Summary
우리는 흥분 독성 매개 성 뇌 손상에 관련된 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용될 수있는 뇌 슬라이스 모델을 개발 하였다. 이 기술은 실행 가능한 성숙한 뇌 조직을 생성하고, 부분적으로 손상 신경 회로, 세포 상호 작용과 시냅스 구획을 유지하면서, 실험에 필요한 동물의 수를 줄일 수 있습니다.
Abstract
전체 동물 체제를 사용하는 경우 허혈성 뇌졸중과 같은 신경 병리학 적 조건에 관련된 분자 메커니즘을, 검사, 어려울 수 있습니다. 예컨대, 기본 또는 '신경 조의'세포 배양 시스템은 일반적으로 이용된다. 이러한 시스템은 작동 비교적 용이하며, (예컨대 세포사와 같은) 다양한 기능적 결과를 쉽게 정량화 될 수있는 유용한 모델 시스템 (예 흥분 독성 - 매개 세포 사멸 경로 등) 배양 된 미숙 뉴런의 조사 결과와 경로이지만 반드시 성숙한 뇌에서 관찰 된 것과 같은, 또는 손상 조직에 없습니다. 따라서, 성숙한 신경 조직의 세포 메커니즘을 조사 할 수있는 모델을 개발할 필요가있다. 우리는 신경 조직 손상의 분자 경로의 다양성을 조사하기 위해 사용될 수있는 시험 관내 기술을 개발했다. 설명 된 기술은 본 명세서 쥐 대뇌 피질 조직을 활용하지만,이 기술은 조직을 사용하도록 구성 될 수있다또는 뇌 영역 (예를 들어, 해마, 선조체, 등) (예 : 마우스, 토끼, 기니 돼지, 닭 등) 종의 다양 한에서. 또한, 자극 / 치료의 다양한 (예를 들어, 흥분 독성, 억제제의 투여 등)을 사용할 수있다. 결론적으로, 본원에 기재된 뇌 슬라이스 모델 흥분 독성 매개 성 뇌 손상에 관련된 분자 메커니즘의 다양성을 조사 할 수있다.
Introduction
뇌졸중의 가장 일반적인 형태는 대뇌 혈관 폐색 될 때 발생하는 허혈성 뇌졸중이다. 혈액의 흐름 중단 한 결과 조직의 국소 빈혈은 세포막의 탈분극 확산, 흥분성 신경 전달 물질의 방출을 일으키고, 세포 죽음의 활성화에 이르게 세포 내 칼슘의 지속적인 상승은 1 경로. 이 과정은 '흥분 독성 (excitotoxicity)'라고하고, 스트로크 2 등의 병리의 다양한 의해 생성 된 신경 세포의 죽음에 관련된 일반적인 경로입니다되었습니다. 흥분 독성 및 다른 신경 세포 죽음의 계곡에 관련된 신호 전달 경로의 억제는 뇌졸중 다음 신경 세포의 손상을 제한 할 수있는 매력적인 방법입니다.
동물 전체 시스템을 사용할 때 흥분 독성 (excitotoxicity)과 허혈성 뇌졸중에 관련된 정확한 분자 메커니즘을 확인하는 것은 어려울 수 있습니다. 같은 차 배아와 '신경과 같은'(예를 들어 neuroblasto로엄마와 선암 불후의 선)는 세포 배양 시스템은 자주 사용된다. 이러한 모델의 주요 이점들은, 상대적으로 비용 효과적인 쉽게 조작 할 수 있으며 세포 사멸이 용이하고 정량 측정 할 수 있다는있다. 그러나, 신호 전달 경로는 배양 3,4를 사용 조건 및 미성숙 신경 세포에 의해 변경하고 선이 다른 수용체를 표현하고 뇌 5-8 성숙에 비해 신호 분자 수 불멸 할 수 있습니다. (공 배양 시스템이 사용되는 경우, 또는 2 개)의 손상 뇌 조직이 서로 상호 작용하는 다양한 종류의 세포를 함유하는 이종 반면 또한, 배양 된 신경 세포는 단지 하나의 세포 유형의 검사를 허용한다. Organotypic 슬라이스 배양 시스템 (뇌 조직의 얇은 절편)도 사용되며, 이들이 생체 내에서 발견되는 이러한 모델은 이종의 세포 집단의 연구를 허용한다. 이 기술을 사용하는 경우에는, 조직의 제한된 양 슬라이스는, 각각의 동물로부터 수득 할 수있다한 불후의 세포주로 배양 할, 장기 문화 매체는 슬라이스의 경로와 수용체 신호에 변화가 발생할 수 없습니다. 성숙한 두뇌의 Organotypic 조각을 생성하는 데 사용할 수있는 반면, 미성숙 뇌에서 슬라이스 문화에 더 많은 의무, 그리고 더 일반적으로 사용된다. 신경 신호 전달 경로를 검사 할 수있는 사용하기 쉬운 그대로 성숙한 뇌, 모방 또는 표현 모델을 개발하기 위해 필요하다.
