Summary
פיתחנו מודל פרוסת מוח שבו ניתן להשתמש כדי לבחון מנגנונים מולקולריים מעורבים בפגיעה במוח בתיווך הפעלת יתר רעילה. טכניקה זו יוצרת רקמת מוח בוגרת קיימא ומפחיתה את המספרים של בעלי חיים הנדרשים לניסויים, תוך שמירה על המעגלים עצביים, אינטראקציות הסלולר, ותאי postsynaptic שלמים בחלקו.
Abstract
בחינת מנגנונים מולקולריים מעורבים בתנאי נוירו, כגון שבץ איסכמי, יכול להיות קשה בעת שימוש במערכות של בעלי חיים כולה. ככזה, ראשוני או מערכות 'דמויות עצביות "תא התרבות נמצאת בשימוש נרחב. בעוד שמערכות אלה קלות יחסית לעבוד איתו, ומערכות שימושיות מודל שבו תוצאות שונות תפקודיות (כגון מוות של תאים) ניתן לכמת בקלות, את התוצאות הנבחנות ומסלולים בנוירונים בוגרים בתרבית (כגון מסלולי מוות של תאים בתיווך הפעלת יתר רעילה) אינם בהכרח זהים לאלו שנצפו במוח בוגר, או ברקמה שלמה. לכן, יש הצורך לפתח מודלים שבו ניתן לבחון את המנגנונים תאיים ברקמה עצבית בוגרת. פיתחנו טכניקה במבחנה שיכול לשמש כדי לחקור מגוון רחב של מסלולים מולקולריים ברקמת עצבים בשלמותה. הטכניקה המתוארת במסמך זה מנצלת רקמת קליפת המוח חולדה, אך טכניקה זו יכולה להיות מותאמת לשימוש רקמהממגוון רחב של מינים (כגון עכבר, ארנב, שפן ניסיונות, ועוף) או אזורים במוח (למשל, ההיפוקמפוס, סטריאטום, וכו '). בנוסף, מגוון רחב של גירויים / טיפולים יכול לשמש (לדוגמא, הפעלת יתר רעיל, ממשל של מעכבים, וכו '). לסיכום, מודל פרוסת המוח שתואר במסמך זה יכול לשמש כדי לבחון מגוון של מנגנונים מולקולריים המעורבים בפגיעה במוח בתיווך הפעלת יתר רעילה.
Introduction
הצורה הנפוצה ביותר של שבץ היא שבץ איסכמי, אשר מתרחש כאשר כלי דם במוח הופך להיות חסומים. איסכמיה הרקמות שתוצאה מהפסקת זרימת דם גורמת לשלילת קוטביות נרחבת של ממברנות, שחרור שליחים עצביים מעוררים, והעלאה מתמשכת של סידן תוך תאי, מה שמוביל להפעלה של מוות של תאי מסלולי 1. תהליך זה זכה לכינוי 'הפעלת יתר רעילה', והוא מסלול משותף מעורב במוות עצבי המיוצר על ידי מגוון רחב של פתולוגיות, כולל שבץ 2. עיכוב של מסלולי האיתות מעורבים בהפעלת יתר רעילה ומפלי מוות של תאים עצביים אחרים הוא גישה מושכת להגביל את הנזק עצבי בעקבות שבץ מוחי.
