate receptor stimulated inositol phospholipid metabolism and 45Ca(2+)-accumulation in posthatch chicken forebrain. Neurosci. Lett. 194 (3), 161-164 (1995).
- Sharps, E. S., McCarl, R. L. A high performance liquid chromatographic method to measure 32P incorporation into phosphorylated metabolites in cultured cells. Anal. Biochem. 124, 421-424 (1982).
- Bradbury, D. A., Simmons, T. D., Slater, K. J., Crouch, S. P. M. Measurment of the ADP:ATP ratio in human leukaemic cell lines can be used as an indicator of cell viability, necrosis and apoptosis. J. Immunol. Methods. 240 (1-2), 1-2 (2000).
- Rodnight, R., McIlwain, H. Techniques in tissue metabolism: 3. Study of tissue fragments with little or no added aqueous phase, and in oils. Biochem. J. 57, 649-661 (1954).
- Shelanski, M. L., Gaskin, F., Cantor, C. R. Microtubule assembly in the absence of added nucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70 (3), 765-768 (1973).