여기서, 흥분 독성 또는 허혈성 모욕 다음 세포사에 관여 분자 메커니즘을 규명하는 데 사용할 수있는 손상 신경 조직을 포함하는 생체 외 기법을 설명한다. 이 기술은, 실험을 수행하는 데 필요한 동물의 수를 감소 재현이며, 더 큰 슬라이스의 Organotypic 대사 유사한 방식으로 동작 가능한 조직을 생성한다. 또한, 신경 회로, 셀룰러 상호 작용 및 시냅스 콜로라도mpartment 부분적으로 그대로 유지됩니다. 사용되는 생리 버퍼는 셀 '봉인'에 막, 그리고 수 세포가 원래의 막 저항 9를 복구 할 수 있습니다. 이 뇌 조각 모델을 충실하게 흥분 독성 매개 뇌 손상 10 다음 관찰 된 반응을 모방 할 수있다, 뇌졸중에 관련된 분자 메커니즘을 검사하는 데 사용할 수 있습니다.
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Protocol
모든 절차는 NSW 동물 연구 법, NSW 동물 연구 규정 및 대한 연습의 호주 코드를 포함하여 관련 지침 및 규정에 따라뿐만 아니라 뉴캐슬 대학의 동물 관리 및 윤리위원회에서 승인을 수행 관리 및 과학적인 목적을위한 동물의 사용.
1. 뇌 조직의 해부
- 잘린 십이주 된 수컷 쥐를 희생. 쥐도 근사하고 잘린 희생 할 수있다, 또는 최초의 이소 플루 란 (5 % 유도, 1.5 % 유지) 70 % N 2 30 %의 O 2 마취 할 수 있고, 그 목을 베.
- 가능한 빨리 두개골에서 뇌를 제거 (이상적으로,이보다 2 분에 수행해야합니다).
- 프리 핸드의 해부에 의해 피질을 제거합니다. 마이하도록 절개 가능한 뇌 적게 손상, 가능한 최단 시간 내에 수행되어야슬라이스의 무결성을 ntain.
- 잔류 피부를 제거하기 위해, 기타 퍼, 혈액,,, 37 ° C 크렙스 완충액 (118 mM 염화나트륨, 4.7 mM의 염화칼륨, 1.3 mM의 염화칼슘의 소량 (3-5 ml)에 뇌를 담가 1.2 ㎜의 인산이 수소 칼륨, 1.2 mM의 황산 마그네슘, 25 mM의 나트륨, 탄산 수소, 11.7 mM의 글루코오스, 0.03 mM의 디 나트륨 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)을 95 % 산소 / 5 % 이산화탄소 (carbogen)의 pH 7.4)로 평형화.
2. Microslices의 준비
- 여과지의 두 조각을 배치하고 따뜻한 크렙스 버퍼를 살짝 묻혀있다하는 맥일 웨인 헬기의 무대에서 뇌를 놓습니다. 두뇌와 따뜻한 크렙스 버퍼에 적신 여과지를 유지하지만 너무 젖은 뇌가 미끄러지지 않을 수 있습니다 종이의 표면에 액체가 무료입니다.
- 250 μm의 코로나 섹션으로 머리를 조각. 영양소, 산소 및 노폐물 th로일반적으로 혈액 공급이 절연 신경 조직에서 조직을 둘러싸는 유체 교환하여 교환에서, 슬라이스의 사이즈는 적절한 산소 및 영양소 교환이 발생할 수 있도록하는 두께로 400 μM이어야한다.
- 맥일 웨인 단계 90 ° 돌립니다.
- 250 μm의 시상 조각으로 머리를 조각. 여기서, 이러한 뇌 섹션 (가변 길이의 250 μM × 250 μm의 슬라이스 조직의 두께에 따라) microslices로 지칭된다.
- (사용 크렙스 버퍼의 양이 조직의 양에 따라 달라집니다) 15 ㎖를 37 ° C 크렙스 버퍼 둥근 바닥 튜브에 microslices를 놓습니다.
