Summary
我们已开发了可用于检查涉及兴奋性毒性介导的脑损伤的分子机制的脑切片的模型。这种技术产生可行的成熟的脑组织，并减少所需的实验动物数量，同时保持神经回路，细胞相互作用，和突触后车厢部分完好无损。
Abstract
检查涉及神经病理症状的分子机制，如缺血性中风，可以使用整个动物系统时是困难的。因此，伯或“神经元样”细胞培养系统通常利用。虽然这些系统相对容易的工作，并且是有用的模型系统中各种功能的结果（如细胞死亡）可以很容易量化的研究成果和途径培养未成熟的神经元（如兴奋毒性介导的细胞死亡途径）不一定是相同的成熟大脑观察到，或者在完整的组织。因此，有必要开发模型，其中在成熟的神经组织的细胞机制可以被检查。我们已经开发出一种体外技术，可以用于研究各种在完好的神经组织分子途径。本文描述的技术利用大鼠皮质组织，但该技术可以适用于使用组织从多种物种（如小鼠，兔，豚鼠，鸡）或脑区域（例如，海马，纹状体， 等等 ）。此外，各种刺激/治疗方法可以被使用（例如，兴奋毒性，抑制剂的施用等 ）。总之，本文所述的脑切片模型可用于研究多种参与兴奋性毒性介导的脑损伤的分子机制。
Introduction
中风的最常见的形式是缺血性中风，当脑血管变得闭塞而发生。该组织缺血导致从停止血流引起膜的去极化普遍，兴奋性神经递质的释放，细胞内钙，从而导致细胞死亡的活性的持续升高的途径1。这个过程已经被称为“兴奋性中毒”，并且是参与神经元死亡的一个常见的途径由多种病症，包括中风2制备。参与兴奋性毒性及其他神经细胞死亡的级联信号通路的抑制是一个有吸引力的方式来限制中风后神经元损伤。
确定在兴奋性毒性和缺血性中风的确切分子机制可以用整体动物系统时会很困难。因此，初级胚胎和“神经元样”（ 例如 neuroblasto毫安和腺癌永生化线）细胞培养系统经常被使用。这些模型的主要优点是它们易于操作的，相对低成本，和细胞死亡可容易地测量和定量。然而，信号通路可以通过使用3,4的培养条件，以及未成熟的神经元改变和永生线可以表达不同的受体和较成熟的大脑5-8信号分子。此外，培养的神经元只允许一个小区类型的检测（或2，如果一个共存系统使用的），而完整的脑组织是异质的，含有多种与彼此交互的细胞类型。器官切片培养系统（薄植脑组织）也被使用，并且这些模型使细胞的异质群体的研究，因为他们被发现在体内 。但是，可以从每个动物使用这种技术时获得的组织只有数量有限，切片可未进行培养，只要永生化细胞系，并且介质给长期培养可导致改变的信号转导途径和受体的切片。尽管成熟的大脑可以被用来生成器官切片，从不成熟的脑切片更适于培养，而且更普遍使用。因此，有必要开发一种模仿或代表完整成熟的大脑，是易于使用，其中神经信号传导通路可以检查模型。
本文中， 在体外 ，涉及可用于阐明参与细胞死亡的分子机制下列的兴奋毒性或缺血性损伤完好的神经组织的技术进行说明。这种技术减少了要执行的实验所需的动物数量，是可重现的，并产生其行为在代谢上类似的方式来放大器官切片活组织。此外，神经回路，细胞相互作用，和突触后共同mpartment部分仍然完好。用生理缓冲使细胞膜“重新封装”，并且使细胞恢复其原来的膜电阻9。这种脑片模型能够忠实地模仿观察到下列介导的兴奋性毒性脑损伤10的反应，并且可以用来检查涉及中风的分子机制。
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Protocol
所有的程序都来自纽卡斯尔大学动物护理和伦理委员会，并按照相关指引及法规，包括新南威尔士州动物研究法，新南威尔士州动物研究法规和实务的澳大利亚守则进行审批保养和科学用途的动物。
1。脑组织解剖
- 断头牺牲12周岁雄性大鼠。老鼠可以是由惊人的和断头处死，或者可以先异氟醚麻醉（5％感应，1.5-2％维护）在70％的N 2和30％O 2，然后斩首。
- 从头骨尽可能迅速取出大脑（理想情况下，这应该是在不到2分钟执行）。
- 通过徒手剥离取出皮层。解剖应在尽可能短的时间来执行，用尽可能少的伤害到大脑尽可能以迈ntain切片的完整性。
- 为了除去任何残余的皮肤，皮毛，血液等 ，浸入大脑中的37℃的Krebs缓冲液（118 mM的氯化钠，4.7 mM的氯化钾，1.3 mM的氯化钙少量（3-5毫升）中， 1.2mM的磷酸二氢钾，1.2mM的硫酸镁，25mM的碳酸氢钠，11.7毫摩尔葡萄糖，0.03 mM的乙二胺四乙酸二钠（EDTA），用95％氧/ 5％二氧化碳（卡波金），pH 7.4）中。
2。 Microslices的制备
- 将大脑的McIlwain斩波器上的滤纸两片已放置和蘸有温暖的克雷布斯缓冲阶段。保持大脑和蘸有温暖的Krebs缓冲液的滤纸上，但没有那么湿，有可能会导致大脑左右滑动的纸张的表面上的游离液体。
- 切片脑入250微米的冠状切片。作为营养物质，氧气和废料次在通常的血液供给交换用的流体围绕所述组织中分离的神经组织交换，切片的尺寸应不超过400微米的厚度，以便有足够的氧合和物质交换发生。
- 转动McIlwain阶段90°。
- 大脑切片成250微米的矢状切片。本文中，这些脑切片（250微米×250微米的切片长度可变的取决于组织的厚度）被称为microslices。
- 将microslices进入圆底管10-15毫升37℃的Krebs缓冲液（所用Krebs缓冲液的量将取决于组织的量）。
3。 Microslices的平衡
- 轻轻搅拌直至个人microslices暂停，然后让它们在重力作用下沉降。
- 小心取出上清液，这将是阴天，由于悬浮细胞碎片，并加入10 ml新鲜的37℃Krebs缓冲液的试管中。
- 重复此洗涤步骤4次，这将导致在去除大部分碎片的。