זיהוי המנגנונים המולקולריים המדויקים מעורבים בהפעלת יתר רעילה ושבץ איסכמי יכול להיות קשה בעת שימוש במערכות של בעלי חיים כולה. ככזה עוברית ראשונית, ו( למשל neuroblasto 'כמו עצבי-'קווים הונצחו ma ואדנוקרצינומה) מערכות תרבית תאים משמשים לעתים קרובות. היתרונות העיקריים של הדגמים האלה הם שהם קלים לתפעול, יחסית חסכוני, ומוות של תאים ניתן למדוד בקלות ונרשמת. עם זאת, ניתן לשנות מסלולי איתות על ידי תנאי culturing משמשים 3,4, ונוירונים בוגרים והנציחו קווים יכולים לבטא קולטנים שונים ומולקולות איתות בהשוואה להבשיל מוח 5-8. יתר על כן, נוירונים בתרבית רק לאפשר הבדיקה של סוג תא אחד (או שתיים, אם נעשה שימוש במערכת coculture), ואילו רקמות מוח שלמות היא הטרוגנית, המכילות מגוון של סוגי תאים הפועלים באינטראקציה אחד עם השני. מערכות פורסים תרבות Organotypic (explants הדק של רקמת המוח) משמשות גם, ומודלים אלה מאפשרים מחקר של אוכלוסיות הטרוגניות של תאים כפי שהם נמצאים בגוף חי. עם זאת, ניתן להשיג רק כמות מוגבלת של רקמות מכל בעל חיים בעת שימוש בטכניקה זו, פרוסות יכולותלא להיות מתורבת במשך זמן רב ככל שורות תאים הונצחו, ובינוני לתרבות לטווח הארוך יכול לגרום לשינויים במסלולי איתות וקולטנים בפרוסות. בעוד מוח בוגר יכול לשמש כדי ליצור פרוסות organotypic, פרוסות מהמוח בוגר הן נוחות יותר לתרבות, ויותר מנוצלים בדרך כלל. אין אפוא הצורך לפתח מודלים אשר לחקות או לייצג את המוח שלם בוגר, שהם קלים לשימוש, שבו ניתן לבחון את מסלולי איתות עצביים.
בזאת, חוץ גופית בטכניקה מעורבת ברקמת עצבים בשלמותה, שניתן להשתמש על מנת להבהיר את המנגנונים מולקולריים המעורבים במותם של תאים הבאים עלבון הפעלת יתר רעיל או איסכמי מתוארת. טכניקה זו מפחיתה את מספר בעלי החיים הנדרשים לביצוע ניסוי, הוא לשחזור, ויוצרת רקמת קיימא שמתנהגת בצורה מטבולית דומה לפרוסות organotypic גדולות יותר. בנוסף, המעגלים עצביים, אינטראקציות הסלולר, ושיתוף postsynapticmpartment נותר בשלמותה בחלקו. החיץ הפיזיולוגי המשמש מאפשר קרום התא ל'reseal ', ומאפשר לתאים להתאושש התנגדות הקרום המקורית שלהם 9. מודל פרוסת מוח זה מסוגל לחקות בנאמנות תגובות שנצפו בעקבות ניזק מוחי הפעלת יתר רעילה בתיווך 10, וניתן להשתמש בם כדי לבחון את המנגנונים המולקולריים מעורבים בשבץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים מתבצעים באישור מאוניברסיטת ניוקאסל טיפול בבעלי חיים ובועדת אתיקה, וכן בהתאם להנחיות ותקנות הרלוונטיות, ובכלל זה NSW מחקר בבעלי חיים החוק, NSW בעלי החיים תקנה המחקר, והקוד האוסטרלי של תרגול עבור טיפול ושימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות.
1. Dissection של רקמת המוח
- להקריב את חולדות זכרי שנים עשר בן שבוע על ידי עריפת ראש. יכולות להיות שהקריבו את חולדות על ידי מדהים ועריפת ראש, או יכולות להיות מורדמת ראשון עם isoflurane (אינדוקציה 5%, תחזוקת 1.5-2%) ב70% N 2 ו30% O 2, ולאחר מכן ערפו את הראש.
- הסר את המוח מהגולגולת במהירות אפשרית (באופן אידיאלי, זה צריך להתבצע בפחות מ -2 דקות).
- הסר את קליפת המוח על ידי ביד חופשית לנתיחה. הנתיחה צריכה להתבצע במינימום הזמן האפשרי, עם נזק מועט כלמוח ככל האפשר כדי Maintain היושרה של הפרוסות.