3. Microslices의 평형
- 부드럽게 개별 microslices가 일시 중단 될 때까지 교반 한 후 그 중력에서 해결 할 수 있습니다.
- 조심스럽게 인해 일시 중단 된 세포 파편에 흐린 될 상층 액을 제거하고 신선한 37 ° C 10 mL를 넣고크렙스는 튜브에 버퍼.
- 파편의 대부분 제거 될 것이다,이 세척 절차를 네 번 반복합니다.
- 이 후, 부드러운 흔들림 / 반전으로 37 ° C에서 microslices을 평형 및 크렙스는 총 1 시간 동안 매 15 분을 버퍼로 변경합니다.
- 이 때, 2 ML 신선한 37 ° C 크렙스 버퍼를 추가하고 평평한 바닥 폴리스티렌 15-20 microslices (microslice 현탁액 150 μL)를 전송하여 만들 수 있습니다 부드럽게 가장자리 (과 여분의 넓은 구멍 피펫 팁을 사용하여 5 ㎖ 튜브 P1000 팁의 끝에서 1 ~ 2 mm 절삭). 각 microslice가 산소 분위기에서 몇 밀리미터보다 더되지 않도록, 단층의 튜브의 기부에 균일 microslices 스프레드.
4. 흥분 독성 자극
- 37 ° C에서 microslices을 품어, 지속적으로 위치하는 가스 라인을 사용하여 150 μL의 microslice 서스펜션의 표면에 carbogen 전달다만 microslice 서스펜션 (기계 혼란을 피하기 위해)의 표면 위에 에드.
- (: 최종 농도 2.5 mM의 글루타민산 염 + 50 μM 글리신 흥분 독성 자극) 또는 단독으로 150 μL 크렙스 버퍼 (nonstimulated를 제어) 150 ㎕의 5 mM의 글루타민산 염 + 100 크렙스 버퍼 μM 글리신과 microslices을 처리합니다. 다양한 자극이 단계에서 사용될 수있다 (를 포함 하나 이에 국한되지 않는 AMPA, NMDA + 글리신, 탈분극의 KCl, 및 산소 / 글루코스 부족).
- 여러 번 후 자극 (0, 30, 60, 90, 120, 300 초)에서 배양 용액을 제거하고 얼음처럼 차가운 균질화 버퍼 (30 MM 트리스, 산도 7.4, 1 ㎜의 에틸렌 글리콜의 300 μL로 교체 디아민 테트라 아세트산, 4 mM의 EDTA, 100 μM 몰리브덴 산 암모늄, 5 mM의 나트륨 피로 포스페이트, 25 mM의 불소화 나트륨, 1 mM의 나트륨 오르토 바나 데이트, 1 밀리미터 phenylmethanesulfonylfluoride 완전 프로테아제 억제제 칵테일).
- 유리 테플론 다운스 균질화를 사용하여 얼음에 microslices 균질화(20 스트로크, 700 RPM).
- 등 -80 ° C 및 다양한 신호 분자, 죽음 분자에 보관 균질 서양 얼룩에 의해 측정 할 수있다.
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Representative Results
이 절차를 사용하여 생성 Microslices가 실용적이며, 종의 다양성 (예를 들어, 래트, 마우스, 닭) microslices을 생성하기 위하여 사용될 수있다. 생존의 세 가지 독립적 인 조치를 활용 한 : 호흡 속도 (그림 1), 아데닌 뉴클레오티드 비율 (그림 2), 및 조직의 칼륨 함량 (그림 3). 이러한 방법을 사용하면, microslices 적어도 2 시간 후 생성을 위해 실행 가능한 남아 있다고 입증되었다.
뇌 microslices는 다양한 자극에 따라 다양한 신호 전달 분자를 조사하는데 사용될 수있다 (예 KCl을 탈분극 [도 4], AMPA는 NMDA 글루타메이트 자극 (10)), 또한 여러 뇌 영역 간의 세포 신호 전달 분자의 반응을 비교하기 위하여 사용될 수있다 (그림 4). 부가 적으로, 이러한 분자에 대한 다양한 억제제 / 약물 치료의 효과는 또한 키나아제로 (조사 할 수 억제제 (10), 글루타민산 염 수용체 작용제 11 quisqualic 산 12).