- 在此之后，平衡的microslices在37℃轻轻摇动/反转，并更改Krebs缓冲液，每15分钟1小时总共。
- 这时，加入2ml新鲜的37℃Krebs缓冲液，并转移15-20 microslices（150微升microslice暂停），以平底聚苯乙烯使用一个额外的大口径枪头平滑边缘（这可以通过创建5毫升管切〜2 mm从P1000的尖底）。均匀分布的microslices在管中的单个层的基极，以使每个microslice不进一步比从含氧气氛几毫米。
4。兴奋刺激
- 孵育microslices在37℃，并不断通过CARBOGEN在150微升microslice悬浮液的表面上，用气相线即位置编只是microslice悬挂（避免机械破碎）的表面之上。
- 治疗microslices与任何150微升5毫米谷氨酸+100μM甘氨酸在Krebs缓冲液（兴奋性刺激：终浓度为2.5 mM的谷氨酸+50μM甘氨酸）或150微升克雷布斯单独缓冲液（控制非刺激）。各种刺激可以用在该步骤中（包括，但不限于，AMPA，NMDA +甘氨酸，氯化钾去极化，和氧/葡萄糖剥夺）。
- 取出培养溶液在不同时间刺激后（0，30，60，90，120，和300秒），并将其与300微升冰冷的匀浆缓冲液（30毫摩尔Tris，pH值7.4，1mM的乙二醇代替四乙酸，4毫摩尔EDTA，100μM钼酸铵，5毫焦磷酸钠，25mM的氟化钠，1mM的原钒酸钠，1mM的phenylmethanesulfonylfluoride，完全蛋白酶抑制剂混合物）。
- 均质microslices在冰上，用的是玻璃 - 聚四氟乙烯Dounce匀浆（20杆; 700转）。
- 店铺匀浆在-80℃下，各种信号转导分子，死亡分子等可以通过蛋白印迹分析来测定。
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Representative Results
使用此过程产生Microslices是可行的，并有多种物种（例如大鼠，小鼠和鸡），可用于产生microslices。已被利用的可行性的三个独立的措施：呼吸速率（ 图1），腺嘌呤核苷酸的比例（ 图2），和组织的钾含量（ 图3）。采用这些措施，它已经证明，microslices保持活力至少2小时后生成。
脑microslices可以用来检查各种信号转导分子，下列各种刺激（ 例如氯化钾去极化[ 图4]，AMPA，NMDA受体，谷氨酸盐刺激10），并且还可以用于比较多个脑区域之间的细胞信号转导分子的反应（ 图4）。此外，对这些分子的各种抑制剂/药物治疗的效果也可以检查（如激酶抑制剂10，谷氨酸受体激动剂11，使君子氨酸12）。
图1。从鸡脑microslices的呼吸速率 ，计算脑组织的呼吸速率如下：氧气的消耗在溶液乘以氧的摩尔数（在实验开始和结束时的氧电极的读数之间的差）的量，分通过温育时间（小时）和量的蛋白质（毫克）。分离的哺乳动物大脑皮层的典型呼吸速率是55-80微摩尔O 2 / g鲜重/小时之间一般条件9下。 N = 9。
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。图2在鸡脑microslices腺嘌呤核苷酸的存在代表高效液相色谱法跟踪测量的ATP：ADP比值，作为执行先前所述13。高ATP和ADP的低水平通常在活细胞中发现的，而降低的ATP水平和ADP水平的提高是特征为凋亡和坏死细胞14。典型的ATP：microslices的ADP比值3:1 6:1之间变化，并保持在这些水平大于2小时。
图3。组织K +从不成熟鸡前脑脑microslices的内容。组织中钾的测定是我们生存能力eful措施，因为许多组织的化学和生理活性都依赖于膜电位，这需要一个正常细胞内钾含量9。当microslices被切碎后立即洗K +无缓冲，组织K +被耗尽到这只是上述背景（时间为0）的水平。然而，在随后的孵育用Krebs缓冲液中，microslices迅速积累K +从周围介质中，并在5分钟内已达到相类似的稳态水平为未处理microslices（ 即 microslices洗涤和温育在正常缓冲液）。加哇巴因（0.2毫米）和EGTA（2毫米）经过20分钟的潜伏期引起组织K +含量下降到0在8分钟内。这表明microslices通常积极地泵送K +，和该组织的 K +水平不因K +被困在死组织或间隙空间。 N = 4。
图4。是从雄性大鼠的纹状体和感觉皮层所产生的GluN2B和GluA1以下的磷酸化与去极化氯化钾时间当然 Microslices（N = 8），去极化采用高K + Krebs缓冲液，匀浆，并检查（ 一 ）GluN2B磷酸化作用（在Ser1303）和在不同时间刺激后（0-300秒）（B）GluA1磷酸化作用（在Ser845）通过Western印迹。磷酸化水平进行归一化至总GluN2B和GluA1表达（ 即磷酸化/总表达）。 *表示脑区（P <0.05）之间的统计显着性。去极化与氯化钾导致磷酸化GluN2B和GluA1受体在S1303和S845，分别。 GluN2B磷酸化在S1303中的速度皮层和纹状体之间变化，而GluA1磷酸化在S845的速度在皮层和纹状体相同。在随后的实验中，我们已经证明，这是由于不同的多功能蛋白激酶的调节，钙/钙调素刺激蛋白激酶II（CaMKII的），其中磷酸化GluN2B在S1303中，但不GluA1在S845 10。 点击这里查看大图。
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Discussion