- על מנת להסיר את כל עור שיורית, פרווה, דם, וכו ', לטבול את המוח בכמות קטנה (3-5 מיליליטר) של 37 ° C חיץ קרבס (118 כלוריד מ"מ נתרן, אשלגן כלורי 4.7 מ"מ, סידן כלורי 1.3 מ"מ, פוספט 1.2 מ"מ אשלגן dihydrogen, מגנזיום סולפט 1.2 מ"מ, פחמה נתרן מימן 25 מ"מ, 11.7 גלוקוז מ"מ, 0.03 חומצת disodium מ"מ ethylenediaminetetraacetic (EDTA), מתאזן עם חמצן 95% / 5% פחמן דו חמצני (carbogen), pH 7.4).
2. הכנת Microslices
- מניחים את המוח על הבמה של מסוק McIlwain שבשני פרוסות של נייר סינון הוצבו והרטיבו עם חיץ קרבס חם. שמור על המוח ונייר סינון טבול בחיץ קרבס חם, אבל לא כל כך רטוב שיש נוזל חופשי על פני השטח של הנייר שיכול לגרום למוח כדי להחליק בסביבה.
- פורסים את המוח ל250 מיקרומטר סעיפי העטרה. כמו חומרים מזינים, חמצן וחומרי פסולת הבדרך כלל החליף עם אספקת הדם הם החליפו עם נוזל המקיף את הרקמה ברקמה עצבית מבודדת, בגודל של פרוסות לא צריך להיות יותר מ -400 מיקרומטר בעובי כדי לאפשר חילופי חמצון וחומרים מזינים מספיק כדי להתעורר.
- הפעל את הבמה McIlwain 90 מעלות.
- פורסים את המוח לפרוסות 250 מיקרומטר sagittal. בזאת, חלקים במוח אלה (250 מיקרומטר x 250 מיקרומטר פרוסות באורך משתנה בהתאם לעובי של הרקמה) מכונים microslices.
- הנח את microslices לתוך צינור תחתון עגול עם 10-15 מיליליטר 37 ° C חיץ קרבס (הסכום של חיץ קרבס שימוש יהיה תלוי בכמות הרקמה).
3. איזון של Microslices
- בעדינות להתסיס עד microslices הבודד מושעים, ולאחר מכן לאפשר להם להתיישב תחת כובד.
- מוציא בזהירות את supernatant, אשר יהיה מעונן בשל פסולת תא מושעה, ולהוסיף 10 מיליליטר הטרי 37 מעלות צלזיוסקרבס חיץ לצינור.
- חזור על תהליך שטיפה זו ארבע פעמים, מה שיגרום להסרה של רוב הפסולת.
- בעקבות זאת, לאזן microslices על 37 מעלות צלזיוס עם רעד / היפוך עדין, ולשנות את קרבס חיץ כל 15 דקות לשעה 1 בסך הכל.
- בשלב זה, להוסיף 2 מיליליטר חיץ 37 מעלות צלזיוס קרבס טרי, ולהעביר 15-20 microslices (150 μl של ההשעיה microslice) לקלקר תחתית שטוח 5 מיליליטר צינורות באמצעות פיפטה קצה נוסף רחב לשעמם עם קצוות מוחלקים (שניתן ליצור על ידי חיתוך ~ 2 מ"מ מהקצה של קצה P1000). מורחים את microslices באופן שווה על הבסיס של הצינור בשכבה אחת, כך שכל microslice הוא לא יותר מאשר כמה מילימטרים מהאווירה מחומצן.
4. גירוי יתר רעיל
- דגירה microslices על 37 מעלות צלזיוס, ועובר ללא הרף carbogen על פני השטח של ההשעיה 150 microslice μl, תוך שימוש בקו גז שהוא עמדהאד רק מעל פני השטח של ההשעיה microslice (כדי למנוע הפרעה מכאנית).