그림 1. 닭 전뇌에서 microslices의 호흡 체크 다음 뇌 조직 호흡 체크를 산출했다 :. 용액 중의 산소의 몰수를 곱한 (실험의 시작과 끝에서, 산소 전극 판독 값 사이의 차이) 소비 된 산소의 양, 분할 배양 시간으로 (시간)와 단백질의 양 (mg)을 얻었다. 고립 된 포유류의 대뇌 피질의 일반적인 호흡 속도는 보통의 조건 9에서 55 ~ 80 μmol의 O 2 / g 신선한 중량 / 인사 사이. N = 9.
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.. 그림 2 닭 전뇌에서 microslices에 아데닌 뉴클레오티드의 존재 ATP를 측정하는 대표적인 HPLC 추적 :로 수행 ADP 비율이 이전 13 설명했다. ATP의 수준과 ADP의 증가 수준이 세포 사멸 및 괴사 전지 (14)에 대한 특징적인 감소하는 반면 높은 ATP와 ADP 낮은 수준은 일반적으로 가능한 세포에서 발견된다. 일반적인 ATP : microslices의 ADP 비율은 3시 1분부터 6시 1분까지 변화,보다 큰 2 시간 동안이 수준을 유지했다.
그림 3. 조직 K + 미숙 한 닭 전뇌에서 뇌 microslices의 내용. 조직 칼륨의 결정은 우리입니다생존의 eful 측정, 같은 조직의 화학 및 생리 활성의 대부분은 정상적인 세포 내 칼륨 함량 8가 필요 막 잠재력에 따라 달라집니다. microslices 즉시 자르고 후 K + 프리 버퍼에 세척 할 경우, 조직 K +는 단지 배경 (시간 0) 상회했다 수준으로 고갈되었다. 그러나, 크렙스 완충액 후속 배양에 microslices 급속 주변 매질에서 K +를 축적하고, 5 분 이내에 그들은 미처리 microslices 대한 것과 유사 정상 상태의 레벨 (즉 microslices 세척하고 정상 완충액)에 도달했다. 20 분 배양 후 ouabain (0.2 ㎜)와 EGTA (2 ㎜)의 추가는 조직의 K + 함량이 8 분에서 0으로 감소하는 원인이되었다. 이 microslices 일반적으로 적극적으로 K + 펌프 것을 보여줍니다, 그리고 조직 K + 농도가 죽은 조직이나 틈새 공간에 갇혀 K +에 의한되지 않습니다. N = 4.
그림 4.의 KCl과 탈분극 다음 GluN2B 및 GluA1 인산화의 시간 코스. Microslices은 수컷 쥐의 선조체 (striatum)와 감각 피질에서 생성 된 (N = 8), 높은 K + 균질화 크렙스 버퍼를 사용하여 감극하고, (A) GluN2B에 대한 검사 인산화 (Ser1303에서) 여러 번 후 자극 (0-300 초) 웨스턴 블로 팅에 의해 (B) GluA1 인산화 (Ser845에서). 인산화 수준은 총 GluN2B 및 GluA1 표현 (즉, 인산화 / 전체 표현)로 표준화되어 있습니다. * 뇌 영역 (p <0.05) 간의 통계적 유의성을 나타낸다. 의 KCl과 탈분극은 S1303에서 GluN2B 및 GluA1 수용체의 인산화 결과와각각 S845,. S845에서 GluA1 인산화의 비율이 피질과 선조체 (striatum)에서 동일 하였다 반면 S1303에서 GluN2B 인산화의 비율은, 피질과 선조체 (striatum) 사이에서 변화. 이후의 실험에서, 우리는이 다기능 키나제의 규제를 차등에 의한 것으로 나타났습니다, 칼슘 / 단백질 S1303에서 GluN2B을 인산화 키나제 II (CaMKII을),하지만, S845 10에서하지 GluA1을 칼 모듈 린 자극. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
여기서, 본래 성숙한 뇌 조직에서 흥분 독성 및 허혈 - 매개 세포 사멸에 관여하는 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용될 수 microslices의 생성을위한 시험 관내 기술이 설명된다. 이 기술은 실행 가능한 조직 (1-3 피규어), 즉 큰의 Organotypic 조각 15 대사와 유사하다을 생산하고 있습니다. 또한,이 microslice 모델은 밀접하게 생체 내 10 흥분 독성 매개 뇌 손상 다음과 같은 관찰 된 응답에 해당합니다. AMPA, NMDA 또는 글루타민산 염과 뇌 microslices의 생체 자극에 90 번째는 생체 내 10에있는 폐쇄 90초 기간으로 분자의 다양한 동일한 응답 (예를 들어, CaMKII을, GluN2B 및 GluA1)를 유도한다. 이는 본원에 기재된 microslice 모델 허혈 및 흥분 독성에 관여하는 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용될 수있는 유효한 방법이라고 추가 검증을 제공한다세포 죽음을 ITY 매개.
