Summary
Nós desenvolvemos um modelo de fatia de cérebro que podem ser utilizados para examinar os mecanismos moleculares envolvidos na lesão cerebral mediada por excitotoxicidade. Esta técnica gera tecido cerebral maduro viável e reduz o número de animais necessários para a experimentação, mantendo o circuito neuronal, interações celulares e compartimentos pós-sinápticos em parte intacta.
Abstract
Examinando os mecanismos moleculares envolvidos em condições neuropatológicas, tais como acidente vascular cerebral isquêmico, pode ser difícil quando se utiliza sistemas animais inteiros. Como são comumente utilizados 'neuronal-como' sistemas de cultura de células, tais, primária ou. Enquanto que estes sistemas são relativamente fáceis de trabalhar, e são úteis em sistemas modelo que vários resultados funcionais (tais como a morte celular) pode ser facilmente quantificados, os resultados analisados e vias em neurónios imaturos em cultura (tais como as vias de morte celular mediada por excitotoxicity) não são necessariamente as mesmas que as observadas no cérebro maduro, ou em tecidos intactos. Portanto, existe a necessidade de desenvolver modelos em que os mecanismos celulares de tecido neural maduro podem ser examinados. Desenvolvemos uma técnica in vitro, que pode ser usado para investigar uma variedade de vias moleculares no tecido nervoso intacto. A técnica aqui descrita utiliza tecido cortical de rato, mas esta técnica pode ser adaptado para o uso de tecidoa partir de uma variedade de espécies (tais como o rato, coelho, cobaia, e galinha) ou regiões do cérebro (por exemplo, hipocampo, estriado, etc.) Além disso, uma variedade de estimulações / tratamentos podem ser utilizados (por exemplo, excitotóxica, a administração de inibidores, etc.) Em conclusão, o modelo de fatia cerebral aqui descrito pode ser usado para examinar uma variedade de mecanismos moleculares envolvidos na lesão cerebral mediada por excitotoxicidade.
Introduction
A forma mais comum de AVC é acidente vascular cerebral isquêmico, que ocorre quando um vaso sanguíneo cerebral torna-se obstruída. A isquemia do tecido que resulta da cessação do fluxo sanguíneo provoca a despolarização das membranas generalizada, a libertação de neurotransmissores excitatórios, e a elevação sustentada do cálcio intracelular, que conduz à activação de vias de morte celular 1. Este processo tem sido denominado "excitotoxicidade", e é uma via comum envolvido na morte neuronal produzido por uma variedade de patologias, incluindo acidente vascular cerebral 2. A inibição das vias de sinalização envolvidas na excitotoxicidade e outras cascatas de morte celular neuronal é uma abordagem atraente para limitar os danos neuronal após o AVC.
Identificar os mecanismos moleculares precisos envolvidos na excitotoxicidade e acidente vascular cerebral isquêmico pode ser difícil quando se utiliza sistemas animais inteiros. Como, embrionário primário, e 'neuronal-like' (por exemplo, neuroblastoma e adenocarcinoma linhas imortalizados) sistemas de cultura de células são usadas frequentemente. As principais vantagens destes modelos é que eles são fáceis de manipular, relativamente eficaz em termos de custos, e a morte celular pode ser facilmente medido e quantificado. No entanto, as vias de sinalização pode ser alterada por condições de cultura utilizadas de 3,4, e os neurónios imaturos e imortalizado linhas podem expressar diferentes receptores e moléculas de sinalização, quando comparado a amadurecer cérebro 5-8. Além disso, os neurónios cultivados apenas permitir o exame de um tipo de célula (ou dois, se um sistema de co-cultura é utilizado), enquanto que o tecido cerebral intacto é heterogénea, contendo uma variedade de tipos de células que interagem uns com os outros. Sistemas de cultura de explantes (organotípicas de fatias finas de tecido de cérebro), também são utilizados, e estes modelos permite que o estudo de populações heterogéneas de células à medida que são encontrados in vivo. No entanto, apenas uma quantidade limitada de tecido pode ser obtida a partir de cada animal, ao utilizar esta técnica, as fatias podenão ser cultivados durante o tempo que as linhas de células imortalizadas, e meio de cultura de longo prazo pode resultar em alterações nas vias de sinalização e receptores nas fatias. Embora cérebro maduro pode ser usado para gerar fatias organotípicas, fatias de cérebro imaturo são mais propícios para a cultura, e são mais vulgarmente utilizados. Existe, portanto, a necessidade de se desenvolver modelos que imitam ou representam cérebro intacta madura, que são fáceis de usar, em que as vias de sinalização neuronal pode ser examinada.