- פנק microslices עם או 150 μl 5 גלוטמט מ"מ + 100 מיקרומטר גליצין בחיץ קרבס (גירוי יתר רעיל: ריכוז סופי גלוטמט + 50 מיקרומטר גליצין 2.5 מ"מ) או 150 חיץ קרבס μl לבד (לשלוט nonstimulated). מגוון רחב של גירויים יכול לשמש בשלב זה (לרבות, אך לא רק, AMPA, NMDA + גליצין, שלילת קוטביות KCl, ומחסור בחמצן / גלוקוז).
- הסר את פתרון הדגירה בזמנים שונים לאחר הגירוי (0, 30, 60, 90, 120, ו300 שניות), ולהחליף אותו עם 300 μl של חיץ המגון קר כקרח (30 מ"מ טריס, 7.4, אתילן גליקול 1 מ"מ pH חומצת tetraacetic, 4 mM EDTA, 100 molybdate מיקרומטר אמוניום, pyrophosphate נתרן 5 מ"מ, פלואוריד הנתרן 25 מ"מ, orthovanadate נתרן 1 מ"מ, phenylmethanesulfonylfluoride 1 מ"מ, מעכבי פרוטאז קוקטייל מלא).
- Homogenize microslices על קרח, תוך שימוש בזכוכית טפלון Dounce Homogenizer(20 משיכות; 700 סל"ד).
- homogenates החנות ב -80 מעלות צלזיוס, ומולקולות איתות שונות, מולקולות מוות, וכו 'ניתן למדוד על ידי כתם מערבי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microslices שנוצר באמצעות הליך זה הוא בר קיימא, ומגוון רחב של מינים (לדוגמא, חולדה, עכבר, ועוף) יכולים לשמש לייצור microslices. שלושה צעדים עצמאיים של כדאיות כבר נוצלו: קצב נשימה (איור 1), יחסי נוקלאוטיד אדנין (איור 2), ותוכן אשלגן רקמות (איור 3). שימוש באמצעים אלה, זה כבר הוכיח כי microslices להישאר קיימא לפחות 2 שעות שלאחר דור.
microslices המוח יכול לשמש כדי לבחון מולקולות איתות שונות, הבא במגוון של גירויים (למשל שלילת קוטביות KCl [איור 4], AMPA, NMDA, גלוטמט גירוי 10), והוא יכול לשמש גם כדי להשוות את תגובות של מולקולות איתות תא בין אזורים במוח המרובים (איור 4). בנוסף, ההשפעה של טיפולי מעכבים / תרופות שונות על מולקולות אלה יכולה גם להיבחן (כגון קינאז מעכבים 10, אגוניסטים גלוטמט רצפטור 11, חומצת quisqualic 12).
איור 1. שיעורי נשימה של microslices מהמוח קדמי עוף שיעורי הנשימה של רקמת המוח חושבו באופן הבא:. כמות החמצן הנצרכת (ההפרש בין קריאות האלקטרודה חמצן בתחילת וסוף הניסוי) מוכפל בשומות של חמצן בתמיסה, מחולק בזמן הדגירה (שעות) וכמות החלבון (מ"ג). שיעורי נשימה אופייניים של קליפת מוח של יונקים המבודדים הם בין 55-80 O μmol שעה / 2 / g טרי WT בתנאים רגילים 9. n = 9.
"Src =" p_upload/51291/51291fig2highres.jpg / files/ftp_upload/51291/51291fig2.jpg "/>
.. איור 2 נוכחות של נוקלאוטידים אדנין בmicroslices מהמוח קדמי עוף עקבות נציג HPLC מדידת ה-ATP: יחסי ADP, בוצעו כפי שתוארו 13 בעבר. ה-ATP גבוה ורמות נמוכות ADP נמצאים בדרך כלל בתאי קיימא, ואילו הירידה ברמות של ה-ATP ורמות גבוהות של ADP אופייניים לתאים אפופטוטיים ונימקים 14. ATP אופייני: יחסי ADP של microslices מגוון 3:01-06:01, ונשמרו ברמות האלה ליותר משעה 2.