本文中， 体外技术microslices可用于检查涉及兴奋性中毒和缺血介导的细胞死亡在完整成熟的脑组织的分子机制的生成进行说明。该技术生产的活组织（ 图1-3），即代谢类似于较大的器官切片15。此外，这种microslice模式紧密对应观察下面的体内 10介导的兴奋性毒性脑损伤的反应。 90秒脑 microslices与AMPA，NMDA或谷氨酸体外刺激诱 导多种分子的相同反应（ 如 CaMKII的，GluN2B和GluA1）闭塞在体内 10 90第2期。这提供了进一步的验证，本文描述的microslice模型是可用于研究参与缺血和兴奋毒性的分子机制的有效方法性介导的细胞死亡。
正如任何实验技术，此过程可被改变，并且这些变化可能会或可能不会影响的实验结果。根据经验，本文中详述的方案表示用于产生最高的组织产量和microslice生存能力的最佳条件。这个协议可以在多种物种（先前已成功地产生从大鼠，小鼠和鸡microslices）的适于使用，并且从任何脑部区域（ 图1-3描绘了从全前脑源性microslices; 图4描绘了来自microslices从皮层和纹状体）。此外，microslice厚度可从150-350微米的改变，而不在切片的可行性任何明显的损失。最佳的切片厚度为250微米，因为这产生最高产量的组织，更可重复的采样比为较大的切片。所产生的脑组织的统计抽样microslices的等分试样必须是代表从该切片制备的组织。要做到这一点，我们需要使用每等分的最小尺寸的切片，以确保组织的代表性抽样。此最佳条件下被认为是250微米厚，和1毫克组织蛋白，其对应于〜15-20片/等分试样。在该microslices应切碎并洗涤的温度，通过比较所产生microslices的呼吸速率和不带冷却至4℃。调查虽然当组织被放置在4℃下可减少酸中毒和缺氧的作用，微管的组装可能，如果组织是冷冻被改变，然后再加热16。细胞骨架的重组这可能会影响升温后的细胞一段时期的功能活性。时相比，冷却切片Noncooled microslices具有更高的存活率和呼吸速率。此外，洗三次（步骤3.1-3.3）是suffi古除去大部分碎片。用在缓冲液中的周期性变化的平衡期（步骤3.4）允许microslices从斩波“恢复”，并在各种功能测定法（例如钙累积）提高了重现性。
该方法适用于检查下列各种刺激的影响，并与下列药物/抑制剂治疗。任何药物/抑制剂，是膜通透性具有通过这种技术，并且可以通过免疫印迹（或类似）被检测到的任何分子可以调查要被检查的潜力。
综上所述，信令参与兴奋性毒性和缺血介导的细胞死亡级联的操作提供的药物，限制神经细胞死亡中风后发展的一个有吸引力的方法。所描述的microslice方法是一个很容易适用的模型，它允许在完整成熟的脑这些信号通路的研究组织。这种技术可以被用于帮助确定新的治疗方法，限制神经元细胞死亡以下行程。
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Disclosures
作者宣称，他们有兴趣就任何本手稿中开展的工作没有冲突。
Acknowledgments
这项工作是由国家健康和医学研究委员会澳大利亚，猎人医学研究所，以及纽卡斯尔大学支持的研究经费。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guillotine | Used to decapitate animal | ||
| Surgical equipment | Forceps, scissors, tweezers, etc., for brain removal and dissection | ||
| McIlwain chopper | McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella. | Used to generate 100-400 µm brain sections. | |
| Round bottom plastic tubes | Greiner | ||
| Water bath | For keeping tissue at 37 °C | ||
| Humidifier/aerating apparatus | Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment | ||
| Flat bottomed polystyrene tubes | Nunc | ||
| Dounce Homogenizer |
References
- Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. Mechanisms, challenges and opportunities in stroke. Nat. Rev. Neurosci. 4, 399-415 (2003).
- Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death. Apoptosis. 15, 1382-1402 (2010).
- Vogt Weisenhorn, D. M., Roback, L. J., Kwon, J. H., Wainer, B. H. Coupling of cAMP/PKA and MAPK signaling in neuronal cells is dependent on developmental stage. Exp. Neurol. 169 (1), 44-55 (2001).