Nisto, uma técnica in vitro, que envolve o tecido nervoso intacto, que pode ser utilizado para elucidar os mecanismos moleculares envolvidos na morte celular na sequência de um insulto excitotóxico ou isquémico é descrito. Esta técnica reduz o número de animais necessários para realizar uma experiência, é reprodutível, e gera tecido viável que se comporta de uma forma semelhante à metabolicamente fatias organotípicas maiores. Além disso, o circuito neuronal, as interacções celulares, e co pós-sinápticampartment permanece parcialmente intacta. O tampão fisiológico utilizado permite que os membranas celulares para 'lacrar novamente', e permite que as células para recuperar sua resistência da membrana 9 original. Este modelo de fatia de cérebro é capaz de imitar fielmente as respostas observadas a seguir excitotoxicity mediada lesões cerebrais 10, e pode ser usado para examinar os mecanismos moleculares envolvidos no acidente vascular cerebral.
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Protocol
Todos os procedimentos são realizados com a aprovação da Universidade de Newcastle Animal Care e do Comitê de Ética, bem como de acordo com as diretrizes e regulamentos pertinentes, incluindo a Lei de NSW Pesquisa Animal, o regulamento Animal Research NSW, e do Código australiano de Prática para a cuidado e uso de animais para fins científicos.
1. Dissecção do Tecido Cerebral
- Sacrifício ratos machos 12 semanas de idade por decapitação. Os ratos podem ser sacrificados por atordoamento e decapitação, ou pode ser primeiro anestesiados com isoflurano (5% de indução, manutenção de 1,5-2%) com 70% de N2 e 30% de O 2, e em seguida decapitados.
- Remover o cérebro do crânio, tão rapidamente quanto possível (de preferência, este deve ser realizado em menos de 2 min).
- Retire o córtex por dissecção à mão livre. A dissecção deve ser realizada no mínimo tempo possível, com o mínimo de danos no cérebro quanto possível, de modo a maintain a integridade das fatias.
- A fim de remover qualquer resíduo de pele, pele, sangue, etc, imergir o cérebro de uma pequena quantidade (3-5 mL) de 37 ° C de Krebs-tampão (118 mM cloreto de sódio, cloreto de potássio 4,7 mM, cloreto de cálcio 1,3 mM, 1,2 mM de dihidrogenofosfato de potássio, sulfato de magnésio 1,2 mM, carbonato de hidrogénio de sódio 25 mM, glicose 11,7 mM, ácido etilenodiaminotetracético dissódico 0,03 (EDTA), equilibrado com 95% de oxigénio / 5% de dióxido de carbono (carbogénio), pH 7,4).
2. Preparação de Microslices
- Coloque o cérebro no palco de um triturador de Mcllwain em que dois pedaços de papel de filtro foram colocados e humedecido com tampão de Krebs quente. Mantenha o cérebro eo papel de filtro umedecido com tampão Krebs quente, mas não tão molhada que há líquido livre na superfície do papel, que pode causar o cérebro a deslizar.
- Fatie o cérebro em 250 um cortes coronais. Como nutrientes, oxigênio, e resíduos ªa são normalmente trocados com o fornecimento de sangue são trocados com um fluido que rodeia o tecido em tecido neural isolado, o tamanho das fatias não deve ser mais do que 400 um de espessura para permitir a oxigenação e troca de nutrientes adequadas para ocorrer.
- Vire o palco McIlwain 90 °.
- Fatie cérebros em 250 mM fatias sagital. Aqui, estas secções do cérebro (250 um x 250 fim fatias de comprimento variável em função da espessura do tecido) são referidos como microslices.