איור 3. K רקמות + תוכן של microslices המוח ממוח קדמי עוף לא בוגר. הנחישות של אשלגן רקמה היאמדד eful של כדאיות, כפי שרבים מן כימי ופעילות פיזיולוגית של רקמות תלויים פוטנציאל הממברנה, אשר דורש תוכן אשלגן תאיים רגיל 9. כאשר microslices נשטף בK חיץ + ללא מייד לאחר הקיצוץ, רקמת K + היה מדולדל לרמות שהיו בדיוק מעל הרקע (זמן 0). עם זאת, בדגירה לאחר מכן עם חיץ קרבס, microslices במהירות שנצבר K + מסביב המדיום, ותוך 5 דקות הם הגיעו לרמת מצב יציבה דומה לזה לmicroslices שלא טופל (כלומר microslices שטף וטופחו בחיץ רגיל). התוספת של ouabain (0.2 מ"מ) וEGTA (2 מ"מ) לאחר דגירה 20 דקות גרמה K + תוכן רקמה לרדת ל 0 בתוך 8 דקות. זה מוכיח כי microslices בדרך כלל באופן פעיל לשאוב K +, וכי K + רמות רקמות אינן בשל K + לכודים ברקמה מתה או חללי ביניים. n = 4.
איור 4. כמובן זמן של זירחון GluN2B וGluA1 הבא שלילת קוטביות עם KCl. Microslices נוצרו מהסטריאטום וחושי קליפת המוח של חולדות זכרים (n = 8), depolarized באמצעות גבוה K קרבס הצפת, הומוגני +, ובדק עבור () GluN2B זרחון (בSer1303) וזרחון (ב ') GluA1 (בSer845) על ידי מערבי סופג בזמנים שונים לאחר גירוי (שניות 0-300). רמות זירחון הן מנורמלות לGluN2B המוחלט וביטוי GluA1 (כלומר זירחון / ביטוי סך הכל). * מציין מובהק סטטיסטי בין אזורים במוח (p <0.05). שלילת קוטביות עם KCl הביאה לזרחון של הקולטנים GluN2B וGluA1 בS1303 וS845, בהתאמה. השיעור של זירחון GluN2B בS1303 נע בין קליפת המוח וסטריאטום, ואילו השיעור של זירחון GluA1 בS845 היה זהה בקליפת המוח וסטריאטום. בניסויים הבאים, שהראינו שזה נובע דיפרנציאלי רגולציה של קינאז רב תכליתי, סידן / calmodulin מגורה החלבון קינאז II (CaMKII), אשר phosphorylates GluN2B בS1303, אבל לא GluA1 בS845 10. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בזאת, טכניקה חוץ גופית בעבור הדור של microslices שיכול לשמש כדי לבחון את המנגנונים המולקולריים מעורבים בהפעלת יתר רעילה ומוות של תאים בתיווך איסכמיה ברקמת מוח בוגרת בשלמותה הוא תאר. טכניקה זו מייצרת רקמת קיימא (איורים 1-3), שהיא מטבולית דומה לפרוסות organotypic גדולות 15. יתר על כן, מודל microslice מתאים מאוד לתגובה שנצפתה בעקבות ניזק מוחי הפעלת יתר רעילה בתיווך in vivo 10. שני 90 בגירוי מבחנה של microslices המוח עם AMPA, NMDA, או גלוטמט גורם אותן התשובות במגוון רחב של מולקולות (למשל CaMKII, GluN2B, וGluA1) כתקופה שנייה 90 של חסימת in vivo 10. זה מספק הוכחה נוספת כי מודל microslice המתואר כאן הוא שיטה חוקית שניתן להשתמש בם כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המעורבים באיסכמיה והפעלת יתר רעילity בתיווך המוות של תאים.