어떤 실험 기법과 마찬가지로,이 절차는 변화 될 수 있으며, 이러한 변형이나 실험 결과에 영향을 미치지 않을 수있다. 경험에 근거하여, 본 명세서에서 설명 된 프로토콜은 높은 수율과 티슈 microslice 생존력을 생성하기위한 최적의 조건을 나타낸다. 이 프로토콜은 종 (래트, 마우스 및 닭에서 microslices 이전에 성공적으로 생성되었다)의 다양한 사용을 위해 적응 될 수 있으며, 임의의 뇌 영역에서 (도 1-3 전체 전뇌 유래 microslices 묘사,도 4는 유도 microslices를 도시 피질과 선조체 (striatum)에서). 또한 microslice 두께는 슬라이스의 생존에 어떠한 상당한 손실없이, 150 ~ 350 μM에서 변경 될 수있다. 이것은 더 큰 슬라이스보다 조직의 높은 수율,보다 재현성 샘플링을 생산으로서 최적 슬라이스 두께는 250 μM이다. 에 의해 생성 된 뇌 조직의 통계적 샘플링microslices의 분취 량 조각을 제조 하였다있는 조직을 대표 할 필요가있다. 이를 위해, 우리는 조직의 대표적인 샘플링을 위해 분취 량 당 최소 크기의 슬라이스를 사용할 필요가있다. 이를위한 최적의 조건은 250 μm의 두께로 발견하고,에 ~ 15 ~ 20 조각 / 나누어지는 해당 조직의 단백질, 1 MG했다. microslices 다진 세척되어야하는 온도는 생성 microslices의 호흡 속도를 비교하여 4 ℃로 냉각하지 않고 조사 하였다 조직이 4 ° C에 배치되는 경우 산증과 산소 결핍의 효과가 감소 될 수 있지만, 미세 소관 재 조립 조직이 냉각 된 경우 변경 후 16 재탕을 할 수 있습니다. 세포 골격이 재구성은 온난 한 후 일정 기간 동안 세포의 기능 활동에 영향을 미칠 수 있습니다. 냉각 조각에 비해 Noncooled microslices 더 높은 생존 능력 및 호흡 수있다. 또한, 세 세척은 (3.1-3.3 단계) 충분한,이다cient은 파편의 대부분을 제거 할 수 있습니다. 버퍼의주기적인 변화와 평형 기간 (단계 3.4) microslices 베고에서 '복구'할 수 있으며 (예 : 칼슘 축적 등) 다양한 기능 분석의 재현성을 향상시킵니다.
상기 방법은 다양한 자극 다음 영향을 조사하는 것이 적합하며, 약물 / 억제제로 치료 다음. 막 투과 마약 / 억제제는이 기술과 웨스턴 블롯 (또는 이와 유사한 것)을 통해 검출 할 수있는 분자를 조사 할 수 있습니다 통해 검사 할 수있는 잠재력을 가지고 있습니다.
요약하면, 흥분 독성 및 허혈 - 매개 세포 사멸에 관여 폭포 신호의 조작은 치기 다음 신경 세포의 죽음을 제한하는 약물의 개발을위한 매력적인 방법을 제공합니다. 설명 microslice 방법은 그대로 성숙한 뇌에서 이러한 신호 폭포의 조사를 허용 쉽게 적용 할 수있는 모델입니다조직. 이 기술은 스트로크 다음 신경 세포 사멸을 제한하는 새로운 치료법을 식별하는 데 사용될 수있다.
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Disclosures
저자는이 논문에서 수행 된 작업의에 대한 관심의 충돌이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 호주 국립 보건 의학 연구위원회, 헌터 의학 연구소, 뉴캐슬 대학에서 연구 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guillotine | Used to decapitate animal | ||
| Surgical equipment | Forceps, scissors, tweezers, etc., for brain removal and dissection | ||
| McIlwain chopper | McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella. | Used to generate 100-400 µm brain sections. | |
| Round bottom plastic tubes | Greiner | ||
| Water bath | For keeping tissue at 37 °C | ||
| Humidifier/aerating apparatus | Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment | ||
| Flat bottomed polystyrene tubes | Nunc | ||
| Dounce Homogenizer |
References
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