- Coloque as microslices para um tubo de fundo redondo com 37 ml de 10-15 ° C de tampão de Krebs (a quantidade de tampão de Krebs utilizada vai depender da quantidade de tecido).
3. A equilibração do Microslices
- Agite suavemente até microslices individuais são suspensas, e, em seguida, permitir-lhes que se contentar com a gravidade.
- Remover o sobrenadante cuidadosamente, que irá ser turvo, devido aos restos de células em suspensão, e adicionar 10 ml fresco 37 ° CKrebs tampão para o tubo.
- Repetir este processo de lavagem, quatro vezes, o que vai resultar na remoção da maioria dos detritos.
- Seguindo este, equilibrar as microslices a 37 ° C com agitação suave / inversão, e mudar o tampão de Krebs a cada 15 min durante 1 hora no total.
- Neste momento, adicionar 2 ml de tampão de 37 ° C de Krebs fresca, e transferir 15-20 microslices (150 ul de suspensão MicroSlice) ao poliestireno de fundo plano, utilizando tubos de 5 ml de um furo ponteira extra largo com arestas suavizadas (que pode ser criada por corte ~ 2 mm da extremidade da ponta de um P1000). Espalhe os microslices uniformemente sobre a base do tubo, em uma única camada, de modo que cada MicroSlice não é mais do que alguns milímetros da atmosfera oxigenada.
4. Estimulação excitotóxico
- Incubar as microslices a 37 ° C, e passam continuamente CARBOGEN sobre a superfície da suspensão de 150 ul MicroSlice, utilizando uma linha de gás que é a posiçãoed apenas acima da superfície da suspensão MicroSlice (para evitar ruptura mecânica).
- Tratar microslices quer com 150 ul de 5 mM de glutamato + 100 mM de glicina no tampão de Krebs (estímulo excitotóxico: concentração final 2,5 mM de glutamato + 50 pM de glicina) ou 150 ul de tampão de Krebs sozinho (controlo não estimulados). Uma variedade de estímulos pode ser utilizado neste passo (incluindo, mas não limitado a, de AMPA, de NMDA + glicina, KCl despolarização, e privação de oxigénio / glucose).
- Remover a solução de incubação a vários tempos pós-estimulação (0, 30, 60, 90, 120, e 300 seg), e substituí-la com 300 ul de tampão de homogeneização arrefecido em gelo (30 mM Tris, pH 7,4, 1 mM etilenoglicol ácido tetra-acético, 4 mM de EDTA, 100 ^ M de molibdato de amónio, pirofosfato de sódio a 5 mM, fluoreto de sódio 25 mM, ortovanadato de sódio 1 mM, phenylmethanesulfonylfluoride 1 mM, cocktail inibidor de protease completo).
- Homogeneizar microslices no gelo, usando um copo de Teflon Dounce Homogeneizador(20 ciclos; de 700 rpm).
- Armazenar homogeneizados a -80 ° C, e várias moléculas de sinalização, as moléculas de morte, etc, podem ser medidos por western blot.
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Representative Results
Microslices gerados utilizando este procedimento são viáveis, e uma variedade de espécies (por exemplo, rato, ratinho, galinha e) pode ser usado para produzir microslices. Três medidas independentes de viabilidade foram utilizadas: taxa de respiração (Figura 1), as relações de nucleótidos de adenina (figura 2), e o conteúdo de potássio do tecido (Figura 3). Utilizando estas medidas, foi demonstrado que microslices permanecem viáveis durante pelo menos 2 horas após a geração.
Microslices cerebrais podem ser utilizados para examinar várias moléculas de sinalização, na sequência de uma variedade de estímulos (por exemplo, KCl despolarização [Figura 4], de AMPA, de NMDA, estimulação glutamato 10), e pode também ser usado para comparar as respostas de moléculas sinalizadoras de células entre várias regiões do cérebro (Figura 4). Além disso, o efeito de vários tratamentos inibidores / droga sobre estas moléculas também podem ser examinadas (tal como cinase inibidores 10, agonistas dos receptores de glutamato 11, ácido Quisquálico 12).