כמו עם כל טכניקה ניסיונית, יכול להיות מגוון הליך זה, ווריאציות אלה עשויות או לא עשויות להשפיע על תוצאות ניסוי. בהתבסס על ניסיון, הפרוטוקול המפורטים כאן מייצג את התנאים אופטימליים ליצירת רקמת התשואה הגבוהה ביותר וכדאיות microslice. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לשימוש במגוון מינים (microslices מן החולדות, עכברים, ותרנגולות בעבר נוצר בהצלחה), ומכל אזור במוח (איורים 1-3 מתארים microslices נגזר מכל מוח קדמי; איור 4 מתאר microslices נגזר מקליפה והסטריאטום). בנוסף, עובי microslice ניתן לשנות 150-350 מיקרומטר, ללא כל הפסד ניכר ביכולת קיום של הפרוסות. העובי פרוס האופטימלי הוא 250 מיקרומטר, כמו זה מייצר התשואה הכי גבוהה של רקמה, ודגימה לשחזור יותר מאשר לפרוסות גדולות יותר. הדגימה הסטטיסטית של רקמת מוח המיוצרת על ידיaliquots של microslices צריך להיות נציג של הרקמה ממנו את הפרוסות היו מוכנות. כדי לעשות זאת, עלינו להשתמש בפרוסות בגודל הקטנות ביותר לaliquot כדי להבטיח מדגם מייצג של הרקמות. התנאים אופטימליים לזה נמצאו 250 עובי מיקרומטר ו1 מ"ג חלבון רקמות, אשר תואם ~ 15-20 פרוסות / aliquot של. הטמפרטורה שבה צריכה להיות קצוצה microslices ורחץ נחקרה על ידי השוואת שיעורי הנשימה של microslices שנוצר עם וללא קירור עד 4 ° C. על אף שההשפעות של חמצת ואנוקסיה עשויות להיות מופחתות כאשר הרקמה ממוקמת ב 4 ° C, ניתן לשנות והרכבה מחדש microtubule אם הרקמה היא מקוררת ולאחר מכן מחממת מחדש 16. ארגון מחדש זה של שלד התא עשוי להשפיע על הפעילות התפקודית של תאים עבור חלק מהתקופה שלאחר ההתחממות. יש לי microslices Noncooled כדאיות גבוהה יותר וקצב נשימה בהשוואה לפרוסות התקררו. יתר על כן, שלושה שוטף (שלבים 3.1-3.3) הוא sufficient להסיר את רוב הפסולת. תקופת האיזון (שלב 3.4) עם שינויים תקופתיים במאגר מאפשרת microslices ל'להתאושש 'מקיצוץ, ומשפרת את שחזור במבחנים שונים תפקודיים (כגון הצטברות סידן).
השיטה מתאימה כדי לבחון את ההשפעות הבאות מגוון רחב של גירויים, ולאחר טיפול עם תרופות / מעכבים. יש לו כל תרופה / מעכב שהוא קרום חדיר הפוטנציאלי להיבחן באמצעות טכניקה זו, וכל מולקולה שניתן לאתר באמצעות כתם מערבי (או דומה) יכול להיחקר.