- Kharlamov, E., Cagnoli, C. M., Atabay, C., Ikonomovic, S., Grayson, D. R., Manev, H. Opposite effect of protein synthesis inhibitors on potassium deficiency-induced apoptotic cell death in immature and mature neuronal cultures. J. Neurochem. 65 (3), 1395-1398 (1995).
- Kristensen, B. W., Noraberg, J. Comparison of excitotoxic profiles of ATPA, AMPA, KA and NMDA in organotypic hippocampal slice cultures. Brain Res. 917 (1), 21-44 (2001).
- Lecrux, C., et al. Spontaneously hypertensive rats are highly vulnerable to AMPA-induced brain lesions. Stroke. 38, 3007-3015 (2007).
- Sattler, R., Charlton, M. P., Hafner, M., Tymianski, M. Distinct influx pathways, not calcium load, determine neuronal vulnerability to calcium neurotoxicity. J. Neurochem. 71, 2349-2364 (1998).
- Morrison, B. 3rd, Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. In vitro central nervous system models of mechanically induced trauma: a review. J. Neurotrauma. 15, 911-928 (1998).
- McIlwain, H.
- Skelding, K. A., Spratt, N. J., Fluechter, L., Dickson, P. W., Rostas, J. A. alpha CaMKII is differentially regulated in brain regions that exhibit differing sensitivities to ischemia and excitotoxicity. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (12), 2181-2192 (2012).
- Kavanagh, J. M., Dodd, P. R., Rostas, J. A. 3H]MK-801 binding in immature and mature chicken forebrain. Neurosci. Lett. 134 (1), 83-87 (1991).
- Kavanagh, J. M., Bunn, S. J., Boyd, T. L., Rostas, J. A. Developmental changes in glutamate receptor stimulated inositol phospholipid metabolism and 45Ca(2+)-accumulation in posthatch chicken forebrain. Neurosci. Lett. 194 (3), 161-164 (1995).
- Sharps, E. S., McCarl, R. L. A high performance liquid chromatographic method to measure 32P incorporation into phosphorylated metabolites in cultured cells. Anal. Biochem. 124, 421-424 (1982).
- Bradbury, D. A., Simmons, T. D., Slater, K. J., Crouch, S. P. M. Measurment of the ADP:ATP ratio in human leukaemic cell lines can be used as an indicator of cell viability, necrosis and apoptosis. J. Immunol. Methods. 240 (1-2), 1-2 (2000).
- Rodnight, R., McIlwain, H. Techniques in tissue metabolism: 3. Study of tissue fragments with little or no added aqueous phase, and in oils. Biochem. J. 57, 649-661 (1954).
- Shelanski, M. L., Gaskin, F., Cantor, C. R. Microtubule assembly in the absence of added nucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70 (3), 765-768 (1973).