Figura 1. Taxas de respiração de microslices de prosencéfalo frango As taxas de respiração do tecido cerebral foram calculados da seguinte forma:. A quantidade de oxigênio consumido (diferença entre as leituras do eletrodo de oxigênio no início e no final do experimento) multiplicado pelos moles de oxigênio em solução, dividido por o tempo de incubação (horas) e da quantidade de proteína (mg). Taxas de respiração típicos de isolado córtex cerebral de mamíferos são entre 55-80 mol O 2 / g peso fresco / h em condições normais 9. n = 9.
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.. Figura 2 Presença de nucleotídeos de adenina em microslices de prosencéfalo frango traço HPLC Representante medição ATP: ADP índices, realizados como descrito anteriormente 13. Alta ATP e baixos níveis de ADP são normalmente encontrados em células viáveis, ao passo que a diminuição dos níveis de ATP e um aumento dos níveis de ADP são característicos de células em apoptose e necrose 14. Típico ATP: ADP rácios de microslices variou 03:01 - 06:01, e foram mantidas a estes níveis durante mais de 2 horas.
Figura 3. Tissue K + conteúdo microslices cerebrais de prosencéfalo frango imaturo. A determinação de potássio é um tecido nosmedida eful de viabilidade, como muitas das atividades fisiológicas e químicas de um tecido são dependentes de potencial de membrana, o que exige um teor de potássio intracelular normal, 9. Quando microslices foram lavados em tampão K +-livre imediatamente após cortar, tecido K + foi esgotada a níveis que eram um pouco acima de fundo (tempo 0). No entanto, a subsequente incubação com tampão de Krebs, os microslices rapidamente K + a partir do meio circundante acumulado, e no prazo de 5 min eles tinham atingido um nível de estado estacionário semelhante ao de microslices não tratadas (isto é, microslices lavados e incubados em tampão normal). A adição de ouabaína (0,2 mM) e EGTA (2 mM) após 20 minutos de incubação do tecido causado K + conteúdo diminua para 0 a cerca de 8 min. Isso demonstra que os microslices normalmente bombear ativamente K +, e que os níveis de tecido + K não são devido a K + preso em tecido morto ou espaços intersticiais. n = 4.
Figura 4. Curso de tempo de GluN2B e GluA1 fosforilação seguinte despolarização com KCl. Microslices foram gerados a partir do striatum e córtex sensitivo de ratos machos (n = 8), usando despolarizada K + elevado de Krebs-tampão, homogeneizou-se, e examinados para (A) GluN2B fosforilação (a Ser1303) e (B) a fosforilação GluA1 (em Ser845) por western blot em vários momentos após a estimulação (0-300 seg). Níveis de fosforilação são normalizados para GluN2B total e expressão GluA1 (isto é, a fosforilação / expressão total). * Denota significância estatística entre as regiões do cérebro (p <0,05). Despolarização com KCl resultou na fosforilação dos receptores e GluN2B GluA1 em S1303 eS845, respectivamente. A taxa de fosforilação de GluN2B S1303 variou entre córtex e no estriado, ao passo que a taxa de GluA1 fosforilação em S845 foi a mesma no córtex e no estriado. Em experimentos posteriores, nós mostramos que isso é devido ao diferencial regulação da quinase multifuncional, cálcio / calmodulina estimulada proteína quinase II (CaMKII), que fosforila GluN2B no S1303, mas não GluA1 no S845 10. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
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Discussion
Nisto, uma técnica in vitro em para a geração de microslices que podem ser utilizados para examinar os mecanismos moleculares envolvidos na excitotoxicidade e morte celular mediada por isquemia em tecido cerebral intacto madura é descrito. Esta técnica produz tecido viável (Figuras 1-3), que é metabolicamente semelhante para maiores fatias organotípicas 15. Além disso, este modelo MicroSlice corresponda à resposta observada após excitotoxicity mediada lesões cerebrais in vivo 10. A 90 segundo em estímulo in vitro de microslices cerebrais com AMPA, NMDA, ou glutamato induz as mesmas respostas em uma variedade de moléculas (por exemplo, CaMKII, GluN2B, e GluA1) como um segundo período de oclusão in vivo 10 90. Isto proporciona ainda a validação de que o modelo MicroSlice aqui descrito é um método válido que pode ser utilizado para investigar os mecanismos moleculares envolvidos na isquemia e excitotoxicidadedade mediada por morte celular.