לסיכום, המניפולציה של איתות מפלים מעורבים בהפעלת יתר רעילה ומוות של תאים בתיווך איסכמיה מציעות גישה אטרקטיבית לפיתוח תרופות המגבילות את המוות של תאים עצביים בעקבות שבץ מוחי. שיטת microslice תיארה היא מודל ישים בקלות המאפשר החקירה של מפלי איתות אלה במוח הבוגר בשלמותהרקמות. טכניקה זו ניתן להשתמש כדי לסייע בזיהוי טיפולים חדשים המגבילים את המוות של תאים עצביים בעקבות שבץ מוחי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם ניגוד העניינים לגבי כל העבודה שנערכה בכתב היד הזה.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מחקר מהמועצה הלאומית לבריאות והמחקר הרפואי של אוסטרליה, האנטר מכון המחקר הרפואי, ואוניברסיטת ניוקאסל.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guillotine | Used to decapitate animal | ||
| Surgical equipment | Forceps, scissors, tweezers, etc., for brain removal and dissection | ||
| McIlwain chopper | McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella. | Used to generate 100-400 µm brain sections. | |
| Round bottom plastic tubes | Greiner | ||
| Water bath | For keeping tissue at 37 °C | ||
| Humidifier/aerating apparatus | Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment | ||
| Flat bottomed polystyrene tubes | Nunc | ||
| Dounce Homogenizer |
References
- Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. Mechanisms, challenges and opportunities in stroke. Nat. Rev. Neurosci. 4, 399-415 (2003).
- Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death. Apoptosis. 15, 1382-1402 (2010).
- Vogt Weisenhorn, D. M., Roback, L. J., Kwon, J. H., Wainer, B. H. Coupling of cAMP/PKA and MAPK signaling in neuronal cells is dependent on developmental stage. Exp. Neurol. 169 (1), 44-55 (2001).
- Kharlamov, E., Cagnoli, C. M., Atabay, C., Ikonomovic, S., Grayson, D. R., Manev, H. Opposite effect of protein synthesis inhibitors on potassium deficiency-induced apoptotic cell death in immature and mature neuronal cultures. J. Neurochem. 65 (3), 1395-1398 (1995).
- Kristensen, B. W., Noraberg, J. Comparison of excitotoxic profiles of ATPA, AMPA, KA and NMDA in organotypic hippocampal slice cultures. Brain Res. 917 (1), 21-44 (2001).
- Lecrux, C., et al. Spontaneously hypertensive rats are highly vulnerable to AMPA-induced brain lesions. Stroke. 38, 3007-3015 (2007).
- Sattler, R., Charlton, M. P., Hafner, M., Tymianski, M. Distinct influx pathways, not calcium load, determine neuronal vulnerability to calcium neurotoxicity. J. Neurochem. 71, 2349-2364 (1998).
- Morrison, B. 3rd, Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. In vitro central nervous system models of mechanically induced trauma: a review. J. Neurotrauma. 15, 911-928 (1998).
- McIlwain, H.
- Skelding, K. A., Spratt, N. J., Fluechter, L., Dickson, P. W., Rostas, J. A. alpha CaMKII is differentially regulated in brain regions that exhibit differing sensitivities to ischemia and excitotoxicity. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (12), 2181-2192 (2012).
- Kavanagh, J. M., Dodd, P. R., Rostas, J. A. 3H]MK-801 binding in immature and mature chicken forebrain. Neurosci. Lett. 134 (1), 83-87 (1991).
- Kavanagh, J. M., Bunn, S. J., Boyd, T. L., Rostas, J. A. Developmental changes in glutamate receptor stimulated inositol phospholipid metabolism and 45Ca(2+)-accumulation in posthatch chicken forebrain. Neurosci. Lett. 194 (3), 161-164 (1995).
- Sharps, E. S., McCarl, R. L. A high performance liquid chromatographic method to measure 32P incorporation into phosphorylated metabolites in cultured cells. Anal. Biochem. 124, 421-424 (1982).
- Bradbury, D. A., Simmons, T. D., Slater, K. J., Crouch, S. P. M. Measurment of the ADP:ATP ratio in human leukaemic cell lines can be used as an indicator of cell viability, necrosis and apoptosis. J. Immunol. Methods. 240 (1-2), 1-2 (2000).
- Rodnight, R., McIlwain, H. Techniques in tissue metabolism: 3. Study of tissue fragments with little or no added aqueous phase, and in oils. Biochem. J. 57, 649-661 (1954).
- Shelanski, M. L., Gaskin, F., Cantor, C. R. Microtubule assembly in the absence of added nucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70 (3), 765-768 (1973).