Tal como acontece com qualquer técnica experimental, este procedimento pode ser variado, e estas variações podem ou não afectar resultado experimental. Com base na experiência, o protocolo aqui detalhado representa as condições óptimas para gerar o maior rendimento de tecido e viabilidade MicroSlice. Este protocolo pode ser adaptado para uso em uma grande variedade de espécies (microslices de ratazanas, ratos e galinhas foram previamente gerado com êxito), e a partir de qualquer região do cérebro (Figuras 1-3 mostram microslices derivados de todo cérebro anterior e a figura 4 representa microslices derivados a partir do córtex e no estriado). Além disso, a espessura pode ser alterada MicroSlice 150-350 mM, sem qualquer perda apreciável na viabilidade das fatias. A espessura de corte ideal é 250 um, pois isso produz a maior produção de tecido, ea amostragem mais reprodutível do que para fatias maiores. A amostragem estatística de tecido cerebral produzido pelaas alíquotas de microslices deve ser representativa do tecido a partir do qual foram preparadas as fatias. Para fazer isso, precisamos usar as menores fatias médias por alíquota para garantir uma amostra representativa do tecido. Foram encontradas as condições ideais para que isso seja 250 espessura mM e 1 mg de proteína do tecido, o que corresponde a ~ 15-20 fatias / alíquota. A temperatura à qual microslices deve ser picado e lavada foi investigada por meio da comparação das taxas de respiração de microslices gerados com e sem arrefecimento até 4 ° C. Embora os efeitos da acidose e anóxia pode ser reduzida quando o tecido é colocada a 4 ° C, de microtúbulos remontagem pode ser alterada, se o tecido é refrigerada e, em seguida, reaquecida 16. Esta reorganização do citoesqueleto podem afetar a atividade funcional das células por algum período após o aquecimento. Microslices Noncooled ter uma maior viabilidade e freqüência respiratória quando comparado com fatias de refrigeração. Além disso, três lavagens (passos 3,1-3,3) são suficiente para remover a maior parte dos detritos. O período de equilíbrio (passo 3.4) com mudanças periódicas no tampão permite que os microslices para "recuperar" a partir de cortar, e melhora a reprodutibilidade em vários ensaios funcionais (como a acumulação de cálcio).
O método é adequado para examinar os efeitos a seguir uma variedade de estímulos, e a seguir ao tratamento com drogas / inibidores. Qualquer droga / inibidor que é permeável tem o potencial para ser examinado por meio desta técnica, bem como qualquer molécula que possa ser detectado através de Western blot (ou semelhante) pode ser investigada.
Em resumo, a manipulação de cascatas de sinalização envolvidos em excitotoxicidade e morte celular mediada por isquemia oferecer uma abordagem atractiva para o desenvolvimento de drogas que limitam a morte de células neuronais após um derrame. O método descrito MicroSlice é um modelo de fácil aplicação que permite a investigação dessas cascatas de sinalização no cérebro maduro intactotecido. Esta técnica pode ser utilizada para ajudar a identificar novos tratamentos que limitam a morte de células neuronais após um derrame.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflito de interesse em relação a qualquer dos trabalhos realizados no âmbito deste manuscrito.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por fundos de pesquisa do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica da Austrália, o Instituto de Pesquisa Médica Hunter, e da Universidade de Newcastle.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guillotine | Used to decapitate animal | ||
| Surgical equipment | Forceps, scissors, tweezers, etc., for brain removal and dissection | ||
| McIlwain chopper | McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella. | Used to generate 100-400 µm brain sections. | |
| Round bottom plastic tubes | Greiner | ||
| Water bath | For keeping tissue at 37 °C | ||
| Humidifier/aerating apparatus | Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment | ||
| Flat bottomed polystyrene tubes | Nunc | ||
| Dounce Homogenizer |
